腺病毒中文操作手册
实验室生物安全手册(1)
目录批准 3 修订页 4 实验室生物安全手册说明 5 实验室生物安全方针和目标 6 管理要求74.1概述74.2法律地位74.3组织机构74.4管理体系职责分配74.5关键岗位职责9附录A 实验室生物安全组织机构框图10 附录B 验室生物安全体系要素职责分配表10 附录C 实验室生物安全管理制度11 危害程度分级和风险评估135.1危害程度分级135.2风险评估13 生物安全水平分级和防护屏障166.1实验室生物安全防护水平分级166.2生物安全防护屏障16 设施和设备要求177.1 BSL-1实验室17 个人防护装备198.1人员防护198.2实验服、隔离衣、连体衣、围裙198.3护目镜、安全眼镜和面罩198.4防毒面具208.5手套20 良好的内务行为219.1生物安全实验室良好的内务行为219.2生物安全实验室特殊的良好工作行为229.3生物安全实验室的清洁24 化学品安全2510.1暴露途径2510.2化学品的储存2510.3不相容化学品的一般原则2510.4化学品的毒性作用2510.5爆炸性化学品2610.6化学品溢出26 电气设备2711.1仪器用电2711.2维修与维护271消防安全2912.1防火2912.2灭火3012.3消防训练30 废弃物处理3213.1废弃物处理3213.2清除污染3213.3高压灭菌器使用注意事项3213.4污染性材料和废弃物的处理和丢弃程序3313.5锐器3313.6高压灭菌后重复使用的污染（有潜在感染性）材料3313.7废弃的污染（有潜在感染性）材料342批准页伊春市南岔区动物疫病防控中心(简称中心)为实施、保持和改进中心的生物安全体系, 确保实验室生物安全, 适用法律法规和满足顾客要求, 增强顾客满意度, 实验室依据《病原微生物实验室生物安全管理条例》等法规, 并结合中心实际而编制《实验室生物安全手册》。
《实验室生物安全手册》阐明了中心的生物安全方针和生物安全目标的具体要求, 是建立、运行和保持生物安全体系的纲领性文件, 是开展质量管理、技术运行和支持服务活动的行为准则, 也是对客户作出承诺, 全体员工应遵照执行。
八年级生物上册知识点归纳知识背诵手册(人教版)
班级姓名消化：内胚层细胞围成消化腔，消化食物，有攻击与防御：外胚层有刺细胞，是腔肠动物特有攻击和防御利器，布最多珊瑚礁生活环境：淡水中体型：左右对称（两侧对称）结构：身体前端呈三角形，头部背面有两个黑色的眼点结构图：消化：口中有咽，有口无肛门生殖：大多数扁形动物生殖器官发达，寄生在人和动物体内其他种类：华枝睾吸虫、血吸虫、绦虫主要特征：身体呈两侧对称；背腹扁平；有口无肛门与人类生活的关系：人若进入含有钉螺的水域，就有可能感染血吸虫病涡虫扁形动物感染：喝了带有蛔虫卵的生水，吃了沾有蛔虫卵的生的食物，或用沾了蛔虫卵的手拿食物等生活习性：蚯蚓生活在潮湿、疏松、富含有机物的土壤中。
白天在土壤中穴居，以泥土中的有机物为食物；夜间爬出地面，取食地面上的落叶。
形态结构：身体呈圆筒形，身体分节，前端有环带运动：依靠肌肉和刚毛的配合蠕动呼吸：依靠湿润的体壁呼吸结构图：其他种类：沙蚕、水蛭主要特征：身体呈圆简形，由许多彼此相似的体节组成；靠刚毛或疣足辅助运动与人类生活的关系：沙蚕可作鱼、虾、蟹的食饵；蛭的唾液中提取的蛭素可用来生产抗血栓药物；蚯蚓可疏松土壤，提高土壤肥力，同时还是优良蛋白质饲料。
蚯蚓环节动物：乌贼、石鳖、蜗牛等柔软的身体表面有外套膜，大多具右贝壳，会颈部：可以使头灵活转动四肢：短小，贴地爬行皮肤：覆盖角质的鳞片，保护身体、减少体内水分的蒸发呼吸：用肺呼吸生殖：体内受精，产大型有壳卵，摆脱了对水的依赖结构图：体表覆盖角质的鳞片或甲用肺呼吸在陆地上产卵，卵表面有坚韧的卵壳人工养殖的鳖可以食用，鳖甲可以入药蛇毒也能治病，毒蛇受到刺激的时候会攻击人类避役等能捕食昆虫与人类生活的关系蜥蜴主要特征爬行动物用常见的运动形式：行走、奔跑、爬行、游泳、飞行等骨骼：骨与骨之间通过关节等方式构成及其外面的韧带有增强关节牢固性的作用内的滑液和关节软骨具有增加关节灵活性的作：指关节头从关节窝里脱落出来。
肌腹：骨骼肌中间较粗的部分肌腱：两端较细的呈乳白色的部分一块骨骼肌两端的肌腱着生在至少两块骨上动物的运动关节运动系统的组成骨骼肌骨、关节和肌肉的关系骨：杠杆作用关节：支点作用骨骼肌：动力作用形成基础：由体内遗传物质决定获得途径：生来就有的时间性：常伴随动物一生形成基础：在遗传因素的基础上，通过环境因素的作用形成获得途径：由生活经验和学习获得时间性：可建立或消退二者联系：学习行为是在先天性行为的基础上形成的。
293细胞转染操作方法
