人外周血白细胞DNA提取标准操作规程(SOP)
外周血细胞形态分析标准操作程序
外周血细胞形态分析标准操作程序1 检验目的规范外周血细胞形态学检查，对各仪器达到复检规则的样本进行复片检查，给临床有关疾病的诊断、观察疾病的变化及治疗效果提供重要的参考依据。
2 用于检验程序的原理把血液制成细胞分布均匀的薄膜涂片，用瑞氏-姬姆萨染料染色，观察各种细胞数量、形态和质量的变化。
3 性能参数不适用。
4 原始样品系统血液标本详见《血常规标本的采集与处理程序》。
5 容器和添加剂类型血液标本采集的容器是一次性含 EDTA-K2 抗凝剂的真空采血管；添加剂是EDTA-K2 抗凝剂。
采集方法：准确采集静脉血 2.0ml 于上述容器中，轻轻颠倒混匀或直接取手指血 20μl。
要求量准，采血顺利，不能出现凝块。
取手指血或抗凝血于洁净的玻片上制片。
6 所需设备和试剂6.1 仪器、器材：显微镜或 DM96 自动阅片机、玻片6.2 试剂6.2.1 瑞氏-姬姆萨染色液6.2.2 磷酸盐缓冲液（自配）：称取 10 克 KH2PO4，用 1000ml 蒸馏水溶解为 1%浓度的 KH2PO4 溶液，称取 7 克 NaHPO4，用 700ml 蒸馏水溶解为 1%浓度的2Na2HPO4 溶液，取 900 毫升 1%浓度的 KH2PO4溶液和 600 毫升 1%浓度的Na2HPO4 溶液混匀，再用蒸馏水加至 3000 毫升，充分混匀。
配制的缓冲液的 pH 值范围应该在 6.4-6.8。
7 程序步骤仪器器材/试剂准备→样本编号→制片→染色→镜检→分析测定结果→结果审核签发。
应在取血后4小时内完成血涂片制作。
7.1 样本编号按顺序将样本编号，认真核对检验目的、病人姓名、性别、科室、床号、血液质量，如有疑问应及时与临床联系。
如采血量不够、有凝块或有溶血现象等，须申请重留标本。
7.2 制片采用 SP1000I 自动推片机或手工制片。
将样本混匀后取 5～10ul 滴于玻片上，并在玻片上注明患者姓名、样本编号，推制厚薄适宜的血膜片。
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。
PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。
为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。
一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。
2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。
3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。
二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。
2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。
3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。
三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。
2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。
3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。
对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。
人外周血白细胞分离液使用说明
人外周血白细胞分离液使用说明一、试剂的制备1.将人外周血样品采集入采血管中，并将其与抗凝剂轻轻混匀。
2. 采用无菌条件下，将采集的外周血放入离心管中，以2000 rpm的转速离心10分钟。
3.弃去上清液，保留沉淀，注意不要干扰底部白细胞沉积。
4. 向离心管中加入合适体积的分离液，通常建议将1 ml分离液加入约2 ml外周血样品中。
5. 使用离心机以2000 rpm的速度离心10分钟。
6.弃去上清液，并将其中的底泥转移到新离心管中。
