CD34+细胞及分离方法
脐血CD34+细胞的分离与纯化
脐血CD34+细胞的分离与纯化张芳婷;房家智;朱萍;叶静;于洁【期刊名称】《现代检验医学杂志》【年(卷),期】2004(019)002【摘要】脐血造血干细胞的分离是进行干细胞移植、体外扩增培养的关键.研究采用明胶自然沉降法、Fi-coll分层法分离脐血MNC后,用MACS分离纯化CD34+细胞,计数并用流式细胞仪进行纯度分析.结果显示:每份脐血的采集量平均为95±52 ml,3 g/dl明胶自然沉降法所获MNC密度平均为(5.76±0.67)×107/ml;CD34+细胞密度平均为(5.53±1.16)×105/ml,较Ficoll分层法高(P＜0.01).因此,3 g/dl明胶自然沉降法是一种较理想的分离MNC的方法,用明胶沉降法和MACS相结合是分离脐血CD34+细胞的理想方法.【总页数】2页(P4-5)【作者】张芳婷;房家智;朱萍;叶静;于洁【作者单位】北京大学深圳医院中心实验室,广东,深圳,518036;北京大学深圳医院中心实验室,广东,深圳,518036;北京大学深圳医院中心实验室,广东,深圳,518036;北京大学深圳医院中心实验室,广东,深圳,518036;北京大学深圳医院中心实验室,广东,深圳,518036【正文语种】中文【中图分类】R392-33【相关文献】1.人脐血来源CD34+内皮祖细胞的分离、培养、鉴定及集落形成特性 [J], 李国强;刘珍珍;孙晟轩;安广宇;周海斌2.脐血CD34+细胞的分离与纯化 [J], 朱永宝;王雪;马京香3.免疫磁珠分离及流式细胞仪分选纯化外周血CD34+/CD90+干细胞 [J], 徐勇;霍梅4.人脐血CD34＋细胞的分离纯化及电镜观察 [J], 孙莉;罗朝东5.人脐血基质细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的作用 [J], 高蕾;陈幸华;张曦;彭贤贵;刘耀;孔佩艳;刘林;刘红;张怡因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人脐血CD34^+造血干细胞的分离和体外扩增培养问题
脐带血 ， 指的是胎儿娩 出、 脐带结扎并离断后 ， 残 留在 脐 带 内以及胎盘 近胎 儿 侧血管 内的血液 ， 其 中含有 大量 干 细 １ 材 料 与 方 法 胞， 包括造 血干细胞和间充质干细胞等。干细胞具有较强 的 １ ． １ 材料 自我复制能力 。胚胎 干细胞在 一定 的环境 条件下 可 以分 化 １ ． １ ． １ Ｕ Ｃ Ｂ来源 ： 人脐带血 由相 关医院妇 产科 提供 。 为多能干细胞 。造血 干细胞是 多能干细胞的一种 ， 是骨髓 中 １ ． １ ． ２ 仪器 和药品 ： 使用的主要仪器包括细胞 培养箱 ， 超净 的干细胞 ， 它具有 自我更 新 的能 力 ， 也能 够分化成 为各种 血 工作 台； 细胞培养 板 ， 流式 细 胞仪 ； 显 微镜 ， 照相 机 ； 电子 天 细胞前体 细胞并 最终分化 为各种血 细胞 ， 如 红细胞 、 白细 胞 和血小板 。脐带 血可以重 建骨髓造血和人体免疫 ， 多 用来治 平， 离 心机 ； 低 温冰箱等 。 使用 的药品主要包括 细胞 因子 Ｓ Ｃ Ｆ 、 Ｉ Ｌ一３ 、 Ｉ Ｌ一６ 、 Ｇ— 疗骨髓 衰竭 以及严重的血液疾病 ， 在一些遗传病 和严重 的免 Ｃ Ｓ Ｆ 、 Ｅ Ｐ Ｏ； 青霉素 、 链霉素 ； Ｎ ａ Ｃ １ 、Ｋ Ｃ Ｉ ； 甲醇 、 乙醇 ； Ｎ ａ ２ Ｈ Ｐ Ｉ Ｍ、 疫缺陷疾病 中也 被广泛应用 ， 并且获得了一定的成功。有研 Ｋ Ｈ ２ Ｐ ０ ４； Ｆ ｉ ｃ ｏ ｌ ｌ 淋巴细胞分离 液 ； 胎牛血清 ； Ｄ ＭＥ Ｍ 培养液。 究表明脐带血中含有大量的干细胞 ， 无论是对外 界刺激的反 １ ． ２ 方法： 采用胎 盘娩 出后采血法采集脐带血 ， 要求 孕妇无 应还是增值能力都 比骨髓 干细胞 强。在 体外生 长培养 中也 产科 ， 内科合并症 以及其他血液疾病。采血过程 由助产士帮 显示出 由于骨髓 干细胞 的特点 ， 比骨髓干 细胞生 长的更好 ， 助 完成 。