PCR序列拼接-CExpress使用说明
生物学常用软件简介
AC
accession number giving origin of sequence
DT
dates of entry and modification
KW
key cross-reference words for lookup up this entry
OS, OC source organism
RN, RP, RX, RA, RT, RL literature reference or source
DR
i. d. In other databases
CC
Description of biological function
பைடு நூலகம்
FH, FT information about sequence by base position or range of positiions
生物学常用软件简介
前言
生物信息学是一门新兴的交叉学科，它将数 学和计算机知识应用于生物学，以获取、 加工、存储、分类、检索与分析生物大分 子的信息，从而理解这些信息的生物学意 义。
上面是狭义的生物信息学含义,也是现阶段生 物信息学的基本工作.
内容概要
一 生物信息学软件的主要功能简介
1.数据的基本处理 2.序列的比对 3.基因/基因组的注释 4.Snp分析 5.进化分析 6.基因表达分析 7.蛋白质结构预测
2.序列的比对 序列比对（alignment）：为确定两个或多个序列
之间的相似性以至于同源性，而将它们按照一定 的规律排列。
将两个或多个序列排列在一起，标明其相似之处。 序列中可以插入间隔（通常用短横线“-”表示）。 对应的相同或相似的符号（在核酸中是A, T（或 U）, C, G，在蛋白质中是氨基酸残基的单字母表 示）排列在同一列上。
PCR技术及操作程序
PCR技术及操作程序PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，能够在短时间内快速复制特定的DNA片段。
PCR技术在基因检测、疾病诊断和生物学研究等领域得到广泛应用。
本文将介绍PCR技术的原理和操作程序，帮助读者更好地了解和应用该技术。
原理PCR技术主要依赖于DNA的复制过程。
它通过加热DNA使其解开双链结构，再利用特定的引物（即DNA片段的起始序列）使DNA复制酶能够在目标DNA的两个链上进行复制。
这样，每经过一轮PCR循环，目标DNA的数量便会指数级增加。
PCR技术一般分为三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA模板被加热至94-98°C，使其双链结构解开成两条单链。
在退火步骤中，温度被降至50-60°C，使引物与目标DNA序列互补结合。
在延伸步骤中，温度被升至72°C，该温度下复制酶（通常是Taq聚合酶）能够在引物的基础上将目标DNA序列进行复制，形成两条新的DNA链。
每经过一轮PCR循环，目标DNA的数量翻倍，经过多次循环后，可以获得大量的目标DNA。
操作程序进行PCR实验时，需要准备一些实验材料和设备，包括但不限于：•DNA模板：包含所需目标DNA序列的DNA样本。
•引物：与目标DNA序列互补的短DNA片段。
•脱氧核苷酸（dNTPs）：用于新的DNA链的合成。
•PCR缓冲液：提供适宜的pH和离子浓度，保证PCR反应的顺利进行。
•DNA聚合酶：通常使用Taq聚合酶，能在高温下工作。
•热循环仪：用于自动控制PCR反应中温度的变化。
•离心机：用于提取和处理PCR反应产物。
以下是一般的PCR操作程序：1.准备PCR反应体系。
按照实验所需的体系比例，将DNA模板、引物、dNTPs、PCR缓冲液和DNA聚合酶混合均匀。
确保反应体系中所有成分都能够达到所需浓度。
2.充分混合反应体系。
轻轻扎倒或短暂离心，将反应体系混合均匀，避免产生空气泡。
3.将反应体系分装到PCR试管中。
基因序列拼接器软件 使用说明书（软件操作文档）
基因序列拼接器软件使用说明书（软件操作文档）1. 引言基因序列拼接器软件（MergeSeq）基于研究者测序获得或从核酸数5据库（如GenBank等）中批量下载的fasta格式存储的基因片段，按照使用者指定顺序,将同一物种不同基因片段拼接成由多基因组成的长序列，用于不同物种间的分子系统发育分析。
1.1编写目的本说明书为在Linux/UNIX环境下使用MergeSeq软件的用户编写。
10它将指引使用者按步骤搭建该软件的运行环境，明确输入文件的录入格式，熟悉运行参数的配置规则，理解软件运行时出现的状态信息并掌握获取输出fasta格式文件的方法。
1.2项目背景非模式生物(如蜘蛛等)构建分子系统发育树一般选取低速进化15（Slow-Evolving）且有种属特异性的基因片段进行分析。
为提高结果的置信度，一般采取多基因组合分析的方法(Dimitrov et al., 2016; Wheeler et al., 2016)。