7.向新的离心管中加入平衡液，与底泥充分混匀。
8. 使用离心机以2000 rpm的速度离心5分钟。
9.弃去上清液，并将底泥转移到合适的容器中。
10.向底泥中加入适量的培养基，细胞培养基通常是最常用的培养基。
二、试剂的存储1.试剂储存温度通常在2-8摄氏度之间。
2.开封后的试剂，建议在使用之前将其置于室温下适当回温。
3.试剂一旦开封，应避免重复的冻融循环，以防止对试剂活性造成损害。
4.尽量避免接触光线，以防止试剂活性的降低。
三、使用注意事项1.使用前，请确认试剂是否过期，过期试剂不得使用。
3.使用前，应先将分离液均匀搅拌，以保证其活性。
4.在试剂使用过程中，尽量避免受到湿气和阳光的影响。
5.将待提取的外周血样品严格根据提取方法进行操作，以获得高质量的白细胞。
6.在离心过程中，注意离心管的盖子要盖好，防止离心时离心液的外溢。
7.实验过程中，尽量避免反复提取，以避免对白细胞活性造成损害。
8.在培养细胞的过程中，注意细胞培养基的选择和培养条件的控制，以保证白细胞的健康生长。
四、注意事项1.本试剂仅供科研使用，禁止用于临床诊断等用途。
3.请按照相关实验室安全操作规范进行操作，做好个人防护措施。
4.请勿将试剂倒入下水道或垃圾箱中，应根据相关规定进行处理。
总结：通过以上的使用说明，我们可以了解到人外周血白细胞分离液的使用方法以及使用注意事项。
正确和规范使用试剂可以帮助我们获得高质量的分离液和细胞，进一步推动科学研究的进展。
实验一、血液标本提取DNA(蛋白酶K-酚抽提法)
实验一、血液标本提取DNA（蛋白酶K-酚抽提法）一、实验原理离心分离到外周血的白细胞层；用细胞裂解液溶解细胞膜、核膜，使组蛋白与DNA分离，再用酚、三氯甲烷/异戊醇抽提去除蛋白质，最后经乙醇沉淀即可得到基因组DNA片段。
二、实验步骤：1、血液标本处理 1.0ml抗凝全血(ACD、EDTA抗凝均可)2000rpm离心10min（1.5mlEP管）。
轻轻去上清液（血浆），吸出淡黄色悬浮液（白细胞层）置于另一2.0mlEP管中。
（约50μl）2、细胞裂解加入10倍体积组织细胞裂解液，37℃1h，3、加入蛋白酶K消化加入蛋白酶K至终浓度100μg/ml（约4μl），充分混匀，37℃震荡12-24h或37℃1h后，56℃水浴3h。
保温过程中不时摇动，混匀反应液。
液体逐渐变粘稠，表明已有DNA释放出来，操作应轻柔。
4、酚抽提：将上述溶液冷却至室温，加等体积的Tris饱和酚（pH8.0）溶液，温和缓慢颠倒离心管10min，混匀两相成乳液。
12000rpm 5分钟，两相分层。
用宽口径移液管小心吸出上层粘稠的水相，移至一新的2.0mlEP管中。
（小心一点，不要吸入蛋白层。
如交界处有白色沉淀，需重新抽提有机相，用酚重新抽提两次，合并水相）5、三氯甲烷/异戊醇抽提上清液加等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1），倒转混匀10分钟，12000rpm5分钟，取上层水相0.5ml入另一新的2.0mlEP管；6、DNA沉淀上清液中加0.2倍体积3.0mol/L 醋酸钠，再加2倍体积的4℃冰箱冷却后的无水乙醇，轻柔振摇，充分混匀；应可看到白色絮状物（DNA）。
12000rpm 5分钟，弃上清液；7、纯化：加1ml 70%乙醇洗涤，12000rpm 离心5分钟，去上清夜，重复1次；（此过程不得振荡摇动）8、溶解：弃上清液后，自然干燥（挥发痕量乙醇）后，用30μl pH8.0TE完全溶解，保存在-20℃备用。
三、注意事项1、加样准确，操作轻柔；微量加样器绝对不能超过最大量程；2、加酚试剂时，不要接触到皮肤上，有腐蚀性；如不小心弄到，立即用清水冲洗；3、取上清液时，不可吸到下层溶液；4、加TE液后轻摇10min溶解DNA或-4˚C保存待用。
DNA提取-SOP
全血DNA提取操作规程一．生物安全要求：DNA提取应在生物安全二级实验室的生物安全柜里完成。
二．试剂盒组分及规格：DNA提取液（含chelex-100等）三．其它实验设备及耗材双蒸水；1.5 mL无菌离心管；0.5-10 μL、20-200 μL、100-1000 μL加样器及枪头；PCR反应管；可调14K微型离心机；漩涡振荡仪四．样本要求1．1 mL EDTA抗凝外周血，采集后轻轻混匀。