在 无菌条件下抽取脐带血 ， 注入无 菌采血袋后置 于 即更适合做体外扩增 培养… 。脐带血不仅含 有丰 富的干细 ４℃保存 。２ ４ ｈ内分离 制备 ＭＮ Ｃ悬液 后用 Ｉ ｓ ｏ ｌ ｅ ｘ ５ ０免疫磁 胞 ， 其分泌生长 因子的能力 也很强 。此外 ， 其端 粒酶 活性也 珠分 离系统收集 Ｃ Ｄ ３ ４ 造血 干细胞 ， 用 流式 细胞 仪 检测 收 远远高于骨髓和外周血干细胞 ， 这些特点导致 了脐带干细胞 集的 Ｃ Ｄ ３ ４ 纯度 后行体外扩增 培养 。通过 血液涂 片进行形 扩增会有更强的分裂存活能力 。 态学观察。根据细胞计数调整细胞悬 液量 ， 加入胎牛血清 和 造血生长 因子分 为刺 激增殖 的刺激因子 和维持 细胞存 Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ溶液 。在 ２ ４孔培养板上做 ５组不同细胞因子组合 的 活 的存活因子 。根据各种生长 因子的不同功 能 ， 合理搭配 可 Ｃ Ｆ 、 Ｉ Ｌ一３ 、 Ｉ Ｌ一６ 、 Ｇ— 培养孔 ， 以不加细胞 因子 的培 养孔作 为生长对 照 ， 每组重 复 以起 到 协 同作 用 。 本 研 究 结 果 表 明 Ｓ 三次 ， 共培养 ６周 。每周计数单个核细胞数和集落形成单 位 Ｃ Ｓ Ｆ 、 Ｅ Ｐ Ｏ ５种细胞 因子联合 应用诱 导 Ｃ Ｄ ３ ４ 造 血干 细胞 体 且Ｃ Ｄ ３ ４ 造 血干细胞 体外 培养第 １ ３ （ Ｃ Ｆ Ｕ ） 。细胞因子分组为 ： （ １ ） Ｓ Ｃ Ｆ＋Ｉ Ｌ一 ３＋Ｉ Ｌ一６ ； （ ２ ） Ｓ Ｃ Ｆ 外扩增培养效果 最好 ， 脐 带 血 造 血 干 细 胞 的 研 究 有 不 少 成 ＋Ｉ Ｌ一３＋Ｇ—Ｃ Ｓ Ｆ ； （ ３ ） Ｓ Ｃ Ｆ＋Ｉ Ｌ一６＋Ｇ —Ｃ Ｓ Ｆ ； （ ４ ） Ｓ Ｃ Ｆ＋Ｉ Ｌ ｄ时 达 到 高 峰 。 目前 ， ３＋Ｉ Ｌ一 ６＋Ｇ—Ｃ Ｓ Ｆ ； （ ５ ） Ｓ Ｃ Ｆ＋Ｉ Ｌ一 ３＋Ｉ Ｌ一６＋Ｇ —Ｃ Ｓ Ｆ＋ 果， 但至今成功移植的例子却很有限。一方 面是 因为 干细胞 Ｅ Ｐ Ｏ。其 中浓度分 别为 ： Ｓ Ｃ Ｆ １ ０ ０ ｎ ｇ ／ ｍ Ｌ 、 Ｉ Ｌ一３ １ ０ ｉ ｒ ｇ ／ ｍ Ｌ 、 Ｉ Ｌ 的数量较少 ； 另一方面则是 由于脐带干细胞 移植入成人 骨髓 ６ ５ ０ ｎ ｇ ／ ｍＬ、 Ｇ —Ｃ Ｓ Ｆ ８ ０ ｎ ｇ ／ ｍＬ、 ＥＰ Ｏ ２ Ｕ。 的成功率较 低 Ｊ 。所 以 ， 如何提高脐带血造血干细胞 的移植 １ ． ３ 数 据分析 ： 用Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ １ ３ ． ０软件对 数据进行 统计学分析 ， 成功率 ， 如何在体外扩增和培养脐带血造血干细胞就成为 了 也是其进一步 发挥 于临床医学应用所要面对的 对数据进行 卡方 检 验。剂 量 资料采 用 平均 数标 准 差表示 。 研究的热点 ， Ｐ＜ ０ ． ０ ５表 明差异具有统计 学意义。 重费挑战。 参 考 文 献
(推荐医学)CD34绝对计数
结果报告和审核
68
报告内容
双平台ISHAGE法报告CD34+ 细胞百分比及绝对值； 单平台ISHAGE法报告CD45+ 细胞绝对值、CD34+细胞百分比 及绝对值、活CD45+细胞和 CD34+细胞绝对数。
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双平台ISHAGE设门
(5)CD45/CD34。显示R1门内细胞，设 定CD45和CD34阳性十字界线，确定 R1的左边界CD45下限。
(6)FS/SS。显示R5门内细胞，用于确 定R4的FS下限。
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单平台ISHAGE设门法
商业化的CD34+细胞绝对计数 试剂盒,其CD34+细胞绝对数由专 门软件直接计算生成，操作依据 是试剂操作说明书。实验室自己 配制的抗体组合需要加入商业化 荧光微球。
