吞噬细胞吞噬功能的检测
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定,实验报告（共2篇）
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定,实验报告(共2篇)实验6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察实验6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察姓名：李思露学号：131140040一、实验目的1. 通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察,加深理解细胞吞噬作用的过程；2. 了解巨噬细胞吞噬能力检测的形态学方法二、实验原理吞噬作用也称为胞吞作用（cellular eating），指细胞通过质膜内陷形成内吞泡的方式吞入不能渗透过膜的较大固体物质（直径一般大于250mm）的过程。
许多原生动物通过吞噬作用摄取营养；高等动物体内的巨噬细胞和嗜中性粒细胞的吞噬作用成为动物体非特异性免疫的重要组成部分。
不同动物来源的巨噬细胞或同一动物来源的不同巨噬细胞吞噬功能强弱不同，个体吞噬细胞的平均吞噬能力是机体非特异性免疫功能强弱的重要反映。
吞噬细胞细胞膜上有识别某些病原体相关分子及凋亡细胞磷脂酰丝氨酸等配体的受体，可以使巨噬细胞识别结合病原体、凋亡细胞及其它异物，引起受体胞内区活化，进而导致与其相连的细胞骨架重排引发吞噬作用。
内吞内吞体吞噬溶酶体胞吐巨噬细胞吞噬自身衰老凋亡细胞而不吞噬正常细胞，原因是，凋亡细胞细胞膜内侧面的磷脂酰丝氨酸反转到胞膜外侧面而被巨噬细胞模式识别受体识别。
吞噬功能一般用吞噬百分率和吞噬指数两个指标反映。
吞噬百分率＝吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数/巨噬细胞总数×100％吞噬指数＝吞噬的鸡红细胞总数/吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数三、实验材料、试剂及器材（一）材料：1. 健康小白鼠：6-8周龄健康小白鼠，实验前1~2天，每只腹腔注射4％淀粉肉汤1mL。
2. 抗凝鸡血（二）试剂:1. 4%淀粉肉汤2. D-Hanks液3. 0.85％生理盐水4. 180IU/mL肝素钠生理盐水溶液（三）用品普通光学显微镜、10mL低速离心机、托盘天平、水浴箱（37℃）、5mL一次性注射器、10mL玻璃离心管、试管架、胶头滴管等四、实验操作1. 巨噬细胞收集：脱颈处死小鼠；腹腔注入2mL生理盐水，揉匀；剪开腹部皮肤，暴露腹膜；用带(转载于: 写论文网:)针头的注射器插进腹腔吸取腹腔液。
巨噬细胞吞噬功能检测
肿瘤
肿瘤是指机体细胞异常增生形成的肿块，巨噬细胞在肿瘤的发生和发展过程中也起着重要作用。巨噬细胞能够通过吞噬作用 清除受损或变异的细胞，防止肿瘤的形成。
当巨噬细胞吞噬功能异常时，机体对肿瘤细胞的清除能力减弱，容易引起肿瘤的发生和恶化。例如，某些肿瘤细胞能够逃逸 巨噬细胞的吞噬作用，在体内迅速增殖，形成恶性肿瘤。
巨噬细胞能够释放出生长因子等生物 活性物质，促进受损组织的修复和再 生。
参与免疫应答
巨噬细胞是机体免疫系统的重要组成 部分，能够通过吞噬、加工和呈递抗 原，激活淋巴球和抗体反应，参与免 疫应答。
吞噬作用的过程
01
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03
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识别和接触
巨噬细胞通过识别被吞噬物质 的表面特征，与其接触并形成
吞噬泡。
内陷和形成吞噬泡
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巨噬细胞通过与被吞噬物 质的特异性受体结合，对 其进行吞噬。
免疫吞噬
巨噬细胞通过识别抗原， 对其进行吞噬并加工呈递， 参与免疫应答。
02 巨噬细胞吞噬功能的检测 方法
荧光染色法
总结词
荧光染色法是一种常用的巨噬细胞吞噬功能检测方法，通过荧光物质标记被吞噬的物质，在荧光显微镜下观察荧 光信号的强弱，判断巨噬细胞吞噬功能。
