心肌细胞分离方法
原代小鼠心肌成纤维细胞提取
原代小鼠心肌成纤维细胞提取方法1.提前配置0.8%胰酶 3mL、0.1%胶原酶II 10mL（均用DMEM配置），放入37℃水浴锅中预热15min；准备1个50mL的离心管，提前加入10mL含10%FBS的完全培养基，冰浴备用；2.取5-10只7天出生内的C57乳鼠，用灭菌或消毒的组织剪剪开胸腔，迅速取出心脏，置于含2%双抗的预冷的DMEM培养基中；3.将心脏组织转移至超净台，用DMEM反复清洗，取出血液、大血管组织，将组织放入1个1.5mL的EP管中，充分剪碎（小于1mm3）;4.用巴氏管向组织块中加入1mL预热的胰酶，反复吹打、吸入至含胰酶的离心管中，37℃水浴加热3min，适当振荡；[循环1]5.吸取上清液丢弃，余下的组织块中加入2mL胶原酶，37℃水浴加热5min，期间每分钟振荡1次，吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环2]6.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次）后水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环3]7.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀2min后（约30次），此时肉眼可见组织块逐渐变小，呈透明粘液状，随后再次水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环4、5]8.向组织块中再次加入1mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次），此时肉眼可见组织块逐渐消失，消化液变得浑浊，再次水浴消化3min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环6、7]；9.将50mL离心管中的液体分装入2个15mL离心管中，1000rpm离心6min，小心吸去上清液，组织/细胞沉淀加入1mL完全培养基吹打混匀后转移至50mL的培养瓶中，加3mL完全培养基（含4%双抗），2h后可见细胞贴壁，12h内换液；2-3d后常规传代（1:2），P1-2用于实验。
原代乳鼠心肌细胞分离培养的改进
原代乳鼠心肌细胞分离培养的改进包馨慧;李晓梅;杨毅宁;马依彤;陈邦党;陶静;陈小翠【期刊名称】《新疆医科大学学报》【年(卷),期】2015(000)005【摘要】目的：探讨提高细胞纯度、存活率及活性的乳鼠心肌分离培养方法。
方法改进心脏组织的处理方法，用胰酶预处理后再用II 型胶原酶依次处理心肌组织，采用差速贴壁及化学药物纯化心肌细胞。
结果提取的单个心肌细胞结构完整，呈类圆形；12 h 时大部分细胞贴壁；24 h 后几乎全部贴壁，仅见少量漂浮细胞，贴壁细胞伸出伪足，呈梭形、三角形等，细胞出现自主搏动。
48 h 后心肌细胞伪足间形成联接，交织成网状，局部心肌细胞出现同步搏动。
3 d 后心肌细胞聚集成簇，呈岛屿样搏动。
心肌细胞存活率为96．6％，纯度＞96％。
结论此改进方法所提取培养的乳鼠心肌细胞存活率及纯度高，细胞活性好，结构功能完整，可用于相关实验中原代乳鼠心肌细胞的分离培养。
%Objective To improve the traditional method of culturing neonatal rat myocytes for the better purity,survival rate and activity of myocytes in experiments.Methods Trypsin and type Ⅱ collagen en-zyme were used to digest heart tissue and myocytes were purified with differential sticking wall method and chemical purification.Results The extracted single myocyte is of structural