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根据CD45划定白细胞区域
作CD45/SSC散点图定位白细胞群，排 除标本中细胞碎片等对计数的干扰； CD45从强阳性到弱阳性，包括淋巴细胞、 单核细胞、粒细胞、原始细胞、嗜碱性 粒细胞和有核红细胞。
50
采集细胞数
在非设门荧光散点图中，至少 收集50000个白细胞及100个CD34+细 胞。
30
离心
为避免荧光微球的丢失，单平台计数 在裂解红细胞后不用离心洗涤。
31
双平台方法
双平台：分别用FCM检测出CD34+细胞在 有核细胞中的比例，用血液细胞计数仪检 测出有核细胞浓度，在光镜下进行白细胞 分类，然后再计算出采集物中CD34+细胞 总数。
32
双平台方法
白细胞浓度与抗体用量同单平台方法， 不需要采用已知数量的荧光微球管或加 入荧光微球悬液。裂解红细胞的时间和 方法按照所用溶血素说明书进行，裂解 红细胞后进行离心洗涤2次。
CD34+ 细胞及分离方法
目前常用于分离CD34+细胞的方法主要 是免疫吸附法（ systems based on immunoadsorption)。 尤其是用免疫磁珠吸附分离（immune adsorption on ferromagnetic beads) 的方法应用更为广泛。
CD34+细胞分离方法比较
分离方法 荧光激活细 胞计数 免疫磁珠吸 附分离 细胞物理特 性分离 细胞得率 难易程度 细胞纯度 分离速度 条件 少 大 低 难 易 易 高 高 低 慢 快 快 高 经济 经济
分离CD34ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ细胞的方法
荧光激活细胞分选 免疫吸附系统 （淘选法；免疫吸附柱层析 法；免疫磁珠法） 细胞物理参数系统（密度梯度离心法；离心计 数流式法）
流式细胞分选(fluorescence activated cell sorting,FACS)可获 得高纯度的CD34+细胞，但是由于 得量较少，受无菌实验条件等方面 的限制，所以应用较少。 细胞物理参数系统分离CD34+细胞 得率较低，而且需要提供足够的细 胞量。
免疫磁珠吸附分离CD34+细胞
利用抗CD34单克隆抗体与抗原特异结合 的特性，通过二抗介导的免疫磁珠结合， 使用Miltenyi的磁性细胞分离仪，有效的 分离纯化CD34+细胞，进一步用于造血 细胞培养，扩增，基因转染，建立造血 干细胞库等实验。
实验材料：
1.脐带血，外周血及骨髓标本； 2.PBS缓冲溶液； 3.10%BSA； 4.10mmol/LEDTA； 5.淋巴细胞分离液； 6.MACS磁性分离仪； 7.MACS分离试剂盒；
脐血CD34+细胞分离方法比较
脐血CD34+细胞分离方法比较李俊宏;刘红;林赠华;姜胜华;朱云鸿【期刊名称】《交通医学》【年(卷),期】2008(22)1【摘要】目的:比较不同方法分离脐血单个核细胞(MNC)及纯化CD34+细胞效果.方法:采集脐血48份,在室温下保存12、24、48小时,分别用密度离心法和羟乙基淀粉(HES)沉淀法分离脐血MNC,再用免疫磁珠法纯化CD34+细胞,以台盼蓝拒染法检测细胞存活率.结果:脐血在室温下保存48小时分离MNC和CD34+细胞数最多,其次为12小时,在24小时分离所得最低(P＜0.05);HES沉淀法较密度离心法分离所得MNC和CD34+细胞数明显增多(P＜0.05);6组细胞存活率差异无统计学意义(P＜0.05);免疫磁珠法纯化CD34+细胞可达(88±5)%的纯度.结论:HES沉淀法优于密度离心法,且48小时分离为优,免疫磁珠法纯化CD34+细胞可提高纯度;各种方法对细胞存活率无明显影响.【总页数】3页(P6-8)【作者】李俊宏;刘红;林赠华;姜胜华;朱云鸿【作者单位】南通大学附属医院血液科,江苏,226001;南通大学附属医院血液科,江苏,226001;南通大学附属医院血液科,江苏,226001;南通大学附属医院血液科,江苏,226001;南通大学附属医院血液科,江苏,226001【正文语种】中文【中图分类】Q462【相关文献】1.3种流式细胞术计数脐血CD34+细胞方法的比较 [J], 戴宇东;孙启俊;张益红;孟钵2.