IL-1、IL-6和IL-10等细胞因子可以影响巨噬细胞的吞噬活性。IL-1通常促进吞 噬作用，而IL-6和IL-10则可能抑制吞噬功能。
肿瘤坏死因子（TNF）
TNF-α对巨噬细胞吞噬功能的影响较为复杂，低浓度时可促进吞噬，而高浓度 时则可能抑制。
免疫抑制剂
糖皮质激素
糖皮质激素如地塞米松、泼尼松等 是常见的免疫抑制剂，它们可以抑制 巨噬细胞的吞噬功能，这与其抗炎和 免疫抑制作用有关。
吞噬作用
巨噬细胞吞噬水平的检测（1）实验原理：中性红是大分子的荧光试剂，在波长550nm 有强吸收峰。
由于中性红分子量较大，只能通过内吞作用才能被摄取进入巨噬细胞胞内，所以通过测量不同刺激和药物条件下细胞内中性红量来衡量巨噬细胞的吞噬功能。
本实验利用活巨噬细胞细胞所具有的吞噬活性，将大分子中性红内吞进入细胞内，去除胞外未被吞噬的中性红并用细胞裂解液破损细胞，放出溶解在细胞内的中性红，通过酶联免疫检测仪测出550nm 的光吸收值（A 550），被吞噬的中性红的量与A 550值成正比，所以可以用A 550衡量吞噬细胞的吞噬水平。
这种方法灵敏度较高，是目前较为常用的检测巨噬细胞吞噬能力的一种手段。
药物的恢复率recovery rate 由下面公式计算给出：%100ΑΑΑΑ1rate%recovery ATP 550control 550sample 550control 550⨯⎪⎭⎫ ⎝⎛---=,,,,。
其中A 550，control 为无处理对照组的中性红吸光值；A 550，sample 为加药样本的吸光值；A 550，ATP 为只加刺激的阳性对照吸光值。
（2）实验步骤：通过不同浓度药物孵育的巨噬细胞实验组和参照组中，加入不同刺激，摇匀后再加入无菌（需要抽滤）中性红（最终质量分数为0.1%）。
恒温培养箱中培养30min 让巨噬细胞充分吞噬。
取出细胞用HBSS 溶液清洗2遍以清除残留在胞外未被吞噬的中性红。
加入细胞裂解液（1:1=乙醇：乙酸），震荡15min 使细胞破裂，放出已被吞噬的中性红。
酶联免疫检测仪测出每个样本孔在550nm 的光吸收值（A 550），以表示每个样本内巨噬细胞的吞噬活性。
文献报道35mm 的培养皿中种植500K 细胞，一，加入60000K/皿尼罗红荧光微球（1um 大小），加入ATP 或其他刺激，37℃孵育30 min.二，然后用含有1％血清的PBS 洗三次.,加入胰酶 1000R/5min 用流式细胞仪检测（654~606nm ），并且可以分选到符合吞噬标准的细胞.三，将收集到的细胞铺到盖玻片上，用4％的多聚甲醛固定15min.四，用1ug/ml DAPI(溶于PBS)进行核染色1min ，在荧光显微镜下观察。
项目十九吞噬细胞功能检测
项目十九吞噬细胞功能检测一、中性粒细胞吞噬功能测定(Neutrophil phagocytosis assay)(一)吞噬试验【实验原理】中性粒细胞具有吞噬功能，当与颗粒物质(如金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌等)混合孵育一定时间后，颗粒物质被吞噬。
根据吞噬率和吞噬指数可反映该细胞的吞噬功能。
【试剂和器材】1．试剂20%FCS RPMI-1640培养液、pH6.4 0.015mol/L PBS、Wright染液、金黄色葡萄球菌培养物、抗凝剂(4g/L柠檬酸钠溶液)。
2．器材37℃温箱、显微镜、滴管、一次性采血针、微量细胞培养板、无菌干棉球、酒精棉球、碘酒棉球、接种环等。
【步骤和方法】1．热灭活葡萄球菌悬液配制取金葡菌24h琼脂斜面培养物，用无菌生理盐水洗下菌苔，用PBS洗涤2次，100℃加热15min灭活。
取热灭活金黄色葡萄球菌混悬于20% FCS RPMI-1640培养液中, 用比浊法调整浓度至6×107/ml。
4℃保存，备用。
2．于微量细胞培养板孔内加1滴(约50μl)抗凝剂，无菌采人末梢血2滴(约100μl)与抗凝剂混匀。
3．向孔内加6×107/ml金黄色葡萄球菌悬液2滴(约100μl)，混匀。
4．置37℃烛缸或5% CO2孵箱内培养30min。
5．取1滴培养液推片，自然干燥，Wright染色，水洗，干燥，油镜镜检。
【结果判定】计数200个中性粒细胞，并分别记下吞噬细菌的细胞数和各个细胞吞入的细菌数。
计算吞噬率和吞噬指数：200个中性粒细胞中吞噬细菌的中性粒细胞数? 100％200200个中性粒细胞吞噬的细菌总数200【注意事项】1．所用器材要洁净。