integrity and circular shape. Most cells were touching to wall in 12 hours,and all cells sticking to wall in 24 hours,with small amount of floating cells.The touching-wall cells extended pseudopodia in the form offusiformis,triangle and so on,with independent rhythm.Myocardialcells′pseudopodia became connected into webs 48 hours later, with local synchronization rhythm.There days later,myocytes gethered into clusters,with island-like pulse.The activity and purity of myocytes was up to 96%.Conclusion This method helped improve the activity and purity of myocytes,and protect the integrity of cells.The extracted myocytes could be used in relative experiments.【总页数】4页(P564-566,570)【作者】包馨慧;李晓梅;杨毅宁;马依彤;陈邦党;陶静;陈小翠【作者单位】新疆医科大学第一附属医院心脏中心，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院心脏中心，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院心脏中心，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院心脏中心，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院心脏中心，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院心脏中心，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院心脏中心，乌鲁木齐 830054【正文语种】中文【中图分类】Q463【相关文献】1.SD乳鼠原代心肌细胞培养方法的改进 [J], 张晓京;张建栋;来丽娜;宋丽华;张晓一;郭春花;郑王巧;宋晓亮2.乳鼠心肌细胞原代培养方法的改进 [J], 王宁;李应东3.原代SD仔鼠心肌成纤维细胞分离与培养方法的改进 [J], 张平;谭延振;张冰;赵荣;金振晓;易定华;孙阳;易蔚;李香敏4.乳鼠心肌细胞的原代培养方法的改进 [J], 陈妍;王振远;郭秀侠;于洪涛;邓英杰5.一种改良的原代大鼠乳鼠心肌细胞分离及培养方法 [J], 程俊;曾晓荣;谭晓秋;李鹏云;文静;陈琳琳;杨艳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
心脏成纤维细胞原代细胞培养
乳鼠心肌成纤维细胞分离与培养一、实验动物1~3日龄C57小鼠乳鼠10只。
二、试剂及配制高糖DMEM( gibco)、Ⅰ型胶原酶（MP）、0.25%胰蛋白酶(solarbo公司), 胎牛血清（gibco 160000-044）、青霉素-链霉素混合液（solarbo）。
培养液: DMEM培养基：FBS：双抗 100：10：1（45ml：5ml：0.5ml）酶消化液:将胰蛋白酶用PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)稀释, 配成0.1%胰蛋白酶消化液;将Ⅰ型胶原酶溶于PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)中, 配成0.1%的胶原酶消化液。
0.1%胰蛋白酶及01% Ⅰ型胶原酶以2∶1混合, 现配现用。