样本应尽快送检，保存运输温度为2-8 ℃。
建议2-8℃保存不超过24小时；-20 ℃保存不超过1个月；-70 ℃保存不超过2个月。
避免反复冻融（仅限1次）；如长期保存，建议提取样本DNA后-80 ℃保存。
2.样本中存在的干扰物质在一定范围内不影响检测，当干扰物质超出以下范围时不能保证检测结果的准确性：胆红素480 μmol/L，甘油三酯30 mmol/L，血红蛋白≤600 g/L，抗凝剂浓度0.1875-3 mg/mL。
五．核酸提取操作步骤：1.采集EDTA抗凝全血2.取200 μL EDTA抗凝血至1.5 mL新的无菌EP管中。
3.加入600 μL双蒸水，漩涡振荡混匀，室温放置10 min，期间漩涡振荡混匀2-3次，12000 rpm离心5 min，弃上清。
4.加入200 μL DNA提取液（使用前充分混匀，使颗粒悬浮），100 ℃水浴8 min。
5.12000 rpm离心5 min，取上清用于检测。
血片DNA提取操作规程一．生物安全要求：DNA提取在生物安全二级实验室的生物安全柜里完成。
二．试剂盒组分及规格：DNA提取液（含chelex-100等）三．其它实验设备及耗材双蒸水；1.5 mL 无菌离心管；0.5-10 μL、20-200 μL、100-1000 μL加样器及枪头；PCR反应管；可调14K微型离心机；漩涡振荡仪；打孔器四．样本要求1.每个样本至少3个血斑，且每个血斑直径大于8 mm。
2.血滴自然渗透，滤纸正反面血斑一致。
DNA抽提的操作步骤
DNA抽提的操作步骤试剂准备：蛋白酶K、白细胞裂解液、苯酚、氯仿、无水乙醇、70%乙醇1.从冰箱取出冰冻的白细胞，将编号和姓名写在登记本上。
待白细胞融化后，向管内加入5ml白细胞裂解液和50ul蛋白酶K（20mg/ml）。
将管内液体摇匀，或者借助移液枪反复吹打混匀。
然后将管子放入60℃水浴锅内，过夜（可以根据孵育的时间长短适当调整温度）。
在水浴的过程中，每隔2-3小时将试管震荡摇匀一次。
2.把水浴锅内的试管取出，将其中的液体转移到15ml试管内（15ml的试管事先做好标记），并依次向试管内加入等体积（即5ml）的酚-氯仿，然后将盖子拧紧。
轻轻上下颠倒混匀（20次左右），然后离心3000rpm，15min。
离心时将离心机的温度调至室温，温度过低会导致有机溶剂凝固。
离心结束后，可以看到试管内的液体分为三层，上层为水相，中间为变性的蛋白质，下层为有机溶剂（酚氯仿）。
3.然后用钝口Tip吸出上层水相转移到干净的试管中（注意：将1ml的Tip尖端减去2-3mm即可得到钝口的Tip，在吸取上层水相的过程中要尽量避免混入蛋白相，动作要缓慢）多分几次转移），然后再加入等体积的酚氯仿，拧紧盖子，颠倒混匀，离心3000rpm，10min。
4.再次用钝口Tip把上层水相转移到干净的试管中，然后向试管内加入2倍体×2），拧紧盖子，缓慢颠倒，积的无水乙醇（无水乙醇的体积=V所吸出的上清的体积即可看到絮状的DNA沉淀析出。
（如果抽提的数量较少，可以将管子放到Cold Room，等数量多了再一起进行下面的操作）5.用黄色Tip把白色絮状的DNA沉淀挑出来，放到70%乙醇（预先准备0.5ml的小管子，加入400ul70%的无水乙醇，洗涤用）中洗涤，重复两次。
6.最后用黄色Tip将DNA沉淀挑出，将DNA连同枪头一同打到1.5mlEP管中。
敞开盖子，室温放置直到乙醇完全挥发，向EP管内加入400ulTE，用Tip头反复吹打，使DNA完全溶于TE，得到DNA溶液。
外周血DNA的提取课件
DNA复制
DNA的自我复制能力是其 遗传信息的保障，确保遗 传信息的传递和延续。
基因表达
DNA中的特定碱基序列决 定蛋白质的结构和功能， 通过基因表达调控生命活 动。
外周血中DNA的来源与分布
来源
外周血中的DNA主要来源于白细 胞，尤其是淋巴细胞和单核细胞。
分布
DNA在血浆和血清中均有分布， 但主要存在于血浆中。
提取过程中的常见问题与解决方案
DNA降解 如发现DNA降解，应立即停止操作，重新配置试剂，并确 保操作过程中避免过度处理和长时间暴露于环境中。
提取效率低 可尝试调整提取步骤中的条件，如增加洗涤次数、调整洗 涤液的pH值等，以提高提取效率。
杂质污染 若发现DNA中含有杂质，应对使用的所有试剂和耗材进行 纯化，确保无杂质污染。