2．越接近片子末梢细胞数越多，计数时应取片子前、中、后三段计数，以提高准确性。
3．抗凝剂用量要适当，过高则抑制吞噬功能，过低使血液凝固。
【方法评价】此法易操作、不需特殊设备，省时，费用低廉。
结果直观，可用于评价其他方法获得的结果，但是光学显微镜分辨率低，有时难以计数吞入的细菌颗粒。
实验二 腹腔巨噬细胞吞噬功能检测方法
实验方法
5.取出玻片，漂洗去上清液和末粘附在玻片上 的细胞。 6.室温下晾干或用吹风机吹干载玻片，Giemsa 染液染色5~l0min，冲洗去多余染液，晾干。 7.高倍镜或油镜下观察并计数100~200个巨 噬细胞中有多少个巨噬细胞吞噬了鸡红细胞， 计算出吞噬百分率和吞噬指数。
实验注意事项
1. 37℃孵育后的漂洗标准是：在显微镜下 检查无重叠细胞层，且水流不要过急以 免将贴附在玻片上的巨噬细胞冲掉。
2. 实验试剂： ① Alsever’s溶液 ② Hank’s液 ③ 0.9%生理盐水(灭菌)
实验用品
④ Giemsa染液 ⑤ 甲醇 ⑥ 肝素钠溶液 ⑦ 0.6%环磷酰胺溶液
实验材料
1. 小白鼠。 2. 1%鸡红细胞悬液：
自健康鸡采血5ml，放入盛有20ml Alsever溶液 瓶中，混匀后置4℃冰箱保存备用。使用前，取用 Alsever’s 液保存的新鲜鸡血5ml ， 加入8ml 的 0.85% 的生理盐水，小心混匀，1500 r/min 离心 10min，如此洗涤2次，最后用生理盐水配成1%的鸡 红细胞悬液。
3. 轻揉小鼠腹部约lmin，剪开腹部皮肤,肌 肉层上开口，将滴管伸入腹腔吸出腹腔液， 置于滴有肝素钠的离心管中（同一组小鼠腹 腔液放入同一管中）混匀。 4.把腹腔液滴加在洁净的载玻片上，每片0.1～ 0.2ml，每组重复作片3 ～5片；将载玻片置于 带盖解剖盘中(盘底部放2~3盒湿沙布)，37℃ 培养箱孵育30min。
实验原理
巨噬细胞在机体的非特异性免疫中具有重 要作用，其吞噬异物的能力在一定程度上反映 了机体免疫水平的高低。本实验采用测定小鼠 腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率和吞 噬指数，来评价免疫抑制剂环磷酰胺(CYP)对 机体免疫状态的抑制作用。
荧光乳胶微粒法检测巨噬细胞吞噬实验技术方法
荧光乳胶微粒法检测巨噬细胞吞噬实验
（1）将巨噬细胞以50%密度接种于六孔板中，待细胞贴壁后，给予干预处理，并设对照组，干预后弃去培养基。
（2）将细胞与乳胶珠粒（10μL乳胶珠稀释于2mL DMEM中）共孵育2小时。
（3）用1×PBS洗3次，目的是洗掉没有被吞噬的乳胶粒。
流式细胞法
（4）收集细胞，1200r/min，离心5min，弃上清液。
（5）1×流式Buffer重悬细胞，1200r/min，离心5min。
（6）细胞计数，每组调整细胞个数为1×106个细胞，1200r/min，离心5min。
（7）弃上清，加入1×流式Buffer 重悬细胞，清洗2次，1200r/min，离心5min。
（9）弃上清液，加入500μl 1×流式Buffer 重悬细胞，等待上机流式细胞仪检测。
荧光显微镜法
（1）将巨噬细胞以50%密度接种于含细胞爬片的六孔板中，待细胞贴壁后，给予干预处理，并设对照组，干预后弃去培养基
（2）将细胞与乳胶珠粒（10μL乳胶珠稀释于2mL DMEM中）共孵育2小时。
（3）用1×PBS洗3次，目的是洗掉没有被吞噬的乳胶粒。
（4）加入4%多聚甲醛固定30min。
（5）弃甲醛液，加入1×PBS 洗涤5min×3次。
（15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核5min。
（16）1×PBS 洗涤5min×3次。
（17）用抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察并保存图像。
实验四巨噬细胞吞噬现象的观察
• 1．小鼠腹腔注射1％旳鸡红细胞悬液1ml，轻揉 腹部使鸡细胞分散。
• 2 ． 15～20分钟后，用颈椎脱臼法处死小鼠。 • 3 ．将小鼠置于解剖盘中，剪开腹腔，把内脏推
向一侧，用吸管吸收腹腔液，滴在载玻片上，加 盖玻片。显微镜下观察。
五、作业
• 绘制小鼠巨噬细胞吞噬鸡血红细胞旳过程 图。
三、试验用具
• 1．器材 • 显微镜、解剖盘、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、