三、实验仪器超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机……四、组织消化和分离细胞1、将乳鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。
用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用聚维酮碘消毒胸、腹部皮肤。
2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。
用眼科虹膜剪在剑突处正中线稍偏左向上开胸后用剪子压住胸骨右缘, 使心脏自然跳出, 用弯镊子勾住心脏根部, 取出心脏, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。
3、将鼠心脏全部取出后, 剪去心房、剔除心脏上结缔组织、脂肪及血管, 预冷ＰＢＳ液清洗3次, 去除血污。
4、将心脏剪成约1mm ×1mm×1mm的组织块, 刮入加有搅拌子的锥形瓶中, 酶消化液冲洗剪刀及培养皿, 转移至锥形瓶中。
5、加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍, 37 ℃水浴, 打开磁力搅拌器, 60r/min搅拌10min, 吸管轻轻吹打组织块1min分散细胞, 自然沉降2min后遗弃上清液。
6、再次加入消化酶液8～15ml消化8min。
五、培养细胞1、吸取上清液入离心管, 加入预冷培养液2ml, 吹打均匀后, 1 200r/min离心4min, 弃上清, 细胞沉淀加预冷的培养液吹打后成细胞悬液用封口膜封口放于冰中备用。
心肌细胞分离与培养的教学内容与方法探讨
学内容 ， 提 高了教学质量和教学水平 。
△通讯作者 Ｅ － ｍ ａ ｉ ｌ ： ｗ ａ ｎ ｇ ． ｓ ｈ ｉ ． ｊ ｉ ｅ ＠ｓ ｔ ｕ ． ｘ ｊ ｔ ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ
一
起 观察现象 ， 分 析原因 ， 寻找对策 。Ｂ组 学生的实验报告撰 写按 普通学 生实验 报告格 式进行 。（ ３ ） 评价： ①学生 评价 ， 口头
或 书面 ， 既指 出其优 点 ， 也指 出其不 足 ； ②教 师评价 ， 经 过综合 开放性 实验教 学培训 的学 生“ 科 研兴趣 提高 ” ， “ 积 极主 动性增 强” ， “ 动手能力更强”， “实验报 告撰 写内容更加丰 富、 规范” 等。（ ４ ） 困难 ： ① 缺乏 足够充分 的思想认识 ； ②适 当的管理模 式 ；
科研经验丰富 的教师 （ 主要是病理生理学专业 ） 组成 。（ ２ ） 实施 ： 将 １ ５ ０名本 科生先 按性别分 组 ， 再 根据随机 的原则将 男女学
生分别分配到 Ａ、 Ｂ两个实验组 ， Ａ组为综合开放性 实验 组（ ７ ５人 ） ， Ｂ组为验证性实验组 。Ａ组 学生在教师的指导下正确设计 实验 ， 并通过查 阅有关 文献 、 参考 资料 、 手册 、 工具书及其它信息源 获得 信息以解决实际问题 ， 当实验中遇到难题 ， 老师和他们
・
１ ９ｌ ７・
针 对 医 学本 科 生 的 综 合 开 放 性 实 验 教 学 实 践
汪 洋， 应 磊， 郝 卯林 ， 王 万铁
（ 温州医科大学病理生理学教研 室 ， 浙江 温州 ３ ２ ５ ０ ３ ５ ）
细胞培养方法与步骤
实验方法—细胞培养
二.细胞培养 • 1.心肌细胞分离
取0~3 d的SD小鼠10只，酒精擦洗消毒，用剪刀从最下端肋骨处开始 剪开胸腔，找到心脏后，剪取心尖心室部分3，立即放入预冷的ADS 缓冲液（116 mmol / L NaCl，20 mmol / L HEPES，0.012% NaH2PO4 2H2O，0.1% Glucose，0.04%KCl，0.01% MgSO4 7H2O）中漂洗3次，然后将心室组织拿到超净工作台中，剪成0. 5 -1 mm3大小的组织块，再用4 预冷的ADS缓冲液漂洗2次以去除血细胞 及漂浮的结缔组织，加入用ADS缓冲液配制的消化酶8 mL（0.05Ⅱ型 胶原蛋白酶和0.06%胰蛋白酶），然后将消化酶和组织的混合液吸入 到50 mL的离心管中，置于37 恒温水浴摇床中，37 恒温振荡10 min. 