酶标仪性能评价与鉴定方法

酶标仪性能评价与鉴定方法的理论基础及其解释

成军孙关忠郑怀竟（南京军区医学检验质控中心、

解放军第117医院检验科杭州310013卫生部临床检验中心）

摘自《陕西医学检验》1998.13(4)12

摘要为提高酶标仪检测结果的室内重复性和增强室间可比性，对已建立的酶标仪性能评价与鉴定的基本方法进行了详细解释和补充，以供同行在评价、鉴定仪器时参考与应用。

关键词酶标仪性能评价鉴定

近年来，酶标仪在临床实验室中的应用越来越普及，使得酶免疫分析法（EIA）的自动化程度及精确性愈来愈高，尤其是近几年，进口的、国产的单、多通道全自动酶标仪的种类及型号发展非常迅猛，是临床实验室自动化程度继生化分析仪、血细胞计数仪、血凝仪等之后的又一次更新和提高。然而，国内外有关酶标仪性能系统评价的方法甚少，有的评价指标简单且不全面，有的对其性能评价所采用的方法不尽一致，导致不同仪器之间、厂家与用户之间、用户与用户之间的评价指标缺乏可比性，这是由于酶标仪在制造工艺（多通道检测器）、测定原理（垂直光路光度测定法）与其它水平光路光度测定的仪器（721分光光度计）之间存在着很大的差别。因此，我们对国内外几个不同厂家和型号的仪器经过系统研究论证，初步建立了一套较为完善的酶标仪性能评价指标与鉴定的基本方法。经初步应用，效果满意，应广大读者和用户的要求，拟将酶标仪性能评价与鉴定方法的理论及其原理作一介绍和补充，以供同行在评价、鉴定和使用仪器时参考，从而为进一步提高检测结果的室内重复性和室间可比性提供可靠的保证。

1.方法与原理

1.1滤光片波长精度检查及其峰值测定

1.1.1方法及其衡量的标准：用高精度紫外可见分光光度计（波长精度±0.3 nm）对不同波长的滤光片进行光谱扫描，检测值与标定值之差即为滤光片波长精度，其差值越接近于零且峰值越大表示滤光片的质量越好，波长精度越高。

1.1.2理论基础：酶标仪的滤光片质量好坏，直接影响仪器的灵敏度高低，而滤光片的质量又是以其波长精度及其峰值指标来衡量的，因此滤光片波长精度及峰值是衡量酶标仪的重要参数之一，这在厂家的仪器说明书中虽未曾提及，但在仪器的实际使用过程中，我们发现对滤光片波长精度和峰值进行检查是重要的也是必要的，通过检查可以发现滤光片的波长标定值与实测值的符合程度，可以发现滤光片的质量是否符合要求。

1.2灵敏度和准确度的监测

1.2.1方法：①灵敏度：精确配制6 ug/ml重铬酸钾（干燥）溶液（0.05 mo1／L 硫酸溶解），加入200 ul重铬酸钾溶液于小孔杯中，以0.05 mo1／L硫酸溶液作空白，

于450 nm（参比波长650 nm）测定，其吸光度应≥0.01 A。②准确度：准确配制：1mmo/L对硝基苯酚（提纯品）水溶液，然后以10 mmo1／L氢氧化钠溶液25 倍稀释之，加入200 ul稀释液于小孔杯中，以10 mmo1／L NaOH溶液作空白，于405 nm（参比波长650 nm）检测，其吸光度应在0.4 A（0.395～0.408 A）左右。

1.2.2说明：仪器的灵敏度和准确度主要受两个因素影响：一是滤光片波长的精度，二是检测器的质量。通常情况下，滤光片原因导致仪器的灵敏度和准确度下降比较容易检查；而检测器质量差异则不易被发现，因此我们采用上述两种标准物质溶液对仪器检测器的质量进行定期监测，从而保证了仪器检测结果的可靠性。对于仪器准确性的测定，我们采用了文献报道的方法，经过多次在不同型号仪器间进行反复测定，结果发现该标准物溶液在450nm波长处有一较为恒定的测定值，由于酶标仪与其它分光光度计的光学原理不完全相同，故是否可以作为评价酶标仪准确性的参考方法还有待同行进一步研究考证。

1.3通道差与孔间差检测

1.3.1方法及其表达方式：①通道差检测：取一只酶标板小孔杯（杯底须光滑、透明、无划痕、无污染）以酶标板架作载体，分别加入三种不同浓度的甲基橙溶液200 ul先后置于8个通道的相应位置，蒸馏水调零，采用双波长（测定波长490nm，参比波长630或650nm，以下均相同）连续测三次，观察其不同通道之间测量结果的一致性可用极差值来表示其通道差。②孔间差的测量：选择同一厂家、同一批号酶标板条（8条共96 孔）分别加入200 ul甲基橙溶液（吸光度调至0.065～0.070 A）先后置于同一通道，蒸馏水调零，采用双波长检测，其误差大小用±1.96s衡量。