但在实际操作中，将同一物种不同基因片段拼接在一起是一件十分费事且容易出错的重复性操作。
尤其当某一物种某个基因数据缺失时，20必须在拼接后的长序列中填充与同一基因其他对齐序列等长的占位符以保证结果为对齐。
本项目基于测序或下载获得的fasta格式基因序列片段，按照研究者指定的基因排列顺序，自动将同一物种不同基因片段拼接成多基因长序列，并保证结果对齐，可直接用于不同物种间的分子系统发育分析。
251.3 定义（专门术语的定义和缩写词的原意）fasta格式（fasta format）：fasta格式是一种基于文本用于表示核酸序列或多肽序列的格式。
其中核酸或氨基酸均以单个字母来表示，且允许在序列前添加序列名及注释。
该格式已成为生物信息学领域常用的30标准文件格式。
2. 软件性能2.1.数据精确度本软件不涉及数字的计算和处理，输入、输出数据的格式均为35UTF-8编码的文本类型文件。
2.2.时间特性本软件对输入数据、输出数据的处理时间由基因片段长度和运行软件主机性能决定。
pcr的操作及注意事项
PCR的操作及注意事项一、PCR简介PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学实验技术，用于扩增特定的DNA片段。
PCR技术的广泛应用，使得其操作和注意事项变得尤为重要。
本文将介绍PCR的操作步骤以及需要注意的事项。
二、PCR的操作步骤1. DNA提取首先，需要从样本中提取目标DNA。
常用的提取方法包括酚氯仿法、热碱法和商业DNA提取试剂盒。
在提取DNA的过程中，应注意减少污染，保持工作区域清洁。
2. PCR反应液的配制将PCR反应液的各种试剂按照实验方案的要求配制好，主要包括模板DNA、引物、dNTPs、缓冲液和聚合酶。
保持试剂的新鲜和纯净，避免重复冻融。
3. PCR反应的设置将PCR反应液分装到反应管中，可根据需要设置多个反应管。
注意反应管的密封性，避免样品蒸发和污染。
同时，设定PCR反应的温度程序，包括变性、退火和延伸的温度和时间。
4. PCR反应的程序将反应管放入PCR仪中，启动PCR程序。
确保PCR仪的温度控制准确可靠，保持反应过程的稳定性。
根据目标DNA片段的大小，调整PCR的循环次数，一般为25-35个循环。
5. PCR产物的分析PCR反应结束后，可以通过各种方法对PCR产物进行分析，常用的方法包括琼脂糖凝胶电泳和DNA测序。
分析结果能够验证PCR扩增的特异性和产物的纯度。
三、PCR操作的注意事项1. 高品质的DNA模板PCR反应的成功与否与DNA模板的质量有很大关系。
因此，在进行PCR实验前，应确保使用高质量的DNA模板，如通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。
2. 引物的设计和质量PCR反应中使用的引物应具有较高的特异性和准确性。
在设计引物时，应避免引物间的互补性，以免出现非特异扩增。
同时，引物的质量也很重要，选择高纯度的引物可以提高PCR反应的成功率。
3. 操作区域的消毒与隔离为了避免PCR反应过程中的污染，应定期对实验区域进行消毒，如操作台面、工作台和仪器表面。
ContigExpress软件使用说明-序列拼接
此名为ContigExpress的软件可用于做序列拼接，主要使用方法如下：1.解压缩下载的压缩文件contig.zip文件，保证文件CExpress.exe,Gexudat.def在同一个目录下，打开Cexpress.exe应用程序，进入ContigExpress操作界面，如图1。
图12.点击菜单上的“Project”选择“Add Fragments”，一般我们发给您的是AB1文件，如果您有其它格式的文件，也可以选择，在这里我们选择AB1文件，以其为例，如图2。
图23.选择您存放AB1文件（即我们Email给您的测序结果的彩图文件）的目录，选择文件类型为ALL FILES, 之后打开要拼接的AB1，从而添加进ContigExpress软件。
在此以A、B 两个序列为例，如果有多个序列的也可以同时添加进入。
图34.选中要拼接的序列，再选菜单“Assemble”栏下的“Assemble Selected Fragments”命令，或用工具栏上的按钮，如图3。
若两个结果能够拼接起来的，会得到一个Assemble1下的contig1的结果，如图4。
图45.双击contig1，打开拼接后的结果，选中菜单“VIEW”栏，进入VIEW OPTION，将SHOW ALIGNMENT AS 由TEXT 改为GRAPH.，点击OK 后得到结果如图5。
此时可能会因为两条序列的测序结果误差，会有不同的地方，在拼接图片框中的绿色竖杠就表示了这些不同的地方，如图所示。
接着可点击绿色竖杠找到有误差的地方，进行修改。
6.在修改过程中，遇到有误差的地方，可以根据峰形来判断是多读还是漏读来进行修改，此时电脑认为是漏读碱基的地方会以点来表示，如图5，此处很明显是A序列上多读了一个G碱基，可将其删除。
