MDCK细胞分离禽流感病毒
MDCK细胞库的建立及其生物学特性研究
MDCK细胞库的建立及其生物学特性研究王家敏;平玲;沈武玲;徐水林;魏园园;马忠仁;乔自林【摘要】分别从美国典型培养物保藏中心(ATCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)、北京协和细胞资源中心及某企业引进4株MDCK细胞系,扩大培养后液氮冻存,分别建立种子细胞库和工作细胞库.细胞复苏后分别对每株细胞进行了活力、形态、生长曲线、微生物污染、核型及荧光蛋白质粒转染表达等特性研究.结果表明,4个来源的MDCK细胞均呈上皮型,生长状态良好；生长曲线呈S型；细菌、真菌、支原体检测都为阴性；染色体2n=78；外源质粒在该细胞中能进行复制和表达.建立的细胞库为开展MDCK细胞及流感细胞基质疫苗的研究提供了基础理论依据和细胞资源.%Four cell lines were imported form ATCC, CCTCC, Xiehe Cell Resource Center of Beijing and a factory, and then these four cell lines were preserved with liquid nitrogen. Observations on morphology, dynamic growth, microbial contamination, analysis of karyotype and fluorescin plasmid transfeetion and expresstion were carried out. The results showed that all the cell lines were epithelioid and grew well. The growth curve of MDCK cells were all "S". The tests for bacteria, fungi, virus and mycoplasma were all negative. The chromosomes were 78. The exogenous plasmid could copy and express in the cell. Those results show that the MDCK cell bank is established successfully, which lays the foundation of the work bases for the research of MDCK cell and influenza vaccine.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2012(040)012【总页数】5页(P1231-1234,1261)【关键词】MDCK细胞系;细胞库;生物学特性【作者】王家敏;平玲;沈武玲;徐水林;魏园园;马忠仁;乔自林【作者单位】甘肃省动物细胞工程技术研究中心,甘肃兰州 730030;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730030;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730030;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730030;甘肃省动物细胞工程技术研究中心,甘肃兰州 730030;兰州民海生物工程有限公司,甘肃兰州730010;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730030;甘肃省动物细胞工程技术研究中心,甘肃兰州 730030;甘肃省动物细胞工程技术研究中心,甘肃兰州730030【正文语种】中文【中图分类】Q813.1+1MDCK细胞系（Madin-Darby canine kidney cells）是从犬肾组织中分离培养获得的上皮样贴壁细胞，该细胞系可连续传代[1]。
禽流感疫苗
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参考文献
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[1]沈志强.禽流感疫苗的研究进展[J].今日畜牧兽医.2009(03) [2]刘颖,唐秀英,吴凤鸣. 禽流感疫苗的研究进展[J].广东农业科学.2009(01) [3]张济培,陈建红,陈响坤,卢玉葵,司兴奎,吴悦霞.肉鹅H5亚型禽流感疫苗免疫效果的研究 [J].中国畜牧兽医.2006(12)
反向遗传基因工程疫苗
• RNA病毒的反向遗传技术(reverse genetics，RG)或称病
毒拯救，是指根据病毒基因组及其复制的特点建立操 作系统，利用克隆的cDNA产生病毒的过程。 1989年 构建了第一个流感病毒的反向遗传系统。利用反向遗 传系统能够拯救包含来自于克隆cDNA的负链RNA病毒， 这意味着挽救的病毒能够携带改变的或额外的遗传信 息。由于可以产生经过人工操作基因后的病毒，因此 在病毒的疫苗构建方面具有良好的应用前景。
