分子生物学实验讲义
分子生物学实验讲义.
分 子 生 物 学 实 验 讲 义内蒙古科技大学数理与生物工程学院自治区基础生物实验示范中心基础生物教学部2009年10月目录实验一质粒DNA的小量提取实验二琼脂糖凝胶电泳实验三大肠杆菌感受态细胞的制备实验四大肠杆菌感受态细胞转化宿主细胞实验五聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片断实验六重组DNA分子的构建实验七质粒DNA的酶切和电泳鉴定实验八植物基因组DNA的提取实验九植物基因组总RNA的提取实验十与人类遗传病相关的核苷酸重复序列的克隆实验一 质粒DNA的小量提取一、目的要求1、掌握用碱变性法提取质粒DNA的技术2、掌握用分光光度计测定DNA浓度的方法二、基本原理在染色体外能自主复制且稳定遗产的遗传因子称为质粒，大小在1kb-200kb 之间，是双链闭合环状的DNA分子。
在细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中都发现有质粒存在，其中细菌质粒存在最为普遍，在基因工程中常用作基因载体。
碱变性法又称碱抽提法或碱裂解法，是一种用的最广泛的制备质粒DNA 的方法，此法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会分离。
当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节起pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
三、仪器、材料和试剂（一）仪器微量移液器、微量离心管（又称Eppendorf管）、常用玻璃器皿、台式高速离心机、分光光度计（二）材料含有质粒的大肠杆菌DH5a（三）试剂及溶液LB培养基、葡萄糖1、用于碱法提取质粒DNA的溶液溶液1（GET）缓冲液：50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HClpH8.0，用前加溶菌酶4mg/Ml。
分子生物学实验技术ppt课件
质粒转化大肠杆菌的过程
感受态
非定向克隆 +
或
定向克隆
克隆的片段只能按
+ 特定方向连接基因组DNA的构建基因组DNA的类型
质粒（﹤10kb)噬菌体质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可 用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子， 然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比 值（M/Z值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离 的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
两种离子发生方法： 基质辅助激光解吸附/离子化（MALDI)、电喷雾离子化 （ESI)
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基 因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后， 以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一 种技术。
将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进 行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的 噬菌体展示库 。
将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与 “猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库 中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎 物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进 行质谱鉴定。
四、蛋白组学研究
蛋白质分离 蛋白质分析 蛋白质相互作用的研究方法： 酵母双杂交技术，噬菌体展示技术，表
面等离子共振技术，荧光共振能量转移 技术，蛋白质微阵列芯片技术，免疫共 沉淀技术，pull-down技术
蛋白质分离
最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双 向电泳（2-DE），是根据蛋白质的等电点不同在pH 梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（IEF)，然 后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
重叠延伸PCR原理
重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物， 使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过 重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可 简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构 建
分子生物学实验讲义
实验一植物基因组DNA的分离一、相关知识分离植物DNA是分子生物学实验的一个基本要求。
不同的研究目的对DNA的纯度和量的要求不尽相同。
例如，在构建用于筛选植物基因或其他诸如RFLP这样的遗传标记基因组DNA文库时，需要使用高相对分子质量、高纯度的DNA；而在进行遗传分析时，对DNA的纯度要求就可以低一些。
一般而言，一个好的DNA分离程序应符合以下三个主要标准：（1）所得DNA的纯度应满足下游操作的要求，用于RFLP分析的DNA，其纯度的要求为可用限制性内切酶完全酶解并可成功地转移到膜上进行Southern杂交；用于PCR分析的DNA则不应含干扰PCR反应的污染物；（2）所得DNA应当完整，电泳检查时可给出精确性高、重复性好的迁移带型；（3）所得的DNA应有足够的量。
如果对植物进行大规模筛选，还应当满足操作程序应当快速、简便、价格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂这样的要求。
二、实验原理植物DNA的提取程序应包括以下几项：首先，必须粉碎（或消化）细胞壁以释放出细胞内溶物。