（注：因为软件本身的问题，只有在拼接过程中是正向的序列才能进行修改操作，若在反向上修改碱基，保存时会产生错误而直接关闭程序。
所以若要修改反向序列上的碱基，可先保存后，把原有的Assemble1的结果拆开，点序列图标上的“Name”，如图3，所选中的序列上的一个“name”横栏，使序列按Name的升降次序来排列，把要作为正向的序列放到要作为反向序列上面即可。
Primer Express v3.0 中文操作手册
2
C+G
G)
G CC di-nucleotides a
(GGG-MGB-3’ or GGAG-MGB-3’) a probe a: b: 參數 2
TaqMan MGB probe
Primer Express Operation Guide
Primers & Probes for Quantification
列 Copy & Paste
”Add” 列
列
”Sequence” Tab
* Primer Express Software (若 列 database download
.dan, .txt, .ab1, 來 ,
.abi 列
, 料)
列
Primer Express Operation Guide
” Double Strand “, double stranded DNA sequence
search
50 不 列 probe
”Primers / Probes” Tab 參 數 primer 列
行 SYBR Green primer primers & probes
”Location”說
”Sequence” Tab Probe 藍 )
”Primers / Probes” Tab Forward Primer
3.
”Parameters” Tab
Primer/Probe Tm
Primers/Probe
Primer Express Operation Guide
”Sequence” Tab Tools → Find Primers/Probes
Primers/Probe pairs
pcr 操作流程
pcr 操作流程PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于复制DNA片段的技术，它可以在短时间内扩增出数百万份特定DNA序列。
PCR技术在分子生物学、医学诊断、法医学等领域有着广泛的应用。
下面将介绍PCR的操作流程。
首先，准备PCR反应体系。
PCR反应需要的基本组成包括DNA模板、引物、dNTPs（四种脱氧核苷酸）、DNA聚合酶、缓冲液和水。
引物是PCR反应的关键，它们是用来识别目标DNA序列并引导DNA聚合酶合成新链的短链DNA片段。
其次，进行PCR反应。
PCR反应通常分为三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，将PCR管中的混合物加热至95°C，使DNA双链解旋成两条单链。
在退火步骤中，将反应温度降至50-60°C，引物与目标DNA序列结合。
在延伸步骤中，将反应温度升至72°C，DNA聚合酶在引物的引导下合成新链。
最后，进行PCR产物的分析。
PCR反应结束后，可以通过凝胶电泳、实时荧光定量PCR等方法对PCR产物进行分析。
凝胶电泳可以用来检测PCR产物的大小和纯度，实时荧光定量PCR可以用来定量PCR产物的数量。
在PCR反应中，需要注意一些常见的问题，如引物的设计、反应条件的优化、污染的防止等。
此外，PCR反应的结果也需要谨慎解读，避免误判。
总的来说，PCR技术是一种简单、快速、高效的DNA复制技术，广泛应用于科研和临床实验中。
熟练掌握PCR的操作流程和技巧，可以提高实验效率和准确性，为科研工作提供有力支持。
PCR操作步骤及结果
PCR操作步骤及结果PCR（聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction）是一种体外放大特定DNA片段的技术，具有高效、快速和特异性的特点。
下面将详细介绍PCR的操作步骤及其结果。
一、PCR的操作步骤：1.模板DNA制备：-从样品中提取DNA，常见的提取方法包括CTAB法、盐溶法和商用DNA提取试剂盒等。
-根据实验需求，选择合适的DNA浓度作为PCR的模板。
2.PCR反应体系的配制：PCR反应体系由模板DNA、引物、dNTPs（四个单核苷酸）、缓冲液和聚合酶等组成。
-引物：引物是PCR反应中的两个短链DNA分子，分别与待扩增的目标DNA的两个互补区域序列相配对。
-dNTPs：dNTPs是脱氧核苷酸，包括A、T、C和G四种，供给聚合酶合成新DNA链使用。
-缓冲液：缓冲液用于提供合适的pH值和离子环境，维持PCR反应的正常进行。
-聚合酶：聚合酶是PCR反应的酶，能够识别引物，并在引物上逐个添加dNTPs，合成新的DNA链。