甲型流感病毒检测方法及技术方案H1N1
甲型（H1N1）流感病毒实验室检测技术方案(试行)广州健仑生物科技有限公司整理本方案旨在为全国流感监测网络实验室提供甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案，不用作商业活动或赢利目的。
一、标本的采集种类和要求1、推荐采集的呼吸道标本种类疾病发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。
气管插管的病人也应收集气管吸取物。
标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃（冰箱），并马上送至实验室。
（临床样品采集人员及实验室检测人员的感染控制指导请见相关文件。
）采样同时填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单。
（附表1）2、拭子的选择标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。
不推荐棉拭子和木柄。
标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）3、临床标本储存要求保存在4℃（不能超过4天）或者-70℃或-70℃以下。
有条件的实验室均应保存在-70℃或-70℃以下。
不应保存在-20℃。
4、标本的分装处理标本送至实验室后，立即进行处理，避免反复冻融。
将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。
5、标本的运输疑似人感染甲型H1N1感染病例列为 A类，用UN2814包装运输。
填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单（附表2）。
二、核酸检测基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。
1、基于real-time RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物和探针序列为美国CDC设计）：4月29日WHO网站上公布了美国CDC设计的针对此次甲型H1N1流感病毒的real-time RT-PCR引物和探针，此实验用于检测疑似甲型H1N1流感病例的呼吸道样本, 因此，用此real-time RT-PCR的方法，建议首先筛选甲型流感病毒并排除季节性流感病毒和H5N1禽流感病毒。
不同细胞唾液酸受体类型及唾液酸转移酶与流感病毒敏感性的研究
中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第42卷第10期2020年10月Vbl.42No.10Oct. 2020doi : 10.3969/j .issn. 1008-0589.201910017不同细胞唾液酸受体类型及唾液酸转移酶与流感病毒敏感性的研究常吉祥"，杨春光蔦袁 兵駕杨子峰，，张云辉心(1.昆明理工大学医学院，云南昆明650504; 2.云南省第一人民医院昆明理工大学附属医院，云南昆明650032;3.呼吸疾病国家重点实验室呼吸疾病国家临床研究中心/广州医科大学附属第一医院，广东广州510120)摘 要：为研究人/禽流感病毒对细胞的敏感性差异，本研究选取9种常用细胞，分别以105 TCID 5o 的人源甲型流感病毒(IAV )CA04株与禽流感病毒(AIV )Y280株感染不同细胞，检测不同细胞中流感病毒的增殖水平；利用免疫 荧光试验检测细胞表面唾液酸(SA )受体类型及其与流感病毒的结合能力；采用流式细胞术定量检测每种细胞表面的 SA 类型及含量；通过RT-PCR 方法检测唾液酸转移酶(ST )(ST3GAL4、ST6GAL1)基因mRNA 的转录水平。
结果显示，感染CA04株后，MDCK 、16HBE 、DF-1和A549检测到了病毒滴度，但病毒低度较低为：3.2X102TCID 50/0.1 mL~ 0.95X101 TCIDso/O.lmLo 感染 Y280株后，病毒滴度从高到低依次为 MDCK 、DF-1、Vero 、293T 、CHO-kl, Hep-2、A549、16HBE 和BHK,病毒滴度为 6.3x10’TCIDMO.l mL~9.9xl (y TCID/O.lmL;免疫荧光试验结果显示，MDCK 、16HBE 、DF-1和A549细胞表面存在大量SAa (2-6)Gal 结构的糖链，BHK 细胞表面该糖链最少，MDCK 、DF-1和16HBE 细胞表面比其它细胞含有更多的SAa(2-3)Gal 结构的糖链，因此MDCK 、DF-1和A549细胞对人源流感病毒CA04株的结合能力最强，MDCK 、DF-1则对AIVY280株结合能力较强；流式细胞术定量分析结果显示，9种细胞中 MDCK 和DF-1细胞表面SAa (2-6)Gal 糖链结构含量最高，其结合人流感病毒CA04株的能力较强；而不同细胞表面SAa(2-3)Gal 糖链结构含量差异不大，其结合AIVY280株的能力无显著差异；RT-PCR 检测结果显示，MDCK 、DF-1细胞的ST 相关基因(ST3GAL4、ST6GALl)mRNA 转录水平高于其它细胞，BHK 细胞的ST3GAL4、ST6GAL1 mRNA 转录水平 则最低。