分离总基因组DNA常用的破壁方法是将植物组织胀水，然后研磨成细粉；或者将新鲜植物组织在干冰或液氮中快速冷冻后，用研钵将其磨成粉沫。
其次，必须破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中，这一步骤通常靠诸如SDS或CTAB一类的去污剂来完成。
去污剂还可以保护DNA免受内源核酸酶的降解。
通常提取缓冲液中还包含EDTA，它可以螯合大多数核酸酶所需的辅助因子——镁离子。
最后，一旦DNA释放出来，其剪切破坏的程度必须要降到最低。
剧烈振荡或Tip头小孔快速抽吸都会打断溶液中高相对分子质量的DNA。
分离高相对分子质量的DNA还只是工作的一部分。
因为在粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖等杂质，这些杂质有时很难从DNA中除去。
大多数蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，绝大部分RNA则可通过经处理过的RNase除去。
但多糖类杂质一般较难去除，这些杂质浓度高时，往往用一些DNA纯化试剂盒来进一步纯化DNA。
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实验质粒DNA的碱裂解法提取与纯化一、实验原理细菌质粒是一类双链、闭环的DNA, 大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份, 通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态, 但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上, 随着染色体的复制而复制, 并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子, 重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取, 本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法, 其基本原理为: 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时, 蛋白质与DNA发生变性, 当加入中和液后, 质粒DNA分子能够迅速复性, 呈溶解状态, 离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状, 离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如, 氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法, 但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA, 经过苯酚、氯仿抽提, RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA, 所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求, 故在分子生物学实验室中常用。
二、实验试剂1.溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖, 25mM Tris-HCl(pH 8.0), 10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml, 0.5M EDTA（pH 8.0）10ml, 葡萄糖4.730g, 加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min , 贮存于4℃。
2.溶液Ⅱ: 0.2N NaOH, 1% SDS。
2N NaOH 1ml, 10%SDS 1ml, 加ddH2O至10ml。
分子生物学实验讲义
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分子生物学实验讲义_final
实验安排实验一PCR引物设计PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2.避开产物的二级结构区：某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
3.长度：寡核苷酸引物长度为15-30bp，一般为20-27bp。
引物的有效长度Ln 值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。
4.G+C含量:G+C含量一般为40%~60%。
其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
5.碱基础随机分布:引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
6.引物自身:引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构影响引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于4bp。
7.引物之间:两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。
分子生物学实验讲义总
2. 实验所需试剂：CTAB提取缓冲液、Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）、氯仿-异戊醇（24:1）、RNaseA、无水乙醇、75%乙醇、ddH2O（或TE）；（这3个标红色的试剂以
本实验以对虾幼虾肌肉组织为材料，学习基因组DNA提取的一般方法。
三、实验材料、试剂和仪器：
1. 实验材料：-80℃保存的南美白对虾幼虾；（在116的超低温冰箱里，橘色盖子的冻存管中，可让研究生提前找好，每个冻存管中有2~3尾幼虾，学生做实验时，每个两人的小组取1/2或1/3尾幼虾进行研磨即可。）
不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。
实验一：对虾（肌肉组织）基因组DNA的提取
（下次上课时交这次课的实验报告，依此类推）
一、实验目的：
掌握提取动物基因组DNA的基本方PCR分离基因等。
