高中生物 第四章 生物化学与分子生物学技术 第1节 生物成分的分离与测定技术素材 苏教版选修1

第四章 生物化学与分子生物学技术 第1节 生物成分的分离与测定
技术
1．蛋白质的分离方法
(1)薄膜透析法：
①原理：蛋白质水溶液具有亲水胶体溶液性质，不能透过半透膜。
②目的：去除小分子化合物杂质，如无机盐、单糖、二糖、氨基酸等。
③常用的半透膜：肠衣、玻璃纸等。
④步骤：将待纯化的蛋白质溶液装入透析袋内，再把透析袋放入透析液中即可。
(2)离心沉降法：
①原理：在离心力的作用下，分子大小、密度不同的分子沉降速度不同，从而被分离。
②目的：使分子大小、密度不同的不同种类的蛋白质彼此分离。
(3)电泳：
①概念：带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象。
②原理：不同的物质所带电荷不同，颗粒的大小、形状不同，因此，在电场中的泳动速
度不同。
③影响泳动速度的因素：带电颗粒的性质，即颗粒的大小、形状和所带电荷的多少；此
外还有电场强度、溶液的pH等因素。
④泳动规律：带电颗粒直径越小、越接近于球形，所带净电荷越多，则在电场中的泳动
速度越快；反之，则越慢。
⑤常用方法：支持物电泳。
⑥支持物：滤纸、醋酸纤维薄膜、大分子凝胶等。
2．血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
(1)特点：
①电泳后区带界限清晰。
②通电时间较短(60～90 min)。
③它对各种蛋白质都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象。
④对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色。
(2)关键步骤及其技术要求：点样是本实验的关键步骤。点样前，应将薄膜表面多余的
缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散；但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起
始参差不齐，影响分离效果。
(3)结果及其分析：
①结果：
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳图谱示意图
②结果分析：从电泳图谱示意图中可以看出：
a．血清蛋白主要包括五种蛋白质，且含量最多的是清蛋白，其他依次是：γ­球蛋白＞
α1­球蛋白＞α2­球蛋白＞β­球蛋白。
b．由五种蛋白质所处的位置可判断出它们均带负电荷，四种球蛋白在电场中的泳动速
度由快到慢依次为α1­球蛋白＞α2­球蛋白＞β­球蛋白＞γ­球蛋白。
3．凝胶色谱法分离血红蛋白
(1)样品处理：以低速短时间离心分离红细胞，获得被洗净的红细胞。
(2)血红蛋白的释放、分离和透析：
①用蒸馏水和甲苯破裂红细胞，释放出血红蛋白，得到混合液。
②离心混合液，过滤除去沉淀层，用分液漏斗分离出红色透明液体。
③用磷酸缓冲液透析红色透明液体12 h。
(3)凝胶的制备：用蒸馏水溶胀交联葡萄糖凝胶，制成凝胶悬浮液。
(4)色谱柱的装填：
①垂直固定洗净的层析柱选择有薄膜的端为下口。
②打开下端的乳胶管开口，将搅动均匀的凝胶悬浮液沿柱的内壁缓缓一次性倒入柱内。
③连接洗脱瓶，用洗脱液充分洗涤平衡凝胶12 h。