1.3.2理论解释：为了提高酶标仪的检测速度，根据96孔酶标板的规格特点，目前大多数厂家的中、高档酶标仪均采用8通道的检测器（部分中、低档酶标仪目前仍采用单通道）．因而它们每个通道的检测能力是不尽相同的，它是仪器内部的固有误差，与所测溶液浓度成正相关（不同检测器对不同浓度溶液的响应能力不同），所以通道差是衡量酶标仪性能良好与否的重要指标之一；其衡量指标用极差表示，这与厂家推荐的指标是一致的；极差值越接近于零，通道差越小，说明同一样品于不同通道检测结果的一致性越好。

由于不同厂家、不同批号酶标板之间的质量差异，导致孔与孔之间的检测结果也不完全一致，这与水平光路光度计的比色皿质量是否符合要求一样，因此我们认为孔间差是仪器外部的固有误差，只有准确测知孔间差，并对结果作出相应的校正，才能使检验结果更符合实际情况、更准确可靠；采用的评价指标（士1.96 s）也是有利于结果校正的。另外，在设计孔间差测量的操作方法上，我们将200 ul甲基橙溶液吸光度调至0.065～0.070 A，是充分考虑到加样器的误差（上海求精公司，200 ul，士2％CV），其目的是使加样误差控制在仪器的分辨率（0.01 A）以下，这样也就避免了孔间差结果不因加样误差而导致假性增高。

1.4零点飘移

1.4.1方法：取八只小孔杯，分别置于八个通道的相应位置，均加入200 ul蒸馏水并调零，采用双波长或单波长（490 nm）每隔30 min测定一次，观察8个通道4h内的吸光度变化。其与零点的差值即为零点飘移。

1.4.2测量原理：酶标仪的零点飘移通常是很小的，这是由于仪器在读数之前，先要做8个通道的本底测量（Io）．然后再读取样品板的各孔测定值（I），根据Beer's law 光吸收值=1ogl0（Io／I），每次读数经过如此的自动校正，使得读数误差大大降低，这样的测读方式无疑是非常正确的的；另外有的仪器是应用"DRL DYE"检测试条来进行绝对吸光度的校准的，因此在采用单波长测量时，会导致吸光度的假性增高，这种仪器可采取两种方法进行校正，一是选择一合适的参比滤光片进行双波长测定，二是引入修正参数，即在吸光度模式下单波长读取1个空白孔，其测试值和预测值之差值即为修正参数。所以零点飘移是评价仪器在一定时间内零点吸光度的变化趋势，与波长无关，它间接地反映了仪器内部检测系统在单位时间内处于工作状态下的稳定性及仪器的机械性能情况（连续进板、检测、退出），故它是评估仪器内部电路系统、光学系统（检测器）及机械系统良好与否的指标。

1.5精密度评价

1.5.1方法及评价指标：每个通道三只小杯，分别加入200 ul高、中、低三种不同浓度的甲基橙溶液，蒸馏水调零，采用双波长作双份平行测定，每日测定两次，连续测定20天。分别计算其批内精密度、日内批间精密度、日间精密度和总精密度及相应的CV值。

1.5.2理论依据：1984年美国临床实验室标准委员会发表了EP5一T文件并于1992年进行了第二次修订：临床化学仪器精密度性能的用户评价。该评价方案在生化分析仪、血细胞计数仪等仪器和试剂的评价中得到了广泛的应用，使评价仪器的方法得到了统一；而该法应用于酶标仪的评价在国内外则尚未见有类似的报道，我们采用该法对酶标仪进行系统评价，结果是比较满意的。各指标的意义为：批内精密度系由20d 中每天两批，每批两次之差（即"批内"）经统计学处理后所得的结果；日内批间精密度系由20d中每天两批测定结果均值之差（即"批间"）经统计学处理后所得的结果；日间精密度表示20 d中每天所测均值的标准差即标准误，反映了每日均值的离散度；总精密度则是对批内、批间和日间精密度进行加权统计的结果。其中以批内精密度和总精密度的应用最为广泛，与传统的批内精密度的计算方法（即对同一标本在同一天内同时重复测定多次）相比，前者更符合实验室的实际情况，更有代表性，也更加合理；而总精密度则客观地全面地反映了实验室的总体变异情况。

1.6线性测定

1.6.1方法：精确称取甲基橙配制5个系列浓度的溶液，采用双波长平行检测8次求其均值。计算回归方程、相关系数r及标准估计误差Sy,x，并用±1.96 Sy,x表示样