二、实将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团悬浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提，混匀过程要轻缓，以保则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可保证包含PCR所扩增的片段（一般2kb以下）。
南京大学分子生物学实验课讲义
分子生物学实验课讲义第一讲实验室纪律、实验室安全及分子生物学基本操作1．所有必修及选修该实验课的学生必须按时进入实验室并按分组名单就座，不得擅自调整组号，有特殊原因不能来上课者须提供书面请假条及相关证明。
2．上课期间须关闭手机铃声，不得使用任何音乐播放器，禁止讨论与实验课无关的话题，禁止阅读与实验课无关的读物。
3．严格按照正确的操作规程使用仪器，用后须关闭电源，不要用手直接触摸有害试剂，废弃物品须丢在指定位置。
4．保持实验台面整洁，如有污染，须及时清理，实验室地面卫生由值日学生在实验结束后统一打扫。
5．分子生物学实验每个组常用器材包括一套取液器（20 μl、200 μl及1000 μl 共三把）、取液器吸头以及离心管等。
6．20 μl取液器的量程为1 μl ～20 μl，200 μl取液器量程为20 μl ～200 μl，1000 μl取液器量程为200 μl ～1000 μl，20 μl取液器和200 μl取液器配黄色吸头，1000 μl取液器配蓝色吸头。
7．吸取液体前，首先要选择合适的取液器（例如吸取400 μl液体就应该选择1000 μl取液器），然后将取液器调至所需刻度，插好吸头，按下取液器顶端按钮，将吸头尖端伸至液面下1～2 mm处，缓慢松开按钮，最后把所吸液体打入离心管或其它容器（打的时候可稍快）。
8．离心管最好在使用之前做上记号，以免不同样品之间产生混淆，离心管在离心机中必须平衡放置，并且离心管把要向外以便确定可能产生的沉淀的位置。
第二讲柱离心法小量提取质粒DNA实验原理：质粒是细菌中独立于染色体之外的较小的环状双链DNA，它通常携带某种药物（如氨苄青霉素，卡那霉素，链霉素，四环素等）的抗性基因，具有独立的复制原点，并且具有较高的拷贝数（从几个到几百个不等）。
柱离心法首先用碱使大肠杆菌裂解，并使其中的DNA（包括质粒及细菌的染色体DNA）全部变性，再用酸性缓冲液中和，质粒DNA由于分子较小，很快复性，而染色体DNA分子巨大，几乎不能复性，最后和细胞碎片及膜蛋白共沉淀被离心去除，上清液中含有复性的质粒DNA，蛋白质，RNA，并且盐浓度较高，在这种条件下，质粒DNA能够牢固地结合在离心柱中的吸附基质上，而大多数蛋白质和RNA在离心时被穿过，残留在吸附基质上的少量蛋白质和RNA可以用漂洗液洗去，最后，吸附在离心柱上的质粒DNA用低离子强度的溶液或水洗脱。
分子生物学实验教学讲义
实验一人血液基因组DNA的提取1．吸取500μl 红细胞裂解液到一个1.5ml 离心管。
2．将抗凝全血（使用前回复到室温）颠倒混匀后，吸取100μl 加到上述装有红细胞裂解液离心管中，颠倒6-8 次，并倒置轻弹管壁，确保充分混匀。
3．室温放置10 分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞）。
4．12,000 rpm 离心20 秒，倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团和大约10μl 的残留上清。
离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入900μl 红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤3，4。
5. 涡旋振荡15 秒重悬白细胞团，充分分散白细胞团。
白细胞的重悬分散对下一步裂解非常重要，白细胞未打散就加入裂解液，会导致白细胞不能充分裂解，形成肉眼可见团块。
6．加入300μl 细胞核裂解液到重悬的白细胞，迅速有力吹打几次混匀以裂解白细胞，由于基因组DNA 立刻释放出来，这个时候混合物会马上变得十分粘稠，立刻停止吹打（以免剪切断基因组DNA），颠倒旋转离心管10 次保证裂解液和所有的白细胞接触并裂解。
这一步对是否获得满意的裂解效果和基因组完整性很关键。
吹打力量如果太小，不足以迅速将细胞团打散并和裂解液混匀，形成肉眼可见团块无法裂解完全（裂解液如果是和细胞团块而不是分散的细胞接触，立刻会和细胞团块表面作用后形成粘稠的屏障，不容易再渗透入团块内部）。
裂解液和细胞接触后基因组DNA立刻释放出来，这个时候吹打力量过大，又易造成基因组断裂。
正确做法，就是迅速有力的吹打几次，几秒钟后基因组释放出来（变粘稠）立刻停止吹打，或者改用大口径枪头（剪去枪头尖）轻柔吹打或者颠倒混匀。
如果还有肉眼可见团块，可在65℃温育30-60 分钟（不要超过一小时）至裂解完全。
7．可选步骤：在裂解物中加入RNase A（10mg/ml）至终浓度100μg/ml，颠倒25 次混匀，37℃温育15 分钟去除残留RNA.然后冷却回室温。
硕士研究生分子生物学实验讲义
硕士研究生分子生物学实验讲义————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期:ﻩ分子生物学实验讲义(硕士研究生试用)山西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学实验室2010.6实验一动物组织蛋白质的提取【目的要求】1．掌握动物组织蛋白质的提取方法。
2.了解动物组织蛋白质提取的原理。
【实验原理】由于蛋白质种类很多,性质上的差异很大，即或是同类蛋白质,因选用材料不同,使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。
但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中,少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。
因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质。
蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。
故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。
温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。
提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用,将细胞内蛋白质提取出来,并与其它不需要的物质分开。