重新加入8 mL消化酶，恒温振荡8 min，小心吸取上清到一个加有 400 L胎牛血清的15 mL离心管中，混匀，1 000 r / min离心5 min，去 掉上清，可看到离心管底部有淡黄色的细胞沉淀，加入37 预热的培 养基3 mL（72% DMEM，18%M199，10%胎牛血清），吸打混匀， 然后放到CO2培养箱（5% CO2，37 ）中培养，培养过程中注意离心 管盖子不能拧的太紧，几分钟后要拿出来颠倒混匀几次. 重复消化4~5 次，直到组织全部消化完。
实验方法—测定方法
• 取相同量的0.4%苔芬蓝液与细胞悬液混匀，静置310 min， 然后取适量混合液滴于细胞计数板上，计数总细胞数及未 染成蓝色的活细胞数.计数10次，取平均值. 细胞存活率 （%）=活细胞数/细胞总数（活细胞数+死细胞数） *100%
预期实验结果
1. 台盼蓝染色，死细胞被染成蓝色，用细胞计数板计数，统 计3次试验各4个视野的细胞数，细胞存活率大于95%. 2. 通过在显微镜下比较传统胰蛋白酶法和改进的胰蛋白酶+ 胶原蛋白酶法所分离得到的心肌细胞，用改进的方法所得 到的心肌细胞要明显多于传统的方法。
心肌细胞
心肌细胞培养实验方法[基本原理]心肌细胞培养用机械方法及酶消化法，将心肌细胞分离成单个细胞，用培养基制成心肌细胞悬液，在体外适宜条件下使之生长繁殖，并保留其结果与功能特性。
[设备及试剂]1 仪器设备：超净工作台、二氧化碳培养箱(可用恒温培养箱代替)、离心机、电磁搅拌器、恒温水浴、PH值测定仪、普通及倒置显微镜等,以及一般实验室设备.2 常用试剂有以下几种：培养基：常用Eagle、199、1640、F10、F12、PuckN-16B SM20等。
其中国产的Eagle培养基（MEM)较为常用，根据实验的特殊要求，可选用无糖、缺氧，不同浓度的各种无机离子等特殊培养基。
平衡盐溶液：常用磷酸缓冲盐溶液（P、B、S），无钙镁磷酸缓冲盐溶液（CMF-PBS）及Hank’S液等。
消化液：常用胰蛋白酶（Difco 1:250)，必要时加用胶原酶，弹性蛋白酶等。
抗菌素溶液：取青霉素100万单位，链霉素1g，用双蒸馏水或磷酸缓冲液100ml，配成双抗液备用。
[操作步骤]1 心肌组织的选择：选择乳鼠的心脏。
2 心肌组织块的制备：乳鼠用75％乙醇或1％新洁尔灭消毒皮肤，固定四肢，胸部向上，再用2％碘酊及75％乙醇分别消毒胸腹部皮肤，用虹膜剪剪开胸部皮肤，暴露皮下组织，再用碘酊及乙醇消毒皮下组织，更换剪子及镊子，开胸取心，在盛有磷酸缓冲液或Hanks 液的瓶皿中洗涤后，剪去心房，将心室放入另一平皿中，用吸管吸取磷酸缓冲液反复冲液三次，洗净残留积血。
将一定数量的心室放入三角瓶或离心管的侧壁上，用虹膜剪剪成1mm3碎块，以备消化。
3 心肌细胞悬液的制备：根据实验要求，可选用一次或分次消化法制备细胞悬液。
后者较为常用，在大离心管中放入组织碎块及0.06~0.25% 的胰蛋白酶溶液8~15ml，加入磁棒两根，在磁力搅拌器上，37℃水浴中消化10分钟，自然沉淀，弃去上清，再加入胰蛋白酶液8~15ml，消化10分钟，再用吸管吹打组织块1分钟，自然沉降后，将上清液及沉淀物分别处理。
酶解法分离犬肺静脉肌袖和心房肌细胞
酶解法分离犬肺静脉肌袖和心房肌细胞黄焰;侯月梅【摘要】目的:探索简单实用重复性好的犬肺静脉肌袖和心房肌细胞的分离方法.方法: 采用两步酶解法,分离得到犬肺静脉肌袖细胞和心房肌细胞,用形态学和台盼蓝染色鉴别分离的心肌细胞,使用倒置显微镜观察和摄像记录.结果: 分离心肌细胞的存活率为30%～60%,形态呈杆状、折光性好、横纹清晰,膜状态良好.结论: 使用两步酶解法能获得存活率高,数量较多的心肌细胞,是一种简单实用的分离心肌细胞的方法.【期刊名称】《新疆医科大学学报》【年(卷),期】2008(031)011【总页数】3页(P1513-1515)【关键词】犬;酶解法;肌袖;心房肌细胞【作者】黄焰;侯月梅【作者单位】新疆医科大学第一附属医院心脏中心,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学第一附属医院心脏中心,新疆,乌鲁木齐,830011【正文语种】中文【中图分类】R-332;R542.220世纪70年代以来，国外就已开展胶原酶二步灌流法分离哺乳动物的心肌细胞[1]。