人外周血单核细胞和脐血CD34+细胞来源的树突细胞比较 [J], 陈强;陈明水;何海新;叶韵斌;张其中;李洁羽;周智峰;陈淑萍;徐莉敏3.脐血单个核细胞分离方法的比较及形态学改变 [J], 李敏;张季红;徐佩茹4.替代微量脐血CD34+造血干细胞含量公认检测方法的分析 [J], 洪雁;齐忠;孙爱峰5.脐血造血干细胞分离方法的比较 [J], 鲍建芳;林敏;杨仁儿;夏大静;沈建根;邵传森因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
应用流式细胞仪检测CD34+细胞方法学评价(全文)
应用流式细胞仪检测CD34+细胞方法学评价(全文)应用流式细胞术(FACS)测定动员后的外周血及采集的自体外周血造血干细胞(APBSC)中的CD34+细胞及其亚群，操作简单、快速、重复性好，对及时掌握最佳采集时机，准确判断采集的干/祖细胞数量具有重要指导意义。
为准确检测外周血及APBSC中的CD34+细胞，本文比较了几种FACS检测CD34+细胞方法的异同。
1 材料与方法1.1 外周血造血干细胞APBSC采集自经环磷酰胺（CTX）＋重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）动员后的实体瘤患者（淋巴瘤、乳腺癌），采集使用CS3000-Plus血细胞分离机（Baxter公司，美国）。
1.2 CD34+细胞的标记对10份APBSC分别进行2种不同再处理与CD34标记。
1.2.1 溶血法APBSC与CD34-PE荧光单克隆抗体（Immunotec，法国）室温暗处反应15min，然后用细胞裂解液溶解红细胞，待测。
1.2.2 分离单个核细胞法经Ficoll（相对密度1.007）梯度离心，收集界面层单个核细胞，与CD34-PE标记的单抗室温孵育15min，待测。
1.3 FACS检测CD34+细胞上述标记细胞悬液分为2管，其中一管6h内使用流式细胞仪（EPICSELITEESP，COULTER公司）测定CD34+细胞占单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的百分率，另一管经1％多聚甲醛固定，4℃冰箱保存72h后，FACS测定CD34+细胞数。
1.4 荧光标记的CD34单克隆抗体33份APBSC同时分别用表达第2类抗原表位QBEnd10（ClassⅡ,Immunotec）和表达第3类抗原表位8G12（HPCA2，classⅢ，BectonDickinson）的单抗进行标记，比较2组CD34+细胞百分率之间的差异。
1.5 双标记CD34/CD45 APBSC中同时加入抗CD45-FITC（J33）和抗CD34-PE（HPCA2），用溶血法处理细胞，FACS测定CD34+细胞。
造血干细胞分离培养方法
一造血干细胞分离（一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。
4℃400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。
2 percoll液密度梯度离心法①按体积比为(1.5～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。
4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。
取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。
②取鼠股骨和胫骨, 在两头关节处切开骨骼, 反复用培养基冲洗骨髓腔, 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上, 2 000 r / min 离心20 min。
吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。