标准操作规程(SOP)——组织细胞半数感染量滴定
一、目的病毒组织细胞半数感染量—TCID50是病毒感染能力的标化指标。
该SOP 明确病毒组织细胞半数感染量—TCID50滴定的标准方法，保证实验结果的准确可靠。
二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员测定病毒组织细胞半数感染量。
三、程序（一）生物安全要求H5,H7亚型高致病性禽流感病毒及H2N2亚型流感病毒的操作需要在BSL-3级实验室中进行。
其余流感病毒的操作需要在BSL-2级实验室中进行。
操作人员的生物安全防护要求详见流感中心“生物安全个人防护SOP ”（二）材料1．病毒储存液2．MDCK 细胞和细胞培养液试剂MDCK 细胞：低代数的MDCK 细胞（小于25代）MDCK 细胞培养液：D-MEM +5%胎牛血清+抗生素500mL D-MEM 培养液（Gibco, Cat. #11960-051）5.5mL 青、链霉素母液(10000 U/mL 青霉素 G ；10000 µg/mL 硫酸链霉素，Gibco, Cat. #15140-122)25.5mL 胎牛血清，（Gibco, Cat. # 16000），0.22µm 过滤器过滤 EDTA-胰酶（Gibco, Cat. #25300-054）3．病毒培养液： DMEM+1%牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。
429mL DMEM66mL 7.5%牛血清白蛋白（BSA ）标准操作规程（SOP ）——染量滴定5mL 100×抗生素TPCK-胰酶（使用浓度为2mg/mL）4．其他平底96孔微量培养板红细胞计数器1％红细胞悬液Hank’s液（三）实验步骤1．MDCK细胞的制备第一天，将细胞瓶中成片生长的MDCK用EDTA-胰酶消化计数，（具体方法见“MDCK细胞培养SOP”及“细胞计数SOP”）以3×104/孔接种MDCK细胞于96孔细胞板中，37ºC 5%CO2孵育24h。
2．病毒的稀释：可采取对数或者半对数稀释的方法。
禽流感的预防与控制ppt课件
录
• 禽流感概述 • 预防措施 • 控制策略 • 实验室检测与诊断技术 • 国际合作与交流 • 总结与展望
01
禽流感概述
定义与传播途径
定义
禽流感是由A型流感病毒引起的一种禽类传染病，可感染多种家禽 和野鸟。
传播途径
主要通过飞沫、直接接触和污染的环境传播。病毒在家禽中迅速 传播，并可通过候鸟迁徙等方式进行远距离传播。
中和作用，以判断血清的免疫保护效果。
分子生物学诊断技术
1 2 3
核酸探针技术
利用特异性核酸探针与病毒核酸进行杂交，通过 检测杂交信号来判断病毒的存在和类型。
实时荧光PCR技术
采用荧光标记的引物和探针，在PCR扩增过程中 实时监测荧光信号的变化，以实现病毒核酸的快 速、灵敏检测。
基因芯片技术
将大量特异性寡核苷酸片段固定在芯片上，通过 与待检样品中的病毒核酸进行杂交，实现对多种 病毒的同时检测和鉴定。
加强国际科研合作，共同研究禽流感的病毒特性、传 播途径和防控策略。
分享先进的防控技术和经验，提高全球禽流感防控水 平。
共同应对挑战
各国应共同制定和执行统一的 禽流感防控策略和标准，形成 全球联防联控的局面。
加强疫苗研发和生产合作，确 保疫苗的安全性和有效性，提 高疫苗接种覆盖率。
共同开展禽流感病毒监测和预 警工作，及时发现并控制疫情 的传播。
完善监测和预警体系
借助大数据、人工智能等技术手段，建立更加完善的禽流感监测 和预警体系。
推动国际合作
加强国际间在禽流感防控领域的合作与交流，共同应对全球公共 卫生挑战。
持续加强防控工作
强化疫苗接种
加大禽流感疫苗接种力度，提高易感人群的免疫 保护水平。
【国家自然科学基金】_mdck细胞_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140731
2012年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 子特征 克隆 假病毒 体内 低致病性 人 中草药 β -防御素 trim22蛋白 rnai pl结构域 ns1蛋白 mirna mbd6-m2e融合基因 h5n1禽流感 h5n1 h1n1型流感病毒 h1n1 gp5蛋白 a型流感病毒 apobec-3g apobec-3f a549 6
2008年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
科研热词 推荐指数 鼠tp1112基因 2 脂质体转染 2 禽流感病毒 2 人tcp11l2基因 2 亚细胞定位 2 高致病性禽流感病毒(hpaiv) 1 防治 1 鉴定 1 药物代谢动力学 1 腺病毒,犬 1 胰岛素 1 组织病理学 1 糖尿病 1 犬α 1干扰素 1 毕赤酵母 1 毒性 1 抗病毒活性 1 抑制 1 小鼠 1 安全性 1 大鼠 1 复方中药 1 单克隆抗体 1 分离 1 分泌表达 1 免疫组织化学 1 免疫功能 1 sirna 1 pb2 1 m2蛋白 1 aiv 1
