原代小鼠心肌成纤维细胞提取
小鼠原代心肌细胞分离
分离小鼠原代心肌细胞与大鼠原代细胞分离有所不同方法：1、所有器械（四把镊子两把剪刀）放在75%酒精中浸泡6 h以上。
2、用PBS溶液（过滤灭菌）配制0.075%胰酶20mL备用（胰酶原液0.25%，6ml原液可以稀释至20ml）。
3、新生（1天）乳小鼠15-20只，器械在酒精灯上灼烧消毒备用。
4、准备两个冰盒，在其中一个冰盒中放两个平皿，皿内盛放PBS溶液（无色），把灼烧后的一把镊子倒插在该冰盒中（用于涮洗心脏）。
另一个冰盒中同样放两个平皿，其一放PBS溶液，其二放1 mL0.075%胰酶，同样把灼烧后的一把镊子和一把剪刀（用于剪碎心脏）倒插在该冰盒中，所剩的两把镊子和一把剪刀灼烧后倒置用于解剖，切勿污染。
5、乳鼠两只一组处死消毒取样，方法：将其轮流放入装有75%酒精的烧杯中6 s即可。
6、从胸骨下端开始向上解剖乳鼠，剪至颈部，打开胸腔，挤出心脏，用镊子取心脏心室部分放入第一个成有PBS溶液的平皿中，速度越快越好，以保持心肌细胞的活性。
7、待取完所有心脏后，在冰盒中使用冰盒中的镊子涮洗和挤压心脏以尽量除去心脏中的血液，置于冰盒中的另一个平皿中，继续洗去血液，若有心脏上存有心房则