PCR条带分析
PCR过程问题全解
PCR过程问题全解如何防止pcr形成引物二聚体？PCR后的电泳条带形成了一条非常宽且明亮的条带，其大小与标记物相比不容易看到。
具体原因是什么？PCR最合适的模板DNA浓度是多少？答：1这条亮带如果在100bp一下就可以考虑是引物二聚体了，形成引物二聚体的原因很多，如引物设计的不好，在两端容易形成回文结构或是两条引物之间也可能会互补配对；退火温度没有达到最佳，实在不行就做个温度梯度吧；再就是试着改变一下循环数，也许会有帮助。
PCR模板约为104-106个拷贝。
答2：我觉得是目的条带含量太多了，如果点样太多，负载量太大，就会造成跑胶时条带太宽。
可以试着减少模板量，稀释10倍或是减少循环数。
回答3:1解决这个问题最根本的方法是从底漆本身重新设计底漆；2.模板可能有问题；PCR后的电泳条带很宽很亮，这可能是模板浓度过高或循环次数过多造成的；3.taq酶，引物，mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；4.将要添加的上下游底漆混合后，在100℃的沸水中煮沸5分钟，然后迅速取出，放在冰上瞬时冷却。
此时，将它们加入反应体系，引物二聚体将消失；5.向混合物中加入5%甘油或5%二甲基亚砜可增强特异性；6.pcr反应体系的配制在冰上进行，最后加taq酶，pcr结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些taq酶会将多余的引物合成为二聚体。
7.增加循环数可以适当降低引物二聚体；8.如果降低退火温度后出现条带，则应逐渐升高温度。
如果温度升高，产物量减少，则应增加镁离子浓度（取决于扩增片段的长度，如果片段较长，则相应的镁离子浓度应更高）；9.如果降低退火温度，发现只有底漆二聚体，镁离子浓度在20-25mmol/L之间没有差异，则认为缓冲液和其他试剂没有完全溶解和混合，导致吸收试剂的浓度错误。
10.以最后一个PCR产物为模板，第二次PCR可以提高引物和模板的特异性，减少引物二聚体。
如果两次之间的时间间隔较短，则可将原产品稀释100-1000倍，如果间隔较长，则可将其稀释50-100倍。
医学分子生物学pcr实验报告
医学分子生物学pcr实验报告医学分子生物学PCR实验报告一、实验目的•理解PCR原理及其在医学分子生物学中的应用•掌握PCR实验操作流程及技巧•学会分析实验结果并撰写实验报告二、实验原理•PCR是聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction) 的缩写•通过使用DNA聚合酶对特定DNA片段进行指数级扩增•用于诊断疾病、基因检测、基因表达分析等领域三、实验材料•被测样本DNA•引物 (Primer) 对•2x Taq Master Mix•无水乙醇•DNase/RNase-free deionized water•加热式PCR仪•凝胶电泳设备及相关试剂四、实验步骤1.设计并合成引物•根据目标序列选择特异性引物•检查引物的特异性和二聚体形成情况2.准备PCR反应混合液•按照实验设计，计算并配置各试剂的浓度和体积•将样本DNA、引物、2x Taq Master Mix和DNase/RNase-free水混合3.PCR扩增•设定PCR仪的温度和循环次数参数•将反应混合液放入PCR仪，开始扩增4.PCR产物检测•准备1%琼脂糖凝胶，加入适量甲醛•将扩增后的PCR产物进行凝胶电泳•观察电泳结果，分析PCR产物的分子量和条带强度5.结果分析及报告撰写•根据实验结果，分析样本中目标基因的存在与否•撰写实验报告，并对实验过程和结果进行讨论五、实验注意事项•避免引物二聚体的产生，以提高实验特异性•掌握PCR扩增的温度、时间和循环次数参数•减少实验中的污染，以提高实验准确性•正确分析实验结果，避免误判六、实验结果分析•经过PCR扩增后，观察到目标基因片段的明显条带•结果符合预期，证明实验成功•对异常结果进行讨论，分析可能的原因及改进措施七、结论•PCR实验在医学分子生物学中具有重要意义•通过本次实验，我们掌握了PCR实验的操作流程和技巧•实验结果可为疾病诊断、基因检测等提供有力依据Hello! How can I help you today? If you have any questions or need assistance, feel free to ask.。
pcr及电泳实验报告
pcr及电泳实验报告PCR及电泳实验报告引言：PCR（聚合酶链式反应）和电泳是生物学实验中常用的两种技术，它们在分子生物学研究中起着重要的作用。
PCR能够扩增特定DNA片段，而电泳则可以将扩增产物进行分离和检测。
本实验旨在通过PCR和电泳技术，对一段目标DNA 进行扩增和分析。
材料与方法：1. PCR反应体系：引物A、引物B、模板DNA、聚合酶、dNTPs、缓冲液、MgCl2、水。
2. PCR反应条件：预变性95°C 5分钟，变性95°C 30秒，退火55°C 30秒，延伸72°C 30秒，最终延伸72°C 10分钟。
3. 电泳装置：琼脂糖凝胶、TAE缓冲液、DNA标记物、扩增产物。
4. 电泳条件：电压100V，电流20mA，电泳时间30分钟。
结果与讨论：经过PCR反应，我们成功扩增了目标DNA片段。
在电泳分析中，我们观察到了明显的DNA条带。
这表明PCR反应成功，并且扩增产物的长度符合预期。
通过对扩增产物进行电泳分离，我们可以进一步分析和检测目标DNA。
PCR反应是一种体外扩增DNA的技术，它利用DNA聚合酶酶活性的特性，通过不断循环的变性、退火和延伸步骤，将目标DNA片段扩增到数以亿计的复制。
PCR反应体系中的引物是起到定位和扩增目标DNA的作用，引物的设计需要根据目标DNA的序列进行合理选择。
在本实验中，我们使用了引物A和引物B，它们的设计基于目标DNA的序列。
电泳是一种通过电场力将DNA分子在凝胶中分离的方法。
在电泳过程中，DNA 分子会根据其大小和电荷迁移速率的不同，形成不同的条带。
通过观察这些条带的位置和强度，我们可以对DNA样品进行分析和鉴定。
在本实验中，我们使用琼脂糖凝胶进行电泳分离。
琼脂糖凝胶是一种由琼脂糖和缓冲液制成的凝胶，它具有一定的孔隙度，可以使DNA分子在电场力下进行迁移。
电泳过程中，我们使用TAE缓冲液作为电解质，它可以提供适当的离子强度和pH值，保证电泳的正常进行。
PCR检测常见问题与解决途径
P C R检测常见问题与解决途径------------------------------------------作者xxxx------------------------------------------日期xxxxPCR检测常见问题与解决途径利用PCR方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。
尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。