2011年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47
53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78
全国流感监测技术指南
附件2：流感监测实验技术操作规范一、流感监测临床标本的采集、运送、处理及流感病毒株的运输（一）流感临床标本的采集病毒分离成功与否很大程度上取决于临床标本的采集时间、质量及其保存和运输等环节。
多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物及尸检组织。
标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存。
常用的采样液有以下三种：pH7.4～7.6的Hank's、Eagle's或者DMEM培养基。
为防止采样液生长细菌和真菌，在采样液中可加入抗菌素，加入庆大霉素（终浓度为1mg/mL，Gibco, cat. no. 15750-078）和/或制霉菌素（终浓度为50U/mL）。
加入抗菌素以后重新调节pH值至7.4，分装每个采样管3mL，-20℃冻存。
常用采样方法有以下几种：1. 鼻拭子：将带有聚丙烯纤维头的拭子平行于上颚插入鼻孔，旋转，保持数秒，待拭子头吸收分泌物以后，缓慢转动退出。
以另一拭子拭另侧鼻孔。
将拭子头浸入采样液中，弃去尾部。
2. 咽拭子：用带有聚丙烯纤维头的拭子适度用力擦拭双侧扁桃体及咽后壁，应避免触及舌部。
同样将拭子头浸入采样液中，弃去尾部。
注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。
3. 鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。
先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。
收集抽取的粘液，并用3～5mL采样液涮洗收集器3次。
此外，对于尸检组织，必要时采集尸检的肺组织标本进行病毒分离。
（二）临床标本运输新鲜采集的临床标本应在4℃条件下48h内运送至流感监测网络实验室。
未能48h内送至实验室的，应置-70℃或以下保存。
标本送至实验室后，应尽快进行相应实验室检测，48h内能进行检测的可置于4℃保存，否则应置-70℃或以下保存。
冻存的临床采集标本应在冻存的条件下，低温送至实验室。
冻存的标本送到实验室后，应尽快进行相应实验室检测，48h内能进行检测的可置于4℃保存，否则应置-70℃或以下保存。
微量中和实验-齐立
无病毒的稀释液
（一） 测定组织细胞半数感 染剂量（TCID50）
1． 弃去微量培养板中的细胞液，250微升PBS洗细胞一次。 2． 弃去PBS（不要让细胞干燥），加入100微升/孔固定液。 3． 覆盖微量培养板，于室温固定细胞10分钟。 4． 弃去固定液，让微量培养板室温干燥。 5． 用ELISA检测细胞感染 6． 利用ELISA检测仪，于490纳米波长，测定每孔吸光度（OD）值，计数 细胞阴性对照的平均OD值。 7． 若含有不同稀释度病毒孔平均OD值是细胞阴性对照孔平均OD值的2倍以 上，则判断为病毒生长阳性。 8．根据Reed和Muench方法对病毒滴度进行核算，最终获得TCID50/100微升。 9．在进行中和试验前，稀释病毒液，使之50微升中含有100TCID50流感病毒。
160dilutionha抗原血清中的中和抗体2elisa的实验原理mdck细胞中的病毒核蛋白np抗原npag鼠抗流感病毒甲型核蛋白单克隆抗体npab病毒核蛋白抗原核蛋白单克隆抗体复合物辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg实验材料实验材料中和反应的实验材料一病毒1当使用甲5型病毒时910日龄的spf胚较好一般在37培养2628小时会得到较高的滴度一般血凝滴度在128以上方可用于中和实验2冻存的病毒不能重复使用3进行中和实验前需先进行病毒滴定tcid50的滴定进行病毒定量二血清样品1收到的被检血清要分装多份冻存于20一般不要反复冻融3次以上
50 100 50 100 50 100 50 100
细 胞 对
照
H50
1 2
3
4
5 6 7 8 9 10
11 12
加50UL(100TCID50)病毒于浅兰色孔
SYD 100 A 100 100 100 B100 100 100 100 C100 100 100 100 D100 100 100 100 E100 100 100 100 F100 100 100 100 G100 100 100 100 H100 100 100 100 1 2 3 4
哺乳动物细胞培养生产流感疫苗
哺乳动物细胞培养生产流感疫苗摘要动物细胞培养是模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术。
动物细胞培养是现代生物制药的重要技术之一，不仅可以通过直接培养动物细胞制备相关药用产品，而且还可以将动物细胞作为宿主细胞表达生产原核细胞所不能生产的药用物质。