每孔加入 DNA 的量 * 每孔 DNA 稀释液体 积 每孔 Entranster TM H 用量 * Entranster TM -H 稀释液体 积 每孔培养 基总量 96-well 0.25 μμ l 0.25 μ l 5 μ l 214 μ l 25 μ l- 500 μ l 12 well 2 μ g 25 μ l 2 μ l 25 -μwelll1/3m5l-6mm3μ g 50 μ l 3 μ l 50 μ l 2ml 60 mm/T25 flask8 μ g 125μ l 8 μ l 125 μ l 5ml 100 mm/T75 flask μμμμ 注意 :如用于同时共转染多种质粒 , DNA 的用量指每种质粒用量的总和 ,这时如 需得到较高转染 效率 ,建议将 DNA 的用量和转染试剂的用量同步提高 2-4 倍。 四 优化 由于 DNA 和转染试剂的用量比值是决定转染效率的重要因素 , 同时由于各实 验室质粒 的定量误差 ,质粒纯化程度不同以及细胞状态不同 ,造成不同细胞和实验室
第 3页 共 3页 稀释用溶液含血清或蛋白 建议采用 OPTI-MEM 或无血清 DMEM 稀释。
质粒表达系统毒性大 建议采用其他可靠质粒做阳性对照 ,比较转染结果 细胞密度太大 建议减少细胞数量 DNA 与转染试剂比例不佳 建议预实验优化 细胞毒性 细胞污染 建议彻底清洁所有细胞培养相关用品 六 储存与安全 本品常温运输 ,储存于 4℃,有效期 12 个月。 本品使用安全 ,未发现任何生物、化学毒性。如不慎沾染 ,用清水冲洗即可。 七 其他相关试剂 Entranster TM -D :将 DNA 高效低毒转染入动物细胞。 Entranster TM -R :将小片断 RNA(siRNA 、 miRNA 、 mimic 、 inhibitor 等 转 染入动物细胞。 Entranster TM -in vivo:RNA 和 DNA 的动物体内转染。 Envirus TM : 病毒感染增强系列试剂 ,可增强慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和逆 转录病 毒等的感染效率。 Enlight TM : 超稳定、高灵敏 ECL 发光试剂。 八 质量保证 北京英格恩生物科技有限公司对 Entranster TM -H 转染试剂的每批产品实行严 格质量检 验,并进行转染验证 ,以确保产品质量。请用户使用前务必认真阅读本手 册。 九 使用限制
人nm23-H1基因重组腺病毒载体的构建与鉴定
Ｈｏｐｔｌｆ ｎｆｎ ｔｒ ｏ Ｌｄ Ｈｕｅ ４ ０４ Ｃ ｉａ ｓｉ Ｄｏｇｅｇ ａｏ Ｍｏｏ ． ｔ． ｂ ｉ １ ０ ， ｈｎ Ｊ Ｃ ４
【 ｓｒ ｃ】 Ｏｂ ｅ ｔ ｅ Ｔ ｏ ｓ ｕ ｔ ｃ ｍｂｎ ｎ ａ ｅ ｏ ｉ ｓ ｅ ｔ ｏ ｔｉ ｎ ｕ ｎ ｎ ３Ｈ１ｇ ｎ ｎ ｅ ｔ ｙｉ ｉ Ａｂ ｔａ ｔ ｊ ｃｉ ： ｏｃ ｎ ｔ ｃ ａｒ ｏ ｉａ ｔ ｄ ｎ ｖ ｃ ｒ ｎａ ｉｇ ｈ ｍａ ｍ２ 一 ｅ ｅａ ｄｉ ｎｉ ｖ ｒ ｅ ｕ ｒ ｖ ｏｃ ｎ ｄ ｆ ｔｎ
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中 老年 腔医 志２ １ 年 １ 第 ｌ 卷第 １ 华 口 学杂 ０２ 月 Ｏ 期
Ｆ Ｎ ｏ ｇ ｑ ， ＨＯＵ Ｗ ｉ ｂｎ ， ＡＯ Ｌ 卡 ｎ ， Ｈ ｅ Ａ Ｇ Ｚ ｉ ｙ ｎ ． ｆ ｐ ｒ ｎ ｆＤｅｔ ｔ ， ｉ ｇ ｎ Ａ Ｈｎ －ｕＺ ｅ － ｉ Ｈ ｕ ｇ ｇ Ｓ ＡＯ Ｌ ｉ ，Ｗ Ｎ ｈ — ｏ ｇ Ｄｅａｔ ｔ ｍｅ ｏ ｎｉｒ Ｘａ ｆ ｓｙ ｎａ
ｈａ ｅ ｕ ｃ ｓ ｆ ｌ ｏｎ ｔｕ ｔ ｄ ｐｒ ｖｅ ｙ ｄ ｂｅ ｎ ｓ ｃ ｅ ｓｕｌｙ ｃ ｓｒ ｃ ｅ ｏ ｄ ｂ ＰＣＲ ａ ａｙｓｓ ｎｚ ｅ ｉ ｅ ｔｏｎ ａ ｎ ｌ ｉ，ｅ ｙｍ ｄ ｇ ｓｉ ｎｄ ＤＮ Ａ ｓ ｑ ｎｃ ａ ｌｓｓ ｅ ｕｅ ｅ ｎａｙ ｉ．Ｔｈｅ ｉｕ ｖｒ ｓ
１ ．材 料和 方法
１１试剂和材料 ． Ａｄ ａｙＶ ｅ ｏ ｉ ｌ ｃｏ Ｅ ｓ Ａｄ ｎ ｖｒ ｔｒ Ｍ ａ Ｖｅ
医院感染知识手册(附答案)
医院感染知识手册（附答案）一、前言医院感染是影响医疗质量和患者安全的重要因素之一。
为了提高医护人员对医院感染的认识，加强医院感染管理，保障患者和医务人员的安全，特制定本手册。
以下是关于医院感染的基本知识、预防与控制措施以及常见问题的解答。
二、医院感染基本知识1. 定义：医院感染是指患者在医院就诊、住院期间，或在医院外因医院行为而获得的感染。
2. 分类：医院感染可分为以下几类：（1）交叉感染：患者与患者、患者与医护人员、患者与环境之间的直接或间接传播。