3 Ficoll分离法方法一在15ml分离管中加7.5ml比重为1.017的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。
方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM 洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。
（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。
取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。
在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼, 反复用PBS 缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。
ClinMACS进行CD34+细胞分选流程和效果登记
ClinAMCAS进行CD34+细胞分选流程和效果登记患者姓名：性别：年龄病历号：诊断：体重：操作日期：以下操作应在严格无菌操作台进行Ⅰ将人血白蛋白(HSA)注入缓冲液中（1000ml缓冲液中加入HSA 5g):使白蛋白浓度调整到0.5%Ⅱ将初次白细胞采集物转移到细胞准备袋中（八爪袋。
转移前先称量八爪袋重量）1、称量八爪袋重量（全部重量）g(A2)2、将初次白细胞采集物转移至八爪袋中。
3、称量含有白细胞采集物的细胞准备袋重量（八爪袋全部爪子一起称量）g（A3）4、计算白细胞采集物重量A4=A3-A2= g（A4）（不能超过200g）注意：若超过200g则应离心去浆并将体积调整到200g以下）（白细胞采集物的保存条件：静置于19-25℃，浓度＜2×108/ml,浓度过高则应加入自体血浆稀释，即细胞总量＜4×1010，＜24小时。
若置于4℃冰箱保存，次日则应尽早将采集物从冰箱内取出，放在室温，使细胞温度自然恢复到22℃）Ⅲ稀释白细胞采集物在进行磁性标记之前要使用含0.5%HSA的CliniMACS PBS/EDTA缓冲液稀释白细胞采集物。
加入CliniMACS PBS/EDTA缓冲液量A5=A4×2= g（A5）实际加入缓冲液量g（A6）加入稀释缓冲液后细胞准备袋总重量g（A7）加入稀释缓冲液后白细胞采集物总重量A8=A7-A2= g（A8）Ⅳ将白细胞采集物重量调整到95g能够进行CD34+细胞磁性标记的白细胞采集物重量由试剂量决定。
1支试剂能够标记6×1010单个和细胞中的6×108个CD34+细胞换算成白细胞采集物重量为95g离心条件：时间：15分钟；转速1010rpm;离心力300g（A9）理论移除上清液量A10=A8-95g g（A10)实际移除上清液量g（A11）体积调整后细胞准备袋总重量g（A12)体积调整后白细胞采集物总重量A13=A12-A2= g（A13）Ⅴ进行CD34+细胞磁性标记用18-20号针头，10ml注射器抽取全部7.5ml试剂，经取样连接器口将试剂注入八爪袋中；置于摇床上，并立即计时。
人脐血CD34+造血干细胞的分离和体外扩增培养问题
人脐血CD34+造血干细胞的分离和体外扩增培养问题王丹丹;贺雪萍;武文杰;李茜;韩俊领【期刊名称】《哈尔滨医药》【年(卷),期】2013(033)001【摘要】目的通过细胞形态学观察以及计数法对分离得到的脐血CD34+造血干细胞进行研究,掌握脐血CD34+造血干细胞的生长规律和体外培养方法.方法采用Isolex50免疫磁珠法分离纯化脐血CD34+造血干细胞.在体外扩增培养中,将细胞因子SCF、IL-3、IL-6、G-CSF、EPO组合成不同实验组进行诱导,以检测单个核细胞数和集落形成单位(CFU)的形成率来找到细胞培养较好的细胞因子组合.结果本研究中使用细胞因子的细胞培养孔的单个核细胞数明显大于无细胞因子的细胞培养孔,使用此5种细胞因子联合对脐带造血干细胞培养效果最好.结论研究结果表明,不同的细胞生长因子组合会对培养CD34+造血干细胞产生不同的作用效果,对单个核细胞的增殖与扩增有明显的促进作用.