细胞制备的质量直接影响实验的成功率。
因此，制备合适的细胞标本是非常重要的。
现在多用酶解分离成年动物心脏作细胞标本，心脏各部位组织细胞的电生理特性不尽相同，所以使得人们把最初集中于对心室肌细胞的研究逐步扩展到对心脏各部位的组织细胞中。
这项技术在我国开展不多，本研究采用胶原酶二步消化法对6只成年家犬心肌细胞进行了成功的分离,现报道如下。
1 材料和方法1.1 实验动物健康成年杂种犬(普通级)6只，体重15～20 kg，雌雄不拘，新疆医科大学第一附属医院医学实验动物中心提供，试验方案经伦理委员会审议同意并签署批准意见。
1.2 试剂和溶液的配制胶原酶(worthington公司，392 U/mg)；无钙液(mmol/L)：NaCl 137，KCl 5.4，MgCl2 1，NaH2PO4 0.33，HEPES10(SIGMA公司)，葡萄糖10，用NaOH调pH至7.4。
异丙肾上腺素实验报告
一、实验目的1. 了解异丙肾上腺素对心肌细胞收缩力的影响；2. 掌握心肌细胞收缩力测定的方法；3. 分析异丙肾上腺素对心肌细胞收缩力的影响机制。
二、实验原理心肌细胞收缩力是指心肌细胞在收缩过程中产生的力量。
异丙肾上腺素是一种儿茶酚胺类物质，具有激动β受体、增强心肌收缩力的作用。
本实验通过测定异丙肾上腺素对心肌细胞收缩力的影响，探讨其对心肌细胞收缩力的调节作用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜心脏组织、异丙肾上腺素、生理盐水、磷酸盐缓冲液（PBS）、氯化钾、钙离子载体、荧光染料等；2. 实验仪器：显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、细胞培养箱、酶标仪等。
四、实验方法1. 心肌细胞分离：取新鲜心脏组织，剪去血管和脂肪，将心肌组织剪成1mm×1mm×1mm的小块，用酶消化法分离心肌细胞；2. 心肌细胞培养：将分离得到的心肌细胞接种于培养皿中，在细胞培养箱中培养至细胞密度达到80%；3. 异丙肾上腺素处理：将培养好的心肌细胞分为实验组和对照组，实验组加入一定浓度的异丙肾上腺素，对照组加入等体积的生理盐水；4. 心肌细胞收缩力测定：利用激光共聚焦显微镜观察心肌细胞在异丙肾上腺素处理前后的收缩情况，并通过荧光分光光度计测定心肌细胞收缩力；5. 数据分析：对实验数据进行分析，比较实验组和对照组心肌细胞收缩力的差异。
五、实验结果1. 实验组心肌细胞在异丙肾上腺素处理后，收缩幅度和速度明显增加，与对照组相比，收缩力显著增强（P<0.05）；2. 异丙肾上腺素处理后，心肌细胞内钙离子浓度升高，表明异丙肾上腺素通过增加心肌细胞内钙离子浓度来增强心肌细胞收缩力。
六、讨论1. 异丙肾上腺素是一种重要的儿茶酚胺类物质，具有增强心肌收缩力的作用。
本实验结果表明，异丙肾上腺素可以显著增强心肌细胞收缩力，这与异丙肾上腺素激动β受体的作用有关；2. 异丙肾上腺素增强心肌细胞收缩力的机制可能是通过增加心肌细胞内钙离子浓度来实现的。
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成体SD大鼠心肌细胞分离实验程序
溶液配方：
1. 无钙台式液（含5%CO2的氧气饱和30min,NaOH调节pH 7.35-7.4 ）
MW mM
g/L
g/100mL
g/200mL g/500mL
NaCl
58.44 143 8.3569 0.8357 1.6714 4.1785
KCl
74.55 5.4 0.4026 0.0403 0.0805 0.2013
MgCl2.6H2O
203.21 0.5 0.1017 0.0102 0.02 0.0509
NaH2PO4 .2H2O
155.98 0.33 0.0515(0.0468) 0.0052 0.01 0.0258
BDM
D-glucose（用时加）
180.2 5 0.9909 0.0991 0.1982 0.4955
去离子水
1000mL
2.