（2）自身感染：患者自身抵抗力下降，原有病原体在体内大量繁殖，导致感染。
（3）医源性感染：由于医疗器械、药品、医疗操作等引起的感染。
3. 常见病原体：医院感染常见的病原体包括细菌、病毒、真菌、寄生虫等。
三、医院感染预防与控制措施1. 加强医院感染管理：建立健全医院感染管理体系，制定完善的规章制度和操作规程。
2. 提高医护人员感染防控意识：加强医护人员培训，提高感染防控意识和技能。
3. 严格执行无菌操作：在医疗操作过程中，严格遵守无菌操作规程，减少感染风险。
4. 加强手卫生：医护人员在接触患者前后、进行无菌操作前后等情况下，必须进行手卫生。
5. 合理使用抗生素：遵循抗生素使用原则，避免滥用和过度使用。
6. 环境清洁与消毒：定期对医院环境进行清洁和消毒，降低病原体传播风险。
7. 医疗器械的清洗、消毒与灭菌：保证医疗器械的清洗、消毒和灭菌质量，防止病原体传播。
8. 患者隔离：对于具有传染性的患者，采取隔离措施，防止交叉感染。
四、常见问题解答1. 如何判断患者是否发生医院感染？答：患者出现以下情况时，应考虑为医院感染：（1）发热、寒战、白细胞计数升高或其他炎症反应。
（2）手术切口感染、肺部感染、尿路感染等症状。
（3）与患者病情不符的症状或体征。
2. 医院感染有哪些传播途径？答：医院感染的传播途径包括：（1）空气传播：如流感、肺结核等。
（2）接触传播：如金黄色葡萄球菌感染、诺如病毒感染等。
IPS技术手册
人类诱导性多能干细胞（iPS细胞）技术指导手册目录：1.前言 (1)2.人类胚胎成纤维细胞培养 (2)3.重编程载体构建 (3)4.病毒包装 (4)5.人类iPS细胞的诱导 (6)6.iPS细胞鉴定 (8)6.1碱性磷酸酶活性检测 (9)6.2干细胞表面marker的免疫染色检测 (9)6.3干性因子的去甲基化程度分析 (11)6.4干细胞内源基因的表达分析 (13)6.5端粒酶活性检测 (14)6.6核型检测 (15)6.7拟胚体形成 (15)6.8畸胎瘤形成实验 (15)7．干细胞技术培训及服务一览表 (15)8．附录 (16)1.前言iPS细胞最初从成纤维细胞重编程而来，因为它们准备和操作相对简单。
其他细胞类型，包括来自外胚层、中胚层和内胚层的细胞也可以用于产生iPS细胞（Eminili et al2008）。
2006年Yamanaka和Takahashi利用逆转录病毒系统在成鼠的成纤维细胞导入四个转录因子（Oct3/4,Sox2,c-Myc,和Klf4，Yamanaka因子），将其重编程为iPS细胞，它具有跟小鼠ES十分相似的特性，尤其重要的是，iPS细胞也能产生后代。
2007年，iPS技术在人类体细胞中得以应用，人类iPS 细胞的产生对退行性疾病的治疗产生巨大的影响（Takahashi et al;Yu et al,2007）。
由于iPS细胞具有和ES类似的功能，却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多瓶颈，因此在医疗领域的应用前景非常广阔，成为干细胞研究的热点，《自然》和《科学》杂志分别将其评为2007年第一和第二大科学进展。
随后，iPS细胞的研究日新月异。
.近几年来，iPS研究方面取得的一系列的重大成果让我们欣喜不已，然而，这才刚刚开始，iPS细胞能真正用于临床惠及大众还面临着很多技术上的问题。
一方面iPS产生的方法有待改进；另一方面iPS细胞的定向分化手段需继续探索。
斯丹赛干细胞生物技术公司拥有成熟稳定的胚胎干细胞/iPS细胞技术平台，将竭力为全国各类进行干细胞/iPS研究的科研机构、高校、相关医疗机构和制药企业等提供高品质产品和优质的服务。
吉玛RNA手册
THE RNAi COMPANYRNAi 产品使用手册上海吉玛制药技术有限公司Shanghai GenePharma Co.,Ltd.Ⅰ. RNAi 简介 1A.RNAi 实验原理B.RNAi 实验流程C.RNAi 实验所需试剂D.上海吉玛 RNAi 相关产品Ⅱ. siRNA 设计7A. 哺乳动物siRNA 设计B. 上海吉玛 siRNA 产品特性C. siRNA oligo 技术数据Ⅲ. siRNA 对照9A.普通阴性对照B.荧光标记的阴性对照C.siRNA 阳性对照D. 转染试剂对照E. 避免off-target 对照Ⅳ. siRNA 转染10A.siRNA 转染的方法B.RNAi-Mate 转染试剂C.RNAi-Mate 适用的细胞类型D.转染前细胞培养E.RNAi-Mate：siRNA/DNA 比例F.贴壁细胞转染程序G.悬浮细胞siRNA 转染程序H.DNA 和siRNA 共转染细胞程序I.