长期毒性作用及其试验方法

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二、实验动物
3. 性别及数量 （2）数量
90 天以内的试验 啮齿类动物每组至少20只（雌雄各 10 只）； 非啮齿类每组 4~6 ：一般大鼠为雌、雄各 只（雌雄各 2~3只）； 《指导原则》 30只， 超过 90 天的试验 啮齿类动物每组至少 40 只（雌雄各 20 只）； 非啮齿类每组 8-10 只（雌雄各 4~5 只）。
整体性
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一、一般原则和要求
总体原则

选用两种实验动物 三个剂量 给药途径应与临床拟用途径相同

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一、一般原则和要求
总体原则

选用两种实验动物 至少在两种动物体上进行，兼顾雌雄性别。
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一、一般原则和要求
总体原则

三个剂量 剂量至少分为高、中、低三个档次。 高剂量组应能充分反映药物的毒性， 低剂量组不出现毒性反应。 同时设一溶剂 ( 或赋形剂 ) 对照组或 已知药物毒性对照组。
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Beagle犬或猴各3~6只。
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二、实验动物
4. 饲养管理
严格控制环境条件，避免不必要的干扰因素 是非常重要的。
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二、实验动物
4. 饲养管理
室内温度 湿 度
环境因素
酮症酸中毒
光
照
通风条件 饮水质量 饲料或饲料配方
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二、实验动物
啮齿类动物 4. 饲养管理
二、实验动物
1.种类及品系
☆我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物 ,
一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类， 首选狗。
Wistar大鼠 SD大鼠
近亲繁殖鼠？
杂交鼠？
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二、实验动物
1.种类及品系
☆我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物 ,
一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类， 首选狗。
不同动物的剂量折算系数
动物种属 标准 K(剂量折算系数) 小鼠 大鼠 豚鼠 兔 猫 猴 狗 人
1 7 12.3 27.5 29.7 64 体重 K(kg体重剂量折算系数) 1 0.71 0.62 0.37 0.30 0.32 任何 R(动物体型系数) 0.059 0.09 0.099 0.093 0.082 0.111 体重 W(标准体重kg) 0.02 0.2 0.4 1.5 2 4 注：有些资料记载的动物体型系数（R）为此表中R 值的1000 倍，如小鼠R 这不影响药物剂量的折算。
原因：
1 长期毒性试验的给药期限较长； 处于生长发育阶段的动物对药物 的毒性反应较敏感；
年龄较大的动物反应性降低, 存 在许多发性疾病干扰试验结果。
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二、实验动物
2. 起始月(周)龄

啮齿类动物最好在断奶后不久即开始给药
大鼠起始周龄要求在 6 ~8周龄； 如果试验周期超过3个月以上，则将起始周龄降至 5 ~6周龄。
可供参考的具体方法
（1）半数致死量法（LD50法）
根据急性毒性的LD50值决定三个剂量。一般在 大鼠3个月长期毒性试验中，高、中、低三个剂量可 分别采用约LD50的1/10、1/50和1/100剂量，狗各剂 量组可采用大鼠相应各组的一半剂量。
可供参考的具体方法
（1）半数致死量法（LD50法） （2）短期蓄积试验过渡法
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预测受试物可能引起的临床不良反应 判断受试物反复给药的毒性靶器官或组织
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推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全剂量范围
提示临床试验中需重点监测的指标 为临床试验中的解毒或解救措施提供参考
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长期毒性试验的意义
了解实验动物能耐受的最大剂量，找出完 全无毒的安全界量，这个界量是判断一个待选 新药是否有进一步开发研究的价值以及能否过 渡到临床试用的重要依据，同时，也可为其它 毒性实验和临床初始剂量的选择提供依据。因 此长期毒性试验是临床前安全性评价的主要内 容，它与急性毒性试验、生殖毒性以及致癌性 等毒理学研究有着密切的联系，是新药报批临 床时重点审评项目之一，是药物从药学研究进 入临床试验的重要环节。
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二、实验动物
3. 性别及数量 （1）性别 在特殊情况下如药物对雄性（或雌性）生殖 细胞的毒效应已确知，或者急性试验已证明药物 对雌雄两性动物的毒性有明显差别时，就应主要 选用敏感性别的动物进行试验。
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二、实验动物
3. 性别及数量 （2）数量
90 天以内的试验 啮齿类动物每组至少20只（雌雄各 10 只）； 非啮齿类每组 4~6 只（雌雄各 2~3只）； 超过 90 天的试验 啮齿类动物每组至少 40 只（雌雄各 20 只）； 非啮齿类每组 8~10 只（雌雄各 4~5 只）。
大鼠低、中Biblioteka Baidu高三个剂量可分别采用50~100倍、25~50倍和 10~20倍临床剂量 狗可分别采用30~50倍、15~25倍和5~10倍临床剂量
猴可采用与狗相近的剂量或略低于狗的剂量进行试验
可供参考的具体方法
（1）半数致死量法（LD50法） （2）短期蓄积试验过渡法
（3）药代动力学法（MBS法） （4）最大耐受量法（MTD法） （5）临床拟用剂量法（ACD法） （6）等效剂量法 根据人和动物的等效剂量比值，再按一定倍数 扩大。
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二、实验动物
理想动物的标准：