对于许多人用和兽用的重要蛋白质药物和疫苗，尤其是那些相对分子质量较大、结构较复杂或糖基化的蛋白质来说，动物细胞培养是首选的生产方式。
传统的流感疫苗生产多采用鸡胚培养，但该生产过程易受微生物污染、内毒素残余量高、对流感大流行应急能力差，因此基于哺乳动物细胞培养的病毒疫苗工业的发展变得尤为重要。
本文重点是MDCK细胞生产流感疫苗的研究以及临床应用现状。
研究背景动物细胞培养是在动物组织培养基础上发展起来的，起源于19世纪的某些胚胎学技术，奠基人是美国生物学家哈里森(Harrison)。
1907年，哈里森采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，使细胞存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程，开创了动物组织培养的先河。
法国学者卡雷尔(Carrel)设计的卡氏培养瓶1923年用于培养鸡胚的心肌组织取得成功，极大地推动了动物细胞培养技术的建立。
流行性感冒(以下简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其临床特征是全身不适症状比一般感冒厉害，能引起心肌炎、肺炎和支气管炎等多种并发症，而且可以侵犯所有的年龄层。
由于流感病毒具有高度传染性，能在短期迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界范围内的大流行。
20世纪，甲型流感病毒曾引起过4次全球流行，1918－1919年的西班牙流感(H1N1)，历时18个月，导致二千万至四千万人死亡，是历史上最严重的一次流感暴发。
进入21世纪，禽流感成为危害世界养禽业发展的重要因素。
2004年至今，由甲型H5N1流感病毒引起的禽流感病毒肆虐全球多个国家和地区，并且由染病禽类传染到人，累计造成250多人死亡。
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一、目的
流感病毒的MDCK细胞分离方法是流感实验的关键技术，用于流感病毒的分离、培养。
本SOP是为确保MDCK细胞分离流感病毒的操作准确、规范和可靠而制定。
（二）材料
1、75％～90％成片的MDCK细胞，选用合适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做病毒分离
2、胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）
3、HEPES缓冲液，1M母液
4、D-MEM培养基，Hank's液
5、青、链霉素母液（10000U/mL 青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素
6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液
7、临床样品0.5mL
8、1mL无菌移液管
9、10mL无菌移液管
10、15mL无菌离心管
（三）实验步骤
1、准备病毒生长液
（1）细胞维持液准备
500mL D-MEM液中加入
①青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）
②牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）
③HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）
（2）病毒生长液
每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的终浓度为2µg/mL。
2．流感病毒MDCK细胞分离步骤：
（1）75％～90％成片细胞的准备，以选取T25细胞瓶为例。
①用40×物镜观察细胞生长状态。
②轻轻倒出细胞生长液，用10mL的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞3遍。
（2）细胞培养瓶的接种
①用无菌的移液管将清洗细胞的Hank's液从细胞培养瓶中移出。
②用无菌的移液管吸取适量临床标本置于细胞培养瓶中，温和摇动数次。
③然后放于37℃，5%CO2培养箱中吸附1～2h。
④吸出接种物，用10mL的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞2遍。
然后加入6mL 病毒生长液于细胞培养瓶中。
⑤放置于33～35℃培养箱培养。
⑥每日观察细胞病变情况。
（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）。
（3）细胞培养物的收获
当75%～100%细胞出现病变时进行收获，收获之前可以将细胞放于-70℃冰箱，冻融1～2次，以提高收获标本的病毒滴度（为什么反复冻融能够提高病毒滴度?）。
即使无细胞病变也应该于接种后第7天收获。
收获病毒液时，先温和摇动细胞瓶数次，然后用10mL的无菌移液管吸取病毒液置于15mL无菌离心管中，混匀病毒。
收获的病毒液可以立即进行后续试验，或冻于-80℃冰箱待以后试验使用。