【总页数】1页(P26)【作者】王丹丹;贺雪萍;武文杰;李茜;韩俊领【作者单位】协和干细胞基因工程有限公司,吉林长春300384;协和干细胞基因工程有限公司,吉林长春300384;协和干细胞基因工程有限公司,吉林长春300384;协和干细胞基因工程有限公司,吉林长春300384;协和干细胞基因工程有限公司,吉林长春300384【正文语种】中文【中图分类】R322.2【相关文献】1.转FL、GM-CSF基因的人骨髓基质细胞促进脐血CD34+细胞体外扩增 [J], 李杰;李薇;侯燕;马俐君2.GM-CSF诱导人脐血CD34+造血干细胞上CXCR3的表达 [J],3.成人骨髓间充质干细胞对脐血CD34+细胞的体外扩增作用 [J], 贾明峰;侯相麟;赵丽;刘蓓;李娟;陈轩4.人脐血基质细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的作用 [J], 高蕾;陈幸华;张曦;彭贤贵;刘耀;孔佩艳;刘林;刘红;张怡5.脐血CD34＋造血干细胞体外扩增的研究 [J], 钱文斌;林茂芳;黄河;严力行;金洁;孟海涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
DC细胞的分离及培养
DC细胞的分离及培养一、单个核细胞的分离1. 取新鲜脐带血按等体积加血液稀释液或PBS，混合均匀。
2. 将Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare）瓶来回倒置几次，以确保其混合均匀。
使用带注射针头的注射器刺穿隔片，倒置Ficoll-Paque PLUS 瓶并抽取需要量的Ficoll-Paque PLUS。
3. 将Ficoll-Paque PLUS 取3 ml 缓缓加入15 ml离心管中。
4. 轻轻加入稀释血液样品4 ml，使其置于Ficoll-Paque PREMIUM层上。
加入稀释血液时，尽量使样品与Ficoll-Paque PREMIUM分层，二者不得混合。
5. 在18-20 °C 下，离心400 g 30-40 分钟。
6. 使用无菌的吸管或移液器抽出上层液体，使淋巴细胞层在界面处保持原状。
7. 采用一无菌的吸管或移液器将淋巴细胞层移入一清洁的离心管中。
在最小量的情况下移出界面处所有的物质至关重要。
移去多余的Ficoll-Paque PLUS会导致粒细胞污染；而移去多余的上清液则会引起血小板污染。
8. 向装有淋巴细胞的试管中加入至少3倍体积的PBS溶液。
9. 用吸管轻轻地将细胞吹吸，使其悬浮。
在18-20 °C 下，以60-100 g 速度离心10 分钟，丢弃上清液。
10. 重复步骤8-9，至此，淋巴细胞应悬浮于适合CD34阳性细胞分选液中。
二、CD34阳性细胞分选1. 使用含0.5% BSA的PBS（分选buffer）重悬制备好的单个核细胞，加入50~100 μl CD34+ microbeads（Miltenyi公司），4 °C混合半个小时。
2. 选择合适的分选柱，MS柱适合50 ml血量，更多则使用LS柱。
3. 用分选buffer平衡分选柱3个柱体积后，将分选柱至于磁极上。
4. 将步骤1的悬浊液混合物以300 g 速度离心10 分钟，丢弃上清液，并使用2-3 ml的分选buffer重悬。
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讨论与总结
MACS技术在实验室处理低细胞量情况下，是 目前纯化CD34+细胞较好的方法。
CD34+细胞具有良好的扩增潜力，通过体外培 养，5周内即可以得到更多的CFU-GM形成细 胞和CD34+细胞。
CD34+细胞的大量扩增为造血干/祖细胞的定 向诱导分化提供了有利条件。
体外培养脐血单个核细胞与 CD34+富集细胞的比较
目的：在相同的条件下体外培养脐血单个核细 胞（MNC）和CD34+富集细胞，对比考察这 两种细胞扩增，集落形成和CD34+细胞扩增等 特性。
王斌，康自珍，迟占有等。体外培养脐血单个核细胞与CD34+富集细胞。 生物工程学报，2002,5(18),343-347.