3.PCR循环反应：PCR反应主要包括三个步骤：变性、引物结合和延伸。
-变性：将PCR反应混合液加热至95°C，使模板DNA的双链解开，得到两条单链DNA。
-引物结合：将PCR反应体系降温至合适的温度（通常为45-65°C），使引物与单链DNA的互补区域结合。
-延伸：将PCR反应体系升温至聚合酶的最适温度（通常为65-75°C），聚合酶在引物的基础上合成新的DNA链，延伸特定的目标序列。
4.PCR循环程序：PCR的循环程序通常分为三个阶段：变性、引物结合和延伸。
-变性：95°C，持续时间为30秒至2分钟。
用于使DNA变性，并解开双链。
-引物结合：温度通常为45-65°C，持续时间为20秒至1分钟。
用于引物与模板DNA的互补区域结合。
-延伸：温度通常为65-75°C，持续时间为0.5-2分钟。
用于聚合酶在引物的基础上合成新的DNA链。
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PCR序列拼接软件Contig Express使用简介
由于一般测序方法的限制，测续结果一般只能到800bp左右，所以对于较长片段只能用不同引物测序后根据结果拼接，ContigExpress正式是一款非常实用的序列拼接软件。
Contig Express是著名的软件Vector NTI的组件之一。
经过一些简单的处理该组件可以被剥离出来独立运行，经我们试用效果良好。
Contig Express将每个PCR测序片断视为一个Contig，当您输入多个Contig后，它会自动寻找其中的公共序列，然后将他们拼接好后的结果已图形方式呈现给您。
完全免除您手工逐个片断Blast，然后肉眼找共同序列的苦恼。
Contig Express 9.1可以从论坛中下载。
2 - 向Contig Express中加入需要拼接的序列
目前PCR测序的结果多以ABI和Fasta两种格式提供。
一般来说ABI结果是原始结果最为可信，因此我们最好向Contig Express中直接倒入ABI格式的原始数据。
倒入的方法是"Project---Add Fragments---From ABI file..."。
在接下来弹出的"Import Sequence From"对话框中选择测序公司发给您的ABI文件。
需要注意的是目前公司发给您的原始ABI文件多是"AB1"文件名。
Contig Express无法直接识别，因此有必要在文件类型中选择“All Files(*.*)"。
由于要拼接多个序列这时您可以配合Ctrl键进行多选。
3 - 用Contig Express进行序列拼接
现在我们已经选好了要进行拼接的序列了，接下来的步骤就交给Contig Express让它为我们自动拼接了。
用鼠标配合Ctrl键选择要进行拼接的序列。
然后点击"Assemble---Assemble Selected Fragments"。
拼接的过程一闪而过。
在接下来的对话框中显示出这两个PCR片断拼接得到的“Contig1”。
用鼠标双击“Contig 1”。
在下面这幅图中形象地显示出这次拼接的结果。
上下两段序列分别代表从两个相反方向进行测序得到的结果。
两者之间大约有1/2是重复的片断。
最下方花黑框的位置就是初步的拼接结果。
4 - 用Contig Express进行手工校正
大家知道一般PCR测序结果总会有一些位置不明确或者被标记上“N”。
这些“N”常出现的位置或者说测序最难测准的位置一般在测序引物的旁边也就是靠近边缘的位置。
在序列拼接的过程中也会出现这样的情况。
在重复片断内部，相同位置上两个反应的测序结果不同。
这时我们根据经验，一般有疑问碱基若是出现在一个测序片断的中间部，那么它的准确性肯定强于相同碱基出现在测序片断两端的情况。
那么现在我们怎样方便的利用Contig Express寻找这些“N”呢？很简单。
我们首先选定一个片断（比如下面的片断），然后点击下图中的"---〉N"图标。
这时Contig Express就会为我们立刻找到有疑问的地方。
比如下图中，相同位置同一碱基在两个测序反应中产生了不同的结果。
一个是T，另一个是C。
大家觉得我们该取那个值呢？当然是“C”，因为在这个位置上，下方的测序片断恰好位于中部，结果可信性高于上方位于头端的测序片断。
我们可以手工将最下方Contig最终结果的“Y”更改为“C”。
由此类推，不断地点击"---〉N"图标就能找到更多的“N”位点。
最终我们可以将我们的Contig结果修改正确。
最后的步骤是得到最终Contig结果。
我们用鼠标点击最下方的Contig 1行中的任意一个碱基。
然后点击菜单栏上的"Edit---Select All"，下面的Contig 1行就会被全部选中。
然后再点击菜单栏上的"Edit---Copy Sequence From 1bp to 1750bp"就可以把最终的Contig 拼接结果拷贝到粘贴板上。
接下来的步骤就不用我说了吧......。