体内siRNA 导入方法J.siRNA 转染常见问题与建议Ⅴ. mRNA 水平RNAi 效果监测15A.siRNA 细胞转染条件优化B.Real-Time PCR RNAi 效果检测C.Real-Time PCR 结果分析Ⅵ. 蛋白质水平RNAi 效果监测20A.western-blot 原理B.western-blot 操作步骤C.western-blot 上样液的制备D.western-blot 常用试剂的配制Ⅶ. RNAi 实验常见问题解答22Ⅰ. RNAi 简介A. RNAi 实验原理RNA 干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。
细胞中的核糖核酸酶III 家族成员之一的，dsRNA 特异性的核酸酶Dicer 将dsRNA 裂解成由21-25 个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA 作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。
XXX生物安全风险评估报告
XXX生物安全风险评估报告报告：XXX生物安全风险评估依据《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《实验室生物安全通用要求》、《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》、《医疗废物管理条例》，我们按照检验科制定的《实验室生物安全管理制度》，由医院生物安全委员会主持，生物安全委员会成员参与，对检验科生物安全进行了风险评估，形成报告如下：一、科室基本情况1.专业组：根据检验科的实际情况，按照生物安全二级防护实验室的要求划分实验室区域：临床血液学实验室、临床体液学实验室、临床化学实验室、临床免疫学实验室、临床PCR实验室、微生物实验室、采血室、标本接收室。
2.实验室的环境布局及平面图（见环境分布图）清洁区：包括会议室、办公室、休息室、浴室2个、男女更衣室、管理室、库房。
半污染区：洗刷室、试剂库、中间通道。
污染区：临床血液学实验室、临床体液学实验室、临床化学实验室、临床免疫学实验室、临床PCR实验室、微生物实验室、采血室、标本接收室、洗涤室。
3.任务：承担临床检验、教学及科研。
二、实验室生物安全风险评估一）对生物源危害风险评估临床实验室生物源危害主要是由微生物，尤其是病原微生物引起的。
包括细菌、病毒、寄生虫等。
在实验室内做试验、研究等操作时，实验人员需要处理大量的病源微生物，很容易引起污染。
根据生物污染的对象，为空气污染、水污染、人体污染、物体表面污染等种类。
1．对空气的污染：根据污染空间，可分为实验室内环境空气污染、实验室外环境空气污染。
许多操作可产生气溶胶，是悬浮于气体介质中粒子一般为0.001-100um的固体，液体微子粒子形成胶溶状态分散体系。
当气溶胶不能安全有效地限定在一定范围内，便导致实验室内空气污染。
下述操作可能产生气溶胶：使用涡旋震荡器、用力拍干反应板超声波处理、试液开封、开启冰箱和离心机及舍弃离心后的上清液时、另外动物接种从动物体内采血、清洗注射器、调整液量也可产生。
2．对水的污染：实验中会产生大量污水，医院污水尤其是传染病医院，综合医院传染病房的污水，有大量的有机悬浮物和固体残渣，还不同程度的含有多种细菌、病毒和寄生虫虫卵。
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腺病毒载体操作手册中文版 腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册目 录 第一章 简介 1 第二章 应用重组腺病毒的优点 2 第三章 AdEasyTM 技术 3 技术概况 3 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章 主要流程 4 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 构建重组AdEasyTM转移载体 5 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 共转化的一般原则 5 共转化方法 5 预期结果 5 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞 6
细胞铺板 6
磷酸钙转化技术 7 第五章 常用技术 8 QBI-293A细胞培养 8
QBI-293A细胞的初始培养 8
QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8
QBI-293A细胞的冻存 8 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9
感染QBI-293A细胞 9
病毒空斑形成 9 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 MOI测定 10 腺病毒感染力测定 10 X-Gal染色 11 重组腺病毒的筛选和纯化 11 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 病毒空斑挑选和小量扩增 12 Western杂交 13 Southern杂交和点杂交 13 病毒裂解产物PCR 14 免疫测定 14 功能测定 14 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 15 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16
不连续密度梯度离心 17
连续密度梯度离心 17
病毒溶液去盐和浓集 17 病毒滴度测定 18
nm VP/ml 19
空斑测定法 20
50%组织培养感染剂量法 20 第六章 疑难解答 22 QBI-293A细胞培养 22 感染力测定 22 转移载体克隆 23 在BJ5183细胞中共转化和重组 24 转染QBI-293A细胞 25 筛选和测定 25 在QBI-293A细胞中表达 26 重组腺病毒的扩增 26 纯化 26 病毒滴度测定 27
缩写 英文全称 中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani broth LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection Virus/Cell 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷
第一章 简 介 当今基因输送技术的发展日趋复杂,一些治疗药物生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物和诊断性蛋白单克隆抗体的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具.人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具.为解决这一问题,基因输送技术通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒通过基因工程不断发展,致力于生产基因表型药物.重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂. 1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现.迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒,它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮Fields等,1996.1977年,Frank Graham博士建立了一种细胞株,可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒Graham等,1977.此后,腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用,尤其是在基因治疗相关领域.迄今为止已有大量腺病毒及其应用的综述发表,我们给感兴趣的读者推荐以下文章：Hitt et al,1999和Wivelet al,1999.腺病毒亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白Massie et al,1998 A, B.但迄今为止还只有熟知腺病毒的研究人员才会采用腺病毒系统.昆腾生物科技公司是第一个提供完备而且能广泛应用的重组腺病毒试剂盒Adeno-QuestTM系统及其相关产品和客户服务的公司,这个系统的基础是在293细胞中产生重组腺病毒.现在介绍的AdEasyTM系统以细菌内重组取代哺乳动物细胞He et al,1998,使获得重组腺病毒对任何有细胞培养设备的分子生物实验室都更方便.重组腺病毒事实上可在任何细胞或组织中用来研究表达重组蛋白.AdEasyTM转移载体可允许插入的外源DNA,目前正研究腺病毒其它区的缺失以提高腺病毒在基因治疗中的应用.