注射器、吸管、吸水纸 • 2．试剂 • 生理盐水、Alsever溶液、4％台盼蓝染液 • 3．材料 • 小白鼠、1%鸡血红细胞。
四、试验ห้องสมุดไป่ตู้节
• 试验前一天取小白鼠腹腔注射6％淀粉肉汤液(含 台盼蓝)1毫升（连续注射三天效果很好）。
试验四 巨噬细胞吞噬现象旳观察
一、试验目旳
• 1. 观察巨噬细胞旳吞噬活动。 • 2. 掌握小鼠腹腔注射给药和脱颈椎处死措
施。
二、试验原理
• 高等动物具有大小两类吞噬细胞(即巨噬细 胞和嗜中性粒细胞)，专司吞噬作用，为非 持异免疫功能旳主要构成部分。
• 小鼠腹腔腹腔注射 淀粉肉汤液，可诱导巨 噬细胞。
流式细胞术检测巨噬细胞吞噬功能的方式成立
流式细胞术检测巨噬细胞吞噬功能的方式成立【摘要】目的：成立用流式细胞术检测小鼠腹腔诱导的巨噬细胞吞噬功能的方式。
方式：用贴壁法挑选有活性的巨噬细胞，再与用碳酸盐缓冲液制备的荧光素(FITC)标记的大肠埃希菌混合，37℃孵育，每10min取少量固定后加EB染巨噬细胞核，用流式细胞仪检测，计算巨噬细胞对大肠埃希菌的吞噬率。
结果：FITC能够有效标记大肠埃希菌；小鼠腹腔诱导的巨噬细胞能够吞噬大肠埃希菌，而且在30min 时达到最大峰值。
结论：用流式细胞术检测小鼠巨噬细胞吞噬FITC 标记大肠埃希菌是测定巨噬细胞吞噬功能简便、快速和重复性好的定量方式。
【关键词】巨噬细胞吞噬作用大肠埃希菌流式细胞仪Establish a New Method of Detecting Phagocytosis of Macrophage by Flow CytometryAbstract Objective: To use a new method of detecting phagocytosis of macrophage induced from the Belly of mouse by flow cytometry. Methods: Firstly, the living macrophages were collect by cultivating and adherencing, and bacterium coli(E. coli) was labeled FITC. Secondly, E. coli was mixed withmacrophages, every 10 minute to take out of small amounts of mixed liquor,and add a little of EB dye. Finally, the fluorescent intensity was measured by flow cytometry. Results: The E. coli was labeled well by FITC in carbonate buffer. Macrophage can phagocytize E. coli and the efficient rat of phagocytosis was highest about at 30 minute. Conclusion: The method that detecting phagocytosis of macrophage phagocytizs E. coli is convenient、fast、good repeatability.Key words macrophage; phagocytosis; bacterium coli; flow cytometry巨噬细胞(macrophage，MP)是机体天然免疫的要紧免疫细胞，吞噬率那么直接反映巨噬细胞的吞噬功能。
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吞噬细胞吞噬功能的检测
一、小吞噬细胞的吞噬作用
(一) 体内法
［材料］
(1) 动物：豚鼠。
（2）菌种：金黄色葡萄球菌菌液。
（3) 无菌注射器及针头、无菌肉汤、玻片、瑞氏染液。
［方法］
（1）第1天注射无菌肉汤10 ml 于豚鼠腹腔，隔24 h 同法注射肉汤5 ml。
20 min 后，再注射金黄色葡萄球菌菌液Iml 于上述部位。
(2）注射完毕，每隔20 min 用注射器抽取腹腔液，并做推片，待其自千后，用瑞氏染色法染色，镜检时见金黄色葡萄球菌被小吞噬细胞吞入胞浆时为宜.