对受试物的生物转化与人体相近； 对受试物敏感； 已有大量历史对照数据。
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二、实验动物
1.种类及品系
☆我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物 ,
一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类， 首选狗。
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给 药 的 期 限 不 同
给 药 的 剂 量 范 围 不 同
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蓄积作用 (accumulation action)
当较长时间连续、反复给药时，如果给药的 时间间隔和剂量超过机体消除药物的能力，就会 出现药物进入机体的速度 (或总量) 超过排除的 速度 (或总量) 的现象，此时药物就有可能在体 内逐渐增加并贮存起来，即蓄积作用。
根据药代动力学最大有效安全浓度（MCD）
大鼠3个月长期毒性试验时，低、中、高三个剂量可分别 采用大鼠的1.0 、3.3~6.6 和10~20 MCD;
狗一般可采用大鼠一半左右的剂量。
可供参考的具体方法
（1）半数致死量法（LD50法） （2）短期蓄积试验过渡法
（3）药代动力学法（MBS法） （4）最大耐受量法（MTD法）
适宜温度为 18~27 ℃ 。
室内温度 湿
相对湿度为 40%~70%。
度
光照宜持续 12 小时明亮，12 小时黑暗。
环境因素
酮症酸中毒
光
照
通风条件良好。
通风条件
所用饲料应符合动物的营养标准。
饮水质量
饲料或饲料配方 雌雄动物应分开饲养，每笼不宜超过 5只
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二、实验动物
犬 4. 饲养管理
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一、一般原则和要求
总体原则 给药途径应与临床拟用途径相同 口服给药大鼠一般常用灌胃，灌胃的容量为 每天1~2ml/100g，也可将受试药物混在饲料或水 中给予，但要保证每只动物按规定剂量在一定时 间内服入，静脉注射大鼠时可采用腹腔代替，各 剂量组采用等容量不等浓度给药。特殊情况另作 说明。
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第二节
试 验 设 计 原 则 及 方 法
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一、一般原则和要求
基本原则
全面、严谨、合理 整体性 随机、对照、重复
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一、一般原则和要求
基本原则
长期毒性试验不能与药效学、药代动 力性和其他毒理学研究割裂，试验设 计应充分考虑其他药理毒理研究的试 验设计和研究结果。长期毒性试验的 结果应该力求与其他药理毒理试验结 果互为印证、说明和补充。
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Beagle犬：原产英国，纯种小猎兔犬
Beagle犬的特点：体型小,毛短,性情温和,亲人,抗病力强
缺点：价格昂贵
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二、实验动物
2. 起始月(周)龄 一般选择较年轻的或正处于生长发育阶段的动物。
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二、实验动物
2. 起始月(周)龄 一般选择较年轻的或正处于生长发育阶段的动物。
急性毒性试验
是为观察和评价急性毒性的有害作用或中毒反应
而设计的一种毒理学试验。研究药物一次或24小
时内多次给予受试药物后，一定时间内所产生的 毒性反应。
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长期毒性试验与急性毒性试验 的根本差别
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给 药 的 期 限 不 同
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长期毒性试验与急性毒性试验 的根本差别
一类新药：Beagle犬 二类新药：杂种狗
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二、实验动物
1.种类及品系
☆我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物 ,
一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类， 首选狗。
☆在吸入给药时，猴是首先推荐的动物，因为它在
呼吸系统的解剖学和生理学方面比其它动物更接 近人类。
☆如研究计划生育用药，应选择猴或其他大动物。
第十五章 长期毒性作用及其试验方法 long-term toxicity impact and test method
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第一节
第二节
基本概念和目的
试验设计原则及方法
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2
第一节
基 本 概 念 和 目 的
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一、定义
长期毒性试验是指试验动物连续多日接触较大 剂量的药物所引起的中毒效应，为观察这种中毒效 应而设计的毒理学试验称之为长期(慢性)毒性试验。
单笼饲养，定量喂食。
室内温度 湿
Beagle 狗实验前至少驯养 1~2 周;
度
杂种狗应先检疫，驱虫。
环境因素
酮症酸中毒
光
照
通风条件 饮水质量 饲料或饲料配方
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三、给药期限
按我国药政管理部门的要求，长期毒性试
验的给药期限一般为临床疗程的3~4倍时间。 创新药品试验周期应不少于90天， 超过180天 的新药可以在试验开始90天后，同时进行I期临 床试验。