为了提高转基因检测的准确性和可靠性，PCR检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。
一个好的PCR方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。
本文对PCR检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方法予以综述。
一、假阳性：（一）假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。
如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。
（二）造成假阳性的原因1. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2. PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
3. PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。
因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。
4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
PCR详细讲解
逆转录引物：
（3）特异性引物 能与目标RNA碱基序列互补的寡 核苷酸引物，仅产生待分析基因的 cDNA。
半定量 RT-PCR
基本概念
半定量 RT-PCR （ semi-quantitatie reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）是常用的一种简捷、特 异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增， 并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。 定量RT-PCR（quantitatie reverse transcription and polymerase Chain reaction ,qRT-PCR）是在用一步法或两步法，在PCR反应体
PCR扩增体系
模板（Template）：基因组、质粒DNA、cDNA，也可
以是细菌、组织样品等。
引物（Primer）：确定扩增目的序列的特异性；确定
扩பைடு நூலகம்产物长度。
DNA聚合酶（DNA Polymerase）：推动PCR反应进行的机
器。扩增效率和保真性。
缓冲液（Buffer）：控制体系的pH和离子强度，为
PCR质量分析报告
PCR质量分析报告PCR质量分析报告一、实验目的：本实验旨在通过PCR（聚合酶链式反应）技术对样本中特定靶基因的扩增情况进行质量分析，评估PCR反应的准确性和可靠性。
二、实验原理：PCR是一种重复性很高的体外DNA复制技术，通过特定引物扩增靶基因的DNA序列，生成大量目标DNA。
PCR反应一般包括3个步骤：变性、退火和延伸。
其中变性步骤使DNA双链解离为单链；退火步骤使引物与目标DNA序列互补结合；延伸步骤则利用DNA聚合酶将DNA 合成为双链。
PCR反应的准确性和可靠性取决于反应体系的设计和实验条件的控制。
三、实验材料和设备：1. 样本DNA：提供要进行PCR扩增的DNA样本。
2. 引物：靶基因的特异引物，确保引物的浓度和纯度。
3. 酶切修饰的水：用于控制实验误差，避免模板DNA 与未扩增产物的污染。
4. PCR反应体系组成物：包括PCR Buffer、dNTPs、Taq DNA聚合酶等PCR反应试剂。
5. 热循环仪：用于控制PCR反应温度和时间。
四、实验步骤：1. 提取样本DNA，并根据实验需要进行适当的纯化和稀释。
2. 根据引物序列设计PCR反应体系，包括引物浓度、PCR Buffer浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶浓度等。
3. 准备阳性和阴性对照，以验证PCR反应的特异性。
4. 按照PCR反应体系的设定条件，进行PCR扩增，设置合适的循环数和时间。
5. 扩增产物进行凝胶电泳分析，观察PCR反应的扩增效果。
6. 对PCR产物进行检测和纯化，评估扩增产物的质量。
五、实验结果和分析：1. 凝胶电泳结果显示，PCR反应产物出现预期大小的条带，且条带形状清晰，没有模糊的非特异性条带。
这表明PCR反应的扩增效果良好，靶基因在样本中存在且得到了扩增。
2. 阳性和阴性对照结果相符，说明PCR反应的特异性较高。
3. 扩增产物的纯度较高，没有明显的附加物或杂交产物。
4. PCR反应的循环数和时间经过优化，可以得到足够的扩增产物数量。
PCR技术原理及简介
PCR技术原理及简介PCR原理聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction （PCR），简单来讲，其就是利用DNA分子会在体外95°高温时会发生变性解旋变成单链，然后降温到60°C左右时引物会与单链DNA 按碱基互补配对原则结合，接着再升高温度到72°C左右，即DNA聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶会沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成相应的互补链，如此循环往复以达到DNA 分子扩增的目的。
PCR技术诞生最早核酸体外扩增的设想是由Khorana于1971年提出，但是，由于当时的基因序列分析技术尚不成熟，且对热具有较强稳定性的DNA聚合酶也还没有被发现，这种设想在当时来讲似乎没有任何实际意义。
随后，在1985年，美国科学家Kary Mullis实现了这个设想，发明了PCR技术。
自从美国科学家Kary Mullis发明PCR方法以来，当前该方法已经成为生命科学研究领域中最常规的实验方法之一。
通过PCR扩增技术，其产物应用于下游多个领域，比如克隆表达、芯片杂交、突变检测以及基因测序等等。
PCR技术发展PCR技术诞生至今，随着生命科学领域以及延伸领域的应用需求，PCR技术已经经过了三代突破性的更迭，使其应用范围越来越广泛。
第一代PCR是基于电泳技术对PCR产物进行分析，主要针对的分析对象是条带，分析内容主要有这样三类：条带大小、条带数量、条带浓度。
简单来讲就是看核酸分子电泳条带。
研究人员可以根据电泳条带的这些信息达到相应的实验目的，比如制备的DNA片段、检测目的序列、对目的基因表达进行定性分析等等。
然而，第一代PCR技术有一个很大的缺陷——无法实现精确定量。
第二代PCR技术即荧光定量PCR技术，其是通过在反应体系中加入能指示反应进程的荧光试剂来实时监测荧光的积累，依据荧光曲线的Cq值来定量起始靶基因的浓度。