2. 利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞； 3.将1*108个单个核细胞悬浮于300ul缓冲液中，
利用MACS磁性分离试剂盒制备细胞悬液500ul； 4. 将分离柱固定于MACS磁场内，将标记细胞缓
慢通过分离柱。洗脱组分为CD34-细胞； 5.将分离柱移出磁场，加1ml 缓冲液加压洗脱，
经过体外长期培养，由CD34+富集细胞培养所得 的CD34+细胞总数和CFU-GM（粒细胞-单核细胞集 落生成单位）总数均高于MNC。
小结
经过体外培养，培养前期MNC的CD34-可 能对CD34+细胞及集落形成细胞的扩增有 促进作用；
而CD34+富集细胞在培养过程中分化趋势 始终大于扩增，其总细胞的大量扩增则说 明在培养中存在大量分化。
细胞物理参数系统分离CD34+细胞 得率较低，而且需要提供足够的细 胞量。
目前常用于分离CD34+细胞的方法主要 是免疫吸附法（ systems based on immunoadsorption)。
尤其是用免疫磁珠吸附分离（immune adsorption on ferromagnetic beads) 的方法应用更为广泛。
CD34+细胞分离方法比较
分离方法 细胞得率 难易程度 细胞纯度 分离速度 条件
荧光激活细 少
难
高
慢
高
胞计数
免疫磁珠吸 大
易
高
快 经济
附分离
细胞物理特 低
易
低
快 经济
性分离
免疫磁珠吸附分离CD34+细胞
利用抗CD34单克隆抗体与抗原特异结合 的特性，通过二抗介导的免疫磁珠结合， 使用Miltenyi的磁性细胞分离仪，有效的 分离纯化CD34+细胞，进一步用于造血 细胞培养，扩增，基因转染，建立造血 干细胞库等实验。
收集CD34+细胞。 6.用免疫细胞化学和FACS分析CD34+细胞纯度
分离结果
分离前，脐带血和骨髓的CD34+细胞占单个核细 胞的1-4%，外周血仅为0.2% 。
分离后， CD34+细胞可达95-99%。CD34+抗原 组则99.6%的细胞为CD34-细胞。
回收率达70-75%，免疫磁珠分离方法得到的 CD34+细胞纯度和回收率均较高。
方法
1.Ficoll 密度梯度离心收集单个核细胞; 2.免疫磁珠分离纯化CD34+细胞. 3.MNC接种密度为5*105 cells/ml. CD34+细
胞为2*104 cells/ml于24孔板，每周取样计数， 集落检测和流式细胞分析.
结果
脐血CD34+细胞的分离结果
MNC扩增到第28天，细胞总数开始 呈下降趋势，而另一组则持续扩增8周。 在前4周中，MNC的扩增倍数远低于 CD34+富集细胞
造血干/祖细胞集落密度分析
细胞于半固体培养体系中进行集落分析，MNC的CFUGM和BFU-E集落密度都有上升，下降的过程，而CD34+ 富集细胞集落密度始终呈下降趋势，相似的是两者BFU-E 到第3周就很难检测到了。
集落密度=集落/细胞数
造血干/祖细胞总集落扩增分析
MNC的CFU-GM和BFU-E的扩增倍数在14天达到最大 值，然后开始下降。CD34+富集细胞的CFU-GM第35天 达到最大值， CFU-E在第14天达到最大值。后者的CFUGM最大扩增倍数远大于前者。
CD34+ 细胞 分离及其体外扩增
CD34+细胞
CD34+细胞是造血干细胞的表面标志分 子。
细胞表面CD34+抗原是一种相对分子质 量为110-120kD的高度糖基化的Ⅰ型膜 蛋白。它主要存在于幼稚的造血干细胞 和造血祖细胞质膜上，部分骨髓基质细 胞以及少量内皮细胞表面。
CD34+细胞在骨髓，脐带血以及外周血中 都有存在。用常规方法一般难以有效分离。 原因主要在于CD34+抗原表达的拷贝较低， 抗CD34+的亲和力低，表达CD34+抗原的 细胞存在于一个不均一的本底细胞群中， 且数量极少。
实验材料：
1.脐带血，外周血及骨髓标本； 2.PBS缓冲溶液； 3.10%BSA； 4.10mmol/LEDTA； 5.淋巴细胞分离液； 6.MACS磁性分离仪； 7.MACS分离试剂盒；
操作步骤
1. 配制含1%BSA和5mmol/L EDTA的PBS缓冲 溶液。
分离CD34+细胞的方法
荧光激活细胞分选
免疫吸附系统 （淘选法；免疫吸附柱层析 法；免疫磁珠法）
细胞物理参数系统（密度梯度离心法；离心计 数流式法）
流式细胞分选(fluorescence activated cell sorting,FACS)可获 得高纯度的CD34+细胞，但是由于 得量较少，受无菌实验条件等方面 的限制，所以应用较少。
总集落数=集落密度*细胞总数
分析可以看出，MNC的集落在培养 过程中其集落密度和集落数量都曾实 现了增高。
而CD34+富集细胞的集落只实现了 数量上的扩增，单个细胞所形成的集 落数并没有明显的增高过程。
显示，MNC的CD34+细胞的扩增倍数在第14天达 到了最大值，随后开始下降，CD大值。