台式液（含5%CO2的氧气饱和30min,NaOH调节
pH 7.35-7.4）
MW mM g/L
g/100mL g/200mL g/500mL
NaCl 58.44 136.9 8.0004(8.3569) 0.8 1.6 4
KCl 74.55 5.4 0.4026 0.0403 0.0805 0.2013
CaCb 110.98 1.8 0.1998 0.02 0.02 0.1
MgCl2.6H2O 203.21 0.5 0.1016 0.0102 0.0203 0.0508
NaH2PO4 .2H2O2 155.98(156.01) 0.33 0.0515(0.0468) 0.0051 0.0103 0.0257
BDM
D-glucose 180.2(198.17) 10(5) 1.802(0.9909) 0.1802 0.3604 0.901
去离子水
1000mL
3. KB 液(含 5%CO2 的氧气饱和 30min,NaOH 调节 pH 7.35-7.4)
MW mM g/L
g/100mL g/200mL g/500mL
KCL 74.55 ；25 [1.8638 0.1864 0.3728 0.9319
Tauri ne（
牛
磺 酸
）
125.15
20
2.5028 0.2503 0.5006 1.2515
L-Glu 147.13 ：70 M0.2991 1.03 2.0599 5.1496
KH 2PO4 136.09 10 1.3609 0.1361 0.2722 0.6805
MgCL2.6H2O 203.21 3 0.6096 0.0610 0.1220 0.3048
EGTA
（钙螯
合剂）
380.35 0.5 0.佃01 0.0190 0.0380 0.0951
D-glucose 180.2 10 1.802 0.1802 0.3604 0.901
BDM
去离子水
1000mL
4. 酶液：（NaOH 调节 pH 7.35）
4.1 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007]
100mL酶液A:胶原酶I +胰蛋白酶，100ml无钙台式液+40mg collage nasel +6mg
胰
蛋白酶
45mL酶液B： 45ml无钙台式液 +18mg collagenasel
4.2 [王振国.四医大硕士论文。 2005]
30mL酶液：30ml无钙台式液+18mg胶原酶I +21mg BSA
5. 复钙液（NaOH调节pH 7.35）
5.1
20mL 复钙液 A: 20mL 无钙台式液 +10mgCaCI2+20mg BSA
。
20mL复钙液 B: 20mL无钙台式液 +20mgCaCI2+20mg BSA
。
20mL复钙液 C: 20 mL台式液 +20mg BSA
。
5.2
100mL 复钙液 A: 100mL 无钙台式液 +1.1mgCaCI2, 100mg BSA
。
100mL 复钙液 B: 100mL 无钙台式液 +5.5mgCaCI2, 100mg BSA
。
50mL复钙液 C: 50 mL台式液 +50mg BSA
。
5.1 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007]
复钙液A:取无钙台式液加入CaCI2至0.1mmol/L,BSA至
1 mg/ mL
复钙液B :取无钙台式液加入CaCl2至0.5mmol/L, BSA至
1 mg/mL
复钙液C:取台式液加入BSA至1 mg/ mL。
6.
心肌细胞分离
其步骤简述如下：
1. 3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠（30mg/kg
体重）
2.
迅速开胸取出心脏并置于冰浴下的含氧台式液中,使心脏剧烈收缩排出心腔内
残留的血液，然后迅速将心脏固定于 Lan ge ndorff灌流系统上。
3. 经主动脉灌流（37T
）含氧无钙台式液
4. 心脏停跳后，换以含胶原酶I（ 0.6g/L）和牛血清蛋白（BSA,0.7g/L
）的无钙 台式
液灌流约
10min
5.
心脏变松软，灌流液流出速度明显加快后，再换以无钙台式液灌流冲洗残留酶 液约
2min。
6. 去除新房及主动脉，并将心室组织置于含 2%BSA的含氧KB （37C）
液中。
7. 将心室组织剪碎，以粗头吸管轻轻反复吹打并经 200
目筛网过滤细胞悬液。
8. 室温静置10min沉降分离心室肌细胞（一说100X离心5min
），保留沉淀并换入 新
鲜含2%BSA的KB液。
9. 静置40min后逐步复钙至终浓度1.8X 10-3mol/L （一说1.25X 10-3mol/L），
得
到钙 耐受心室肌细胞，保存于含1.8 X 10-3mol/L CaCl2的台式液中备用。
另一说 ：
8. 250目尼龙网过滤，静置10min,弃上清液，加入复钙液A 5-7mL，静置复钙 15min
（ 使心肌细胞自然沉降 ） ，弃上清液后加入复钙液 B 5mL 静置复钙 15min
， 弃上
清加入复钙液C,静置15min备用。
9. 暗室中负载Fura-2 AM Ca2+荧光探针染色，500此台式液加1让DMSO
（二甲 基亚
砜）溶解的Fura-2 AM Ca2+荧光探针。15min后缓慢颠倒混匀，15min之后上 仪器检
测。
注意事项：灌流消化过程中维持7.5~ 10.0 kPa的压力,所有液体均用0.22卩n滤器
过滤除菌且用体积分数95%的02+体积分数5%的CO2混合气体饱和，灌流温度 保持在
35C,实验室温度保持在20-30Eo