提取后DNA的质量检测
琼脂糖凝胶电泳检测
通过琼脂糖凝胶电泳检测提取后DNA的片段大小和完整性，确保 DNA质量符合后续分析要求。
浓度和纯度检测
使用紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度，确保DNA的浓度适 中且无杂质干扰。
重复性测试
对多次提取的DNA进行重复性测试，以评估提取方法的稳定性和可靠 性。
外周血DNA提取的意义与用途
意义：外周血DNA提取是基因 检测、遗传疾病诊断、肿瘤基 因检测等研究的重要基础。
用途：用于基因突变筛查、疾 病预测、个体化治疗指导等临 床和科研领域。
以上内容仅供参考，实际操作 需结合具体情况进行调整优化。
02 外周血DNA提取的方法 与步骤
样本的收集与处理
样本来源
外周血DNA的提取课件
目 录
• 外周血DNA提取的基本知识 • 外周血DNA提取的方法与步骤 • 外周血DNA提取的质量控制 • 外周血DNA提取的应用与案例
血液dna提取注意事项
血液dna提取注意事项血液DNA提取是遗传学和分子生物学研究中常见的实验步骤之一，在医学诊断、药物研发、人类进化等领域都有重要应用。
下面将详细介绍血液DNA提取的注意事项。
1. 样本采集：- 血液样本应在无菌条件下采集，避免外源性DNA的污染。
- 血液样本采集至少2ml以上，以确保提取到足够的DNA量。
- 尽量避免血样接触金属，以防止铁离子的存在对DNA样本的影响。
- 对于某些应用，如单个核苷酸多态性（SNP）分析，应采集多个血液样本以保证结果的准确性。
- 样本应尽可能及时处理，以防止DNA的降解。
2. 样本处理：- 血液样本在提取前应进行离心分离，分离血浆/血清和红细胞，以避免红细胞的核酸对DNA提取的干扰。
- 分离的血浆/血清可以用于其他分子生物学研究的目的，如RNA提取。
- 如果需要提取白细胞DNA，需要使用红细胞裂解缓冲液将红细胞破裂并释放白细胞，然后进行后续的DNA提取步骤。
3. DNA提取试剂和设备：- 选择适合的DNA提取试剂盒，根据实验需要选择不同原理的试剂盒，如有机溶剂法、硅胶基质法、离子交换法等。
- 至关重要的是严格按照试剂盒说明书进行操作，以保证DNA的高质量提取。
- 进行DNA提取的实验室应具备基本的无菌条件和基因实验室设备，包括离心机、热平台、洗涤机、显微镜等。
4. DNA提取步骤：- 在进行DNA提取前，应先进行样本记录和标记，确保后续实验数据的准确性。
- 样本处理过程中应避免DNA接触皮肤和吸入，戴手套并佩戴口罩和护目镜。
- 在DNA提取操作中应用干燥DNA纯化试剂盒时，要注意防止粉尘的吸入和尘埃污染。
- 振荡或旋转过程中，避免样品外泄或误操作导致的交叉污染。
- 严格控制实验条件，如操作时间、温度、离心速度和时间等，以确保实验结果的一致性。
- 使用质控样品进行DNA提取的效果验证，确保提取出的DNA质量和纯度达到要求。
5. DNA样本保存：- 提取到的DNA样本应立即在低温冰箱或液氮中保存，以防止样本的降解。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
人外周血白细胞DNA提取标准操作规程(SOP) （血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)）
1实验原理
本法采用血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)，从全血中分离白膜层，去除其中的红细胞及蛋白质，裂解白细胞释放DNA，再通过去除DNA中的杂质使其纯化，得到高纯度的DNA原液，最后使用微量紫外可见分光光度计对DNA 的浓度及纯度进行定量检测。
2实验仪器
2.1 1.5ml EP管
2.2微量移液器，10μL、50μL、200μL、1000μL
2.3涡旋振荡器
2.4数显恒温搅拌循环水箱
2.5吸附柱CB3
2.6收集管
2.7离心机
2.8涡旋振荡器
2.9微量紫外可见分光光度计（Thermo NanoDrop1000）
3实验试剂
3.1正常人混合血液，应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。
3.2红细胞裂解液（裂解红细胞）