(3) 瑞氏染色方法如下：将瑞氏染液滴加数滴于涂片上。
加入等量的蒸馏水，轻轻混匀，染5 -10 min。
用蒸馏水(或自来水）冲洗。
待干或轻轻用吸水纸将涂片吸干，油镜检查.
[结果］
染色后，可见小吞噬细胞的核及被吞噬的细菌呈深紫蓝色，而小吞噬细胞的胞浆为紫色.
（二）体外法
[目的]
1。
熟悉检测白细胞吞噬作用的原理与实验方法。
2.通过吞噬细胞的吞噬功能检测了解机体的非特异性免疫功能。
3。
掌握显微镜、油浸镜的使用与保护方法。
[原理]
中性粒细胞具有在噬杀菌功能，当与颗粒物质(如金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌等)混合后，孵育一定时间，颗粒物质被中性粒细胞吞噬.根据吞噬率和吞噬指数可反映该细胞的吞噬功能，但不能反映其杀伤功能。
［材料］
(1) 3。
8％枸橼酸钠。
（2）碘伏、无菌注射器及针头、吸管、试管、载玻片、温箱等.
（3)瑞氏染液
(4）葡萄球菌悬液: 取白色葡萄球菌在琼脂斜面上生长24 h的培养物，用无菌生理盐水刮洗下菌苔,用PBS洗涤2次，最后用比浊法将菌液调整至5 x107ml 悬液，100℃加热15min，置4℃冰箱备用。
［方法]
(1) 自静脉采血0.2 m,放于含3。
8% 枸橼酸钠0.2 ml的小试管中，混匀，防止凝血(或由一人抽血10 ml 抗凝，供全小班使用)。
(2）取葡萄球菌悬液0。
2 ml，加于上述血液中混匀.
(3）37 C温箱孵育30min，每10 min取出振摇1次,再继续静置孵育，于30 min 时取出。
（4）用毛细管从白细胞层（即沉淀红细胞的表层) 吸取白细胞1滴,滴在载玻片上，推成薄片，自然干燥.注意：推制厚薄适宜的血膜片，血膜应呈舌状，头、体、尾清晰可分；推制好的血膜应在空气中晃动，以促进快干；天气寒冷或潮湿时，应于37 C温箱中保温促干,以免细胞变形缩小。
(5) 瑞氏染液染色可用30s快速单一染色法：将染液铺满血膜，30 s以后用自来水冲洗。
切勿先将染液倾去再冲洗，以免染液中的细小颗粒附着于玻片上使标本观察不清晰。
（6) 干燥后油镜检查，寻找白细胞，计数。
[注意]
应选择涂片的体尾交界处染色良好的区域进行计数，由血膜边缘向中央依次上、
下呈曲线运动，以免重复计数（图2-2)。
[结果］
染色正确时，可见细胞核及被吞噬的细菌染成紫色,而白细胞的细胞浆则染成红色。
计数200 个中性粒细胞，记下吞噬细菌的细胞数,以及每个中性粒细胞吞入的细菌数，分别求出吞噬百分率以及吞噬指数。
其计算公式为:
200个中性粒细胞中吞噬细菌的细胞数
吞噬率(％）= ×100％
200
200个中性粒细胞吞噬细菌的总数
吞噬指数(％）= ×100％
200
二、大吞噬细胞的吞噬作用
［材料］
（1)动物: 豚鼠。
(2）10％鸡红细胞悬液、2％无菌可溶性淀粉溶液。
（3）无菌注射器及针头、玻片、瑞氏染液。
[方法］
(1) 注射2% 可溶性淀粉液10 m于豚鼠腹腔内。
（2）次日重复腹腔注入2％可溶性淀粉溶液5 ml，1h后再腹腔注人10% 鸡红细胞悬液3ml。
（3) 鸡红细胞悬液注入后，每隔20mn用空注射器抽取豚鼠腹腔液至1h，并做推片，待其自干（或用甲醇固定了3min，水洗)，用瑞氏染色法染色(其方法同前）,镜检见鸡红细胞被大吞噬细胞吞噬入胞浆内为宜。
［思考题]
影响吞噬细胞吞噬的实验因素有哪些？。