植物超氧阴离子自由基含量的测定LT

植物超氧阴离子自由基含量的测定

一、实验目的

了解实验原理，掌握实验技术

二、实验原理

超氧阴离子（O⎺∙

2）能与羟胺反应生成NO3-，反应式为：

NH2OH+2O⎺∙

2+H+ = NO2-+H2O2+H2O

其中NO2-进一步反应生成对氨基磺酸、反应后再生成α-苯胺，最后生成红色的偶氮化合物。其中，偶氮化合物在520nm到560nm下有吸收峰，本次实验在530nm下进行比色。

三、实验材料与仪器

植物材料

小麦叶片，荠菜叶片

试剂

NaNO2- AR 100μl；蒸馏水；对氨基酸苯磺酸；α-苯酸；PBS；盐酸羟胺；对氨基苯磺酸；α-苯胺。

仪器

可见光分光光度计，型号V-1100D

四、实验方法

1.标准曲线

1 2 3 4 5 6 7

NO2-标准液（50μg/ml）0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0

蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0

对氨基酸苯磺酸 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

α-苯酸 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0然后置于30o C培养箱中保温30min显色反应测定A530，以NO2-为横坐标，A530值为纵坐标，绘制标准曲线。

2. O⎺∙

2的提取

小麦叶片称取1.0g。加入少量PH7.8的PBS研磨。之后定容到5ml。10000rpm 45o C离心

10min。之后取上清液备用。

注：空白对照直接用上清液显色测本底值NO2-含量。

3.组织中O⎺∙

2测定

（1）NO2-的产生

O⎺∙

2

PBS 盐酸羟胺标样 2.0 1.5 0.5

调零 2.0 2.0 0

之后置于25o C保温20min

（2）NO2-显色，调标准线

上述反应液对氨基苯磺酸α-苯胺标样 2.0 2.0 2.0

调零 2.0 2.0 2.0 30o C恒温箱中保温30min

4.O⎺∙

2含量计算

从标准曲线中计算出测定液相对应的NO2-浓度，并换算成超氧阴离子的浓度（X），再算出超氧

阴离子的含量。

O⎺∙

2含量（μg·g-1FW）=2·X·Vt·n/gFW·Vs

注：Vt为样品提取液总体积；n为稀释倍数；Vs为显色时提取液体积；X为从标准曲线上计算出的NO2-的浓度。

五、结果与计算

1.标准曲线数据：

管号 1 2 3 4 5 6 7

每管浓度（μg) 0 1246810吸光值0 0.10.2110.4450.6520.854 1.005

标准曲线如下图：

由标准曲线可知，标准曲线公式为：y=0.10306x+0.01029(其中x为NO2-溶液浓度，y为反应溶液在A530下的吸光值)

2.超氧阴离子含量计算

2.1小麦叶片测得的实验数据

（1）测得的吸光值数据：

处理本底值试验值

A5300.507 0.718

（2）把吸光值带入标准曲线公式中求得x（NO-2浓度）：

处理本底值试验值

X（每管NO-2浓度μg） 4.819 6.867

将Xa=4.819、Xb=6.867，Vt=5ml，n=2，FW=1.094g，Vs=2ml分别带入公式O2-.含量（ug·g-1FW）

=2·X·Vt·n/gFW·Vs中求出O⎺∙

2含量如下：

处理本底值试验值O-.的含量（μg·g-1Fw）44.049 62.769

2.2荠菜叶片测得的实验数据

（1）测得的吸光值数据：

处理本底值试验值

A5300.469 0.685

（2）把吸光值带入标准曲线公式中求得x（NO-2浓度）：

处理本底值试验值

X（每管NO-2浓度μg） 4.451 6.546

将Xa=4.451、Xb=6.546，Vt=5ml，n=2，FW=1.023g，Vs=2ml分别带入公式O2-.含量（ug·g-1FW）

=2·X·Vt·n/gFW·Vs中求出O⎺∙

2含量如下：

处理本底值试验值O-.的含量（μg·g-1Fw）43.509 63.988 六、结果分析

由实验数据可得，小麦叶片中O⎺∙

2含量的试验值为62.769ug·g-1FW，本底值为

44.049ug·g-1FW；荠菜叶片中O⎺∙

2含量的试验值为63.988ug·g-1FW，本底值为44.049ug·g-1FW。

去除本底所含有的O⎺∙

2过后，以小麦为试验材料的试验管

O⎺∙

2的含量为18.675（μg·gFw），以荠

菜为试验材料的试验管O⎺∙

2的含量为19.939（μg·gFw）。即植物叶片细胞内生理平衡被打破后，

氧化态产物因无法被消耗而积累。

七．注意事项

1、在制作标准曲线时，加入试剂的顺序不可以调整，一定要按顺序加入，否则显色不明显，或不显色。

2、对氨基苯磺酸加入后一定要摇匀后再加α-萘胺，否则会影响实验效果。