3.3缓冲液GA（轻微裂解作用，为蛋白激酶K提供反应环境），若溶液产生沉淀，使用前应在37℃水浴中预热10min,以溶解沉淀。
3.4蛋白激酶K（裂解蛋白质）
3.5缓冲液GB（裂解白细胞，释放DNA），若溶液产生沉淀，使用前应在37℃水浴中预热10min,以溶解沉淀。
3.6无水乙醇（沉淀DNA，去除杂质）
3.7缓冲液GD（去除蛋白质），使用前应按照试剂瓶标签的说明加入无水乙醇。
3.8缓冲液PW（去除盐），使用前应按照试剂瓶标签的说明加入无水乙醇。
3.9洗脱缓冲液TE（保存DNA）
4实验步骤
4.1样品的采集与保存：用装有EDTA的塑料管采集2mL静脉血，2000rpm离心5min，可见分层，分别为血浆层、白膜层、红细胞，将血浆吸出弃去，再通过点吸的方式将白膜层全部吸出，置于干净的1.5mL EP管备用。
如无法及时提取DNA，则应置于-80℃进行保存。
4.2样品预处理：
4.2.1裂解红细胞：通过低速涡旋15s混匀样品，取150μL样品置于干净的1.5mL EP管，加入750μL红细胞裂解液，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀
5min，然后10000rpm离心2min，吸去上清，留下白细胞沉淀。
4.2.2重悬白细胞：加入200μL缓冲液GA，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀3~5min，使白细胞沉淀重悬。
4.2.3裂解蛋白质：加入20μL蛋白激酶K，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀1min。
4.2.4裂解白细胞，释放DNA：加入200μL缓冲液GB，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀10min，70℃水浴10min。
4.2.5沉淀DNA，去除杂质：加入200μL无水乙醇，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀15s，简短离心使样品进一步混匀并去除管盖内壁的水珠。
将管内所有溶液都加入吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
4.2.6去除蛋白质：向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心
1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
4.2.7去除盐类：向吸附柱CB3中加入600μL缓冲液PW，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
4.2.8去除盐类：重复步骤（7）。
向吸附柱CB3中加入600μL缓冲液PW，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
4.2.9去除残存漂洗液：将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。
将吸附柱CB3打开盖子置于室温放置10min。
4.2.10洗脱DNA：将吸附柱CB3转入一个干净的1.5mL EP中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到1.5mL EP管中，如无法及时测定，应置于-80℃进行保存。
4.2.11测定DNA浓度及纯度：使用微量紫外可见分光光度计进行测定，测定前通过手弹EP管底部3~5次的方式来使DNA溶液混匀。
5实验结果分析
5.1A230nm：碳水化合物和盐类最高吸收峰吸收波长。
5.2A280nm：蛋白质及酚类物质最高吸收峰吸收波长。
5.3A260nm：DNA/RNA最高吸收峰吸收波长。
5.4260/280：比值应在1.7~2.0之间，低于1.7表示有蛋白质及酚类物质污染，高于2.0表示有RNA污染。
5.5260/230：比值应大于1，低于1表示有碳水化合物和盐类污染。
5.6ng/μL：样品浓度单位，是通过样品在260nm处的吸光值以及选择的分析常数来计算的。
采用本法提取的DNA溶液浓度应大于100ng/μL。