简单来讲即根据反应体系的荧光强度来判断产物浓度。
RT-PCR中遇到的问题及解决方法
RT-PCR中可能遇到的问题及处理方法摘要：本文就在RT-PCR实验中可能遇到的，包括在琼脂糖凝胶电泳分析中看到少量或没有RT-PCR产物、在琼脂糖凝胶分析中看到非预期条带、多聚糖同RNA共沉淀、cDNA第一链合成错误或数量少、RNA二级结构太多等问题进行分析，并提出了相应的可能的处理方法。
RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。
逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。
由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。
RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。
RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
RT-PCR的关键步骤在是RNA 的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。
1 材料与方法1.1材料1.1.1 RT-PCR技术相关试试剂:oligo: 多聚体，相当于mRNA引物AMV RT：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶dNTPs：脱氧核苷酸RNase：RNA酶抑制剂PCR Buffer：RT-PCR缓冲液MgCl2：2价镁离子1.2 方法1.2.1 RNA提取组织剪碎加入1ml Trizol，冰上匀浆（边匀浆边暂停）。
转入一新EP管中（1.5ml），室温保存5min。
加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈），室温放置5min。
10000 rpm 4℃离心15min。
转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇0.5ml,振荡混合，室温保存10min。
pcr循环条带公式
pcr循环条带公式
Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)。
n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。
起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。
因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
PCR反应循环参数是指在聚合酶链式反应中，循环参数中退火温度和时间、延伸时间及PCR缓冲液的成分影响多重PCR的扩增效果，而反应体积、循环次数对其扩增效果影响较小。
多重PCR(mutiplex PCR）技术因具有高效、高产率、能降低实验成本、加速实验进程等优点，要求不同引物能在同一反应体系中进行特异性扩增，因而影响其扩增效果的因素较多，主要有循环参数、反应体积、反应体系、引物间的碱基配对等。
PCR结果异常分析
PCR结果异常分析PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h 后带型不规则甚致消失。
PCR反应的关键环节有：①模板核酸的制备；②引物的质量与特异性；③酶的质量及活性；④PCR 循环条件。
应寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
1．假阴性，不出现扩增条带（1）模板：①模板中含有杂蛋白质；②模板中含有Taq酶抑制剂；③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序应固定不宜随意更改。
（2）酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
（3）引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
（4）Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
（5）反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20l、30l、50l或100l,用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20l 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
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PCR的常见问题分析与对策
PCR产物的电泳检测时间
一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，
④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq 敢种 剂，③模板中蛋白质?有消
化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模
板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理
，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定
不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶?或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够
而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不
理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高
，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②
引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出
现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做P
CR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释
引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏
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部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二
聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特
异
性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应
用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul
后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出
现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响
引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增
仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
“行 列变异：如靶序?发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结?，或因靶序列
某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增
时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳 性。
需重新设计引物。
“行 列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的
交 叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止
将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器
材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本 前，
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反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污 染，这些
小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩 增出PCR产
物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带
与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、
或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多
有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出
现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引 物。②减低
酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。④适当提
高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量
差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①
减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓 度。④增加
模板量，减少循环次数。
Possible Causes: Components 可能原因之一——反应组分
· Primer concentration is too high.
· Primer degeneracy is too high.
· Nested primers are required.
· New primers are required. Some primers are immune to
optimization and it's possible that your primers are good matches to other sites in addition
to the desired template. See Primer Design.
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· Template denaturation efficiency is too low.
· Mg++ concentration is too high. Try decreasing the Mg++ concentration by 0.2 mM
increments.
· dNTP concentration is too high.
· Polymerase concentration too high.
· pH is suboptimal. Check at higher and lower levels.
Possible Causes: Conditions 可能原因之二——反应条件
· Annealing temperature is too low, causing mispriming. Try using a much higher anneali
ng temperatures , especially in the first few cycles.
· Cycles periods are too long.
· Too many cycles. Compare the number of bands and their relative amounts after fe
wer cycles. There may be excessive template if proportionally more of the intended produ
ct is present at the earlier cycles.
· Ramp speed is too slow. Check your thermocycler
specifications.
· Inhibitors are present and/or concentrations are too high. See About Inhibitors
· Enhancers are required. See About Enhancers.
· Contaminants are present. See How to Reduce Contamination.
· Hot Start or Touchdown PCR is required.