但动物材料中的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液(如血浆、消化液等)中，可以不必经过提取直接进行分离。
蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。
蛋白质经细胞破碎后,用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来,再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。
ﻫ【试剂器材】1．实验小鼠2．0．9%NaCｌ3．动物组织蛋白裂解缓冲液Trｉs 5０mＭＮaCl 15０mＭEＤTA 0.５mMDTT1mMTriｔｏn X－100 1%去氧胆酸钠0.5%SDS０.1%4．ＰMSF/异丙醇储备液10０ｍM（１74mg/１0ml)于-20℃储存5．-2０℃储存的冰块【操作步骤】1.颈椎脱臼处死小鼠,75%酒精擦拭皮肤,剪开腹部,剪切肝脏组织，称取0.6g，置于含预冷0.9%NaＣl(6ｍL）的平皿中。
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分子生物学实验讲义生命科学学院实验一质粒DNA的提取和酶切鉴定（6学时）一、实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的技术和方法。
二、实验原理基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体。
载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。
作为基因工程的载体必须具备以下条件：（1）是一个复制子，载体有复制点才能与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量繁殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别和切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗氨苄青霉素和四环素的基因，常用Ampr和Tcr表示，以此知道它是否进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其它细胞中分离筛选出来。
细菌质粒具备上述条件，它是基因工程常用的载体之一。
质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1-200kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
所用分离质粒的方法都包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
碱裂法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线状染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在PH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链仍然彼此相互盘绕，紧密结合在一起。
当加入PH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复PH至中性时，质粒DNA复性准确而迅速，而线性染色体DNA 由于两条链已彼此完全解开，复性就不会那么迅速准确，它们盘绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA以及蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
限制性内切酶：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
这种酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序的DNA片断。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子的大小和构型。
具有不同分子量的DNA片断泳动速度不一样，可以分离。
DNA分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系。
凝胶不仅可以分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同但构型不同的DNA。
在细胞内，共价闭合环状DNA以超螺旋形式存在。
如果两条链中的一条断裂发生一处或多出断裂，叫开环DNA；如果两条链同时断裂，则为线性DNA。
这三种构型的质粒DNA分子在凝胶中的迁移率不同。
因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线性DNA，最慢的为开环质粒DNA。
三、实验用品:（一）器材：恒温摇床、离心机、高压灭菌锅（二）药品：葡萄糖、三羟基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙酸钾、冰乙酸、氯仿、乙醇、酚、盐酸、含PUC19的大肠杆菌、PUC19质粒、琼脂糖、溴酚兰、蔗糖、溴化乙锭、硼酸（三）试剂：①溶液Ⅰ 50mmol/L 葡萄糖5 mmol/L Tris-HCL(PH8.0)1O mmol/L EDTA(PH8.0)②溶液Ⅱ 0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混匀③溶液Ⅲ 5mol/L乙酸钾 60ml冰乙酸 11.5ml蒸馏水 28.5 ml④TE缓冲液 10 mmol/L Tris-HCL10 mmol/L EDTA⑤70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）⑥5×TBE配制1000mL 5×TBETris 54g硼酸 27.5g0.5 mol/LEDTA 20ml⑦凝胶加样缓冲液（6×）溴酚兰 0.25%蔗糖 40%⑧溴化乙锭溶液 0.5μg/mL四、实验步骤（一）培养细菌及质粒的提取1.培养细菌将带有PUC19质粒的大肠杆菌接种在LB液体培养基中，37℃培养12-18小时。
（LB培养基成分如下：每升含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCL10g,用5mol/L NaOH调PH至7.5。
）2．从菌落中提取质粒DNA取细菌培养液1.5mL置离心管中，10000r/min离心1min，去上清，如量少可重复一次。