一个是足以引起明显的毒性反应的高剂量，但死 亡率应控制在 20% 以内； 第二个是不引起毒性作用的低剂量(一般为动物 有效剂量或临床治疗量的2~3倍)； 为表明毒性作用的量—效关系，在上述两个剂量 之间插入一个(或多个)中间剂量。 中剂量按
低剂量X高剂量 计算
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在选择合适的剂量时还应考虑到：
①药物在体内的生物蓄积作用。对于高蓄积性
药物应适当减少其剂量，否则在长期毒性试验结束
时各剂量均有可能出现毒性作用； ②药物是否有可能被特殊的酶所“解毒”或 “活化增毒”，而这些酶又是否易被药物本身所诱 导或抑制。 ③药物在消化道中的稳定性。与胃肠道内容 物有亲和性的药物，则应酌情增加剂量。
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狗的起始月龄为 6 月龄，一般不超过 12 月 龄； 如选用杂种狗，起始年龄可稍大些，但也不能 超过 5 年。
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二、实验动物
2. 起始月(周)龄

起始体重应在体重均值± 20% 的范围内。
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二、实验动物
3. 性别及数量 （1）性别
☆
一般来讲是兼用两种性别的动物，每个剂量组中 雌雄性别的动物数必须一致。
根据急性毒性试验所提供的相关信息，如毒 性的量—效关系，毒性出现的剂量范围及敏感动 物等，先过渡到7天至21天的短期蓄积性试验，再 将获得的参数外推于长期毒性试验。
急性毒性试验
蓄积毒性试验 和 /或
7天短期重复给药试验
90天重复给药试验
180天或更长期重复给药试验
可供参考的具体方法
（1）半数致死量法（LD50法） （2）短期蓄积试验过渡法 （3）药代动力学法
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我国药政部门关于一般药物重复给药毒性试验期限的规定 临床拟用 给药时间 啮齿类动物 毒性试验期限 非啮齿类动物
﹤5天 ﹤2周
2-4周 1-3月
2周 1月 3月 6月 6月
2周 1月 3月 6月 9月
﹥3月
每天给药最好固定时间。
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四、剂量水平的选择
三个剂量组是必不可少的：
根据大鼠急性毒性试验的最大耐受量(MTD)
大鼠长期毒性试验的三个剂量分别为1、1/3及1/10MTD； 狗和猴可采用大鼠一半左右的剂量。
可供参考的具体方法
（1）半数致死量法（LD50法） （2）短期蓄积试验过渡法
（3）药代动力学法（MBS法） （4）最大耐受量法（MTD法） （5）临床拟用剂量法（ACD法） 根据临床拟用剂量（3个月长期毒性试验）
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蓄积作用的表现形式
作用量积蓄 功能性蓄积
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长期毒性试验与急性毒性试验 的根本差别
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给 药 的 期 限 不 同
给 药 的 剂 量 范 围 不 同
观 察 的 毒 效 应 不 同
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二、目的与意义
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长期毒性试验的目的