辛酸-硫酸铵沉淀纯化单克隆抗体

辛酸-硫酸铵沉淀纯化单克隆抗体

(一) 原理蛋白质在溶液中的溶解度取决于蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度, 以及蛋白质分子带有的电荷。如改变这两个因素,蛋白质就容易沉淀折出。

引起蛋白质沉淀的主要方法有

(1) 盐析, 即加入大量中性盐破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出, 沉淀不同蛋白质所需盐浓度及pH 值不同;

(2) 生物碱以及某些酸类, 在pH 值小于等电点时可以与蛋白质形成不溶的盐使其沉淀;

(3) 重金属离子如隶、铅、铜、银等, 在pH 值大于等电点时可以与蛋白质结合成不溶的盐使其沉淀;

(4) 有机溶剂如酒精、甲醇、丙酮等, 对水的亲和力很大, 能破坏蛋白质水化膜, 在等电点时使蛋白质沉淀。辛酸(caprylic acid) 在偏酸条件下能与血清或腹水中除IgG外的其他蛋白质结合并将其沉淀下来,IgG 则溶于上清液中, 再用硫酸镀盐析, 即可达到纯化IgG 的目的。

辛酸-硫酸铵法是目前实验室中较常用的纯化单克隆抗体的方法, 利用该方法纯化单克隆抗体, 回收率和纯度都可达80% 以上。

(二) 试剂和器材

1. 试剂

(1) 小鼠腹水。

(2) 硫酸铵或饱和硫酸铵溶液。称(NH4)2S04(AR)400~425 克, 以50 ℃~80 ℃蒸馆水500ml溶解, 搅拌2O min, 趁热过滤。冷却后以浓氨水(15M NH40H) 调pH 值至7.4 。配制好的饱和硫酸铵, 瓶底应有结晶析出。

(3)0.06M pH 4.8 醋酸盐缓冲液。

贮存液: A 液,0.06M NaAc: 无水NaAc0.49218g 加蒸馆水至100ml

B 液,0.06M HAc: 冰醋酸0.344ml 加蒸馆水至100ml

应用液: 取上述A 液59ml 与 B 液41ml 昆合, 用5M NaOH 调pH 值至4.80.

(4)0.lM pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS). 取Na2HP04 · 12H20 28.94g,KH2P04 2.61g, 加蒸馆水至

100Om1

(5) 含137mM NaCl 2.6mM KCl 0.2mM EDTA 的pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS): 取Na2HP04 12H20 28.94g KH2P04 2.61g NaC1 8.Og 、KCl 0.2g EDTA 0.06g, 加蒸馆水至100Oml

2. 器材普通冰箱、低温离心机、电磁搅拌器, 紫外分光光度计、天平; 透析袋、塑料夹、精密pH 试纸; 烧杯、量桶、吸管、滴管、小瓶等。

（三) 操作步骤

方案一( 硫酸铵沉淀法)

1. 腹水4 ℃12000 rpm 离心15min, 去除杂质。

2. 取1 份腹水与2 份醋酸盐缓冲液混合, 室温搅拌下逐滴加入正辛酸33 μ l/ml 腹水。

3. 室温混合30min

4. 4 ℃静置2h 以上, 使其充分沉淀。

5. 4 ℃,12000 rpm 离心3Omin, 弃沉淀。

6. 上清经砂芯漏斗或125 μm 的尼龙网过滤后, 加入1/10 体积的0.1M pH

7.4 Pbs , 用2M NaOH 调pH 值至7.4.

7. 冰浴下于30min 内加入0.277g/ml 的硫酸铵, 使成45％饱和度。

8. 4 ℃静置1h 以上。

9. 4 ℃,10000 rpm 离心30min, 弃上清。

10. 沉淀用适量含137mM NaC1 、2.6mM KCl 、0.2mM EDTA 的pH 7.4 PBS 溶解, 于50~100 倍体积的上述PBS 中4 ℃透析过夜。

11. 取少量透析后样品适当稀释后, 以紫外分光光度计检测蛋白含量,SDSPAGE 检测抗体纯度。

方案二( 饱和硫酸铵溶液沉淀法) 1~5 同方案一。

6. 上清经砂芯漏斗或125 μ m 的尼龙网过滤后, 于50 倍体积的0.01M pH

7.4 PBS 中4 ℃透析6h

7. 在透析后的上清中加入等体积饱和硫酸铵溶液。

8. 4 ℃静置1h 以上0 9.4 ℃,10000 rpm 离心3Omin, 弃上清。

10. 沉淀用适量含137mM NaCl 、2.6mM KC1 、0.2mM EDTA 的pH7.4PBS 溶解, 于50~100 倍体积的上述PBS 中4 ℃透析过夜。

11. 取少量透析后样品适当稀释后, 以紫外分光光度计检测蛋白含量,SDSPAGE 检测抗体纯度。

(四) 注意事项

1. 无论是含有单克隆抗体的腹水还是细胞培养上清, 均含有脂蛋白、脂质、细胞碎片等杂质, 必须预先去除。通常采用过滤的方法去除脂质和大的颗粒, 用离心的方法去除细胞碎片和大的蛋白聚合物; 如果材料里含有大量脂质, 还必须用二氧化硅粉或玻璃纤维吸附等将其去除。

2. 盐析时, 溶液中的蛋白浓度对沉淀有双重影响。蛋白浓度愈高, 沉淀所需的盐饱和度极限愈低, 但杂蛋白的共沉作用也随之增加。因此, 在盐析时血清和腹水都应作适当稀释, 一般血清作倍比稀释, 腹水作 2 倍稀释。

3. 辛酸-硫酸铵法还可以用来纯化血清中的抗体, 此时辛酸用量因抗体来源不同而稍有变化, 人血清为70 μ/m l, 兔血清为75 μ/ml, 小鼠血清为40 μ/ ml 。

4.pH 值对盐析的影响: 抗体的溶解度与pH 值和盐浓度有密切关系, 选择适当的pH 值可大大提高对单克隆抗体的沉淀效果。通常溶液的pH 值与目标蛋白的等电点相等时, 沉淀效果最好, 另外, 硫酸铵在水中显酸性, 为防止对蛋白质的破坏, 应将溶液的pH 值调至中性。

5. 该法主要用于IgG1 和IgG2b 的纯化, 对IgA 和IgG3 的回收率及纯化效果都较差。蛋白质经硫酸铵沉淀、离心分离后, 沉淀中含有硫酸铵, 在此状态下冷冻保存,蛋白质比较稳定。若需进一步处理，首先需要除盐，方法可选择透析，凝胶过滤等。