这本手册提供了重组腺病毒技术中所有必须遵循的原则,并详细描述了产生一个重组腺病毒的所有实验步骤,包括重组腺病毒在QBI-293A细胞中扩增并纯化到1012VP的操作步骤.AdEasyTM载体系统包含了生产5型重组腺病毒所需的全部试剂,所有成分购买后即可使用. 第二章 应用重组腺病毒的优点1. 宿主范围广, 对人致病性低这套腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达.腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞,因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白.2. 在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因逆转录病毒只能感染增殖性细胞,因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行,而必须使细胞处于持续培养状态.腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型,除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞.腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统,它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比.3. 能有效进行增殖,滴度高 这套腺病毒系统可产生1010到1011VP/ml,浓缩后可达1013VP/ml,这一特点使它非常适用于基因治疗. 4. 无需辅助病毒,可容纳 kb外源DNA： 为提供克隆空间,此腺病毒缺失了E1和E3早期区.此外,此腺病毒可包装比正常病毒DNA稍大的DNA分子105%.这些特点允许插入腺病毒的基因或多基因表达盒可达. 5. 与人类基因同源 该腺病毒载体系统应用了人类病毒作为载体,以人类细胞作为宿主,因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境.大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能. 6. 不整合到染色体中,无插入致突变性 逆转录病毒可随机整合到宿主染色体,导致基因失活或激活癌基因.而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中,因此不会干扰其它的宿主基因.在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的系统. 7. 能在悬浮培养液中扩增： 293细胞可以适应悬浮培养,这一调整可使病毒大量扩增.大量事实证明悬浮293细胞可在1~20L的生物反应器中表达重组蛋白.8. 能同时表达多个基因这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统.最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中,或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白.测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况. 第三章 AdEasyTM技术 技术概览 AdEasyTM系统是由等1998构建的用来代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统.在这个系统中,只需二步即可产生重组腺病毒：先将表达盒装入转移载体,然后再通过同源重组插入腺病毒基因组.将外源基因插入腺病毒的最有效途径是通过同源重组,原因是：1腺病毒DNA是大型的线性分子,含有几乎所有的内切酶切位点；2基因组过大36kb,难于操作. 在AdEasyTM载体系统中,含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒,而不是线性DNA,同源重组则在大肠杆菌进行.相对于传统系统而言,这二点改进使病毒DNA操作更容易,同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单.在本系统中,首先将基因cDNA插入一个转移载体,将得到的质粒用PmeI线性化,