在沉淀中加入150μL溶液Ⅰ，充分混匀，室温下放置10min.1)加入200μL新配制的溶液Ⅱ，混匀。
冰上放置5min。
SDS使细胞壁破裂，并使蛋白变性。
2)加入150μL冰冷的乙酸钾。
混匀，冰上放置15min。
乙酸钾能沉淀SDS 和SDS与蛋白的复合物。
3)10000 r/min离心5min，上清液倒入另一干净的离心管中。
4)向上清液中加入等体积的酚/氯仿（1：1，V/V）混匀，10000 r/min离心2min，将上清转移到新的离心管中。
5)上清液中加入两倍体积无水乙醇，混匀，室温放置2min，10000 r/min 离心5min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
6)加0.5mL70%乙醇，混匀，10000 r/min离心2min，室温自然干燥，可放在-20℃保存。
7)将质粒DNA溶于20μL TE缓冲液，加4μL凝胶加样缓冲液。
（取8μL 点样）。
（二）质粒DNA酶切及分离鉴定1.制备琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖，放入三角瓶中，加入30mL 0.5×TBE缓冲液，置水浴中加热至融化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液。
2.板的制作1）取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用透明胶将有机玻璃内槽两端封好。
2）将内槽放于水平位置，并放好梳子。
3）将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶，缓慢倒入内槽，注意不要形成气泡。
4）胶凝固后取出梳子，取下透明胶，内槽放入电泳槽内。
5）加入电极缓冲液（1×TBE）3.点样按下表加入样品。
表1 DNA酶解加样表4.电泳1）接通电源（注意正负极，DNA片断从负极向正极移动），电压调到最大100V.2）当溴酚兰燃料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。
5.染色将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染液中，染色后观察。
实验二感受态细菌的制备与质粒DNA的转化（3学时）一、实验目的学习掌握氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞，以及质粒转化的方法。
二、实验原理转化指外源性DNA被宿主细胞摄取以实现遗传物质转移的过程，能摄取外源DNA的细胞称为感受态细胞。
被转化的细胞称为转化体，而被摄取的DNA称为转化因子。
转化因子不同，转化能力也不同。
感受太细菌可以通过物理或化学方法来制备。
物理方法是通过电击使细胞膜的通透性发生暂时性的改变而使DNA 分子导入细胞；化学方法是通过一些金属离子细菌细胞膜的通透性发生改变，通常采用CaCl2 处理细菌使其成为感受态细菌：用冰冷的CaCl2溶液处理细菌后，作短暂加热。
可使细菌细胞膜的通透性发生改变。
即受体细胞产生“感受态”在此期间它们能摄取各种不同来源的DNA，通过这种方法可以用质粒DNA转化细胞。
三、实验用品1.LB液体培养基 200 ml2.50mM的CaCl2附：LB液体培养基配方：胰蛋白胨（tryptone） 2g酵母提取物（Yeast extract） 1g氯化钠（NaCl） 1g 加H2O至 200ml琼脂 2.8 g LB固体培养基：（浓度1.4%）四、实验步骤（一）感受态细菌的制备1．取37°C培养过夜的细菌40ul加入到4ml的LB液体培养基中，于37°C摇床，220转/分培养2.5小时。
2．培养好的细菌1500转/分离心10分钟，弃上清，留取细菌沉淀。
3．在细菌沉淀中加入预冷的50mM的CaCL2 1ml ，指弹法打匀，冰上放置15分钟。
4．再次1500转/分，离心10分钟，弃上清液。
5．再向沉淀中加入200μl 预冷的CaCL2溶液，混匀（在冰上操作），此为感受态细胞。
（二）质粒的转化1．在200μl感受态细胞中加入5μl pUC19质粒，混匀后冰上放置30分钟。
2．立即放42°C水浴中热休克90秒，再放冰上1—2分钟。
3．快速加入800μl 的液体 LB培养基，轻轻摇均，37°C温育1小时。
4．温育结束，铺平皿。
每管铺2个平皿，既含氨苄青酶素Amp（浓度为6mg/ml）和不含氨苄青酶素两种平皿，在平皿上做好标记，混匀后室温放置15分钟。
5．将200μl感受态细胞涂在含有Amp的平板培养基上。
6．37℃培养箱中倒置培养12-16小时后出现转化菌落。
五、思考题1.说明质粒的种类。
2.制备感受态细胞的方法有哪些？实验三 DNA重组（6学时）一、实验目的通过本实验学会重组DNA连接以及鉴定重组子的方法。
二、实验原理外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。
重组的DNA分子是DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物；然后，酶-AMP复合物再结合到具有5′磷酸基和3′羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后，产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过（牛小肠碱性磷酸酶）CIP处理克服。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。
但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。
因此人们找到了一个折中温度，即12~16℃，连接12~16 h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。
利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。
现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其α肽链的DNA序列，此结构称为lac Z′基因。
Lac Z′基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。
宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。
Lac Z′基因编码的α肽链与失去了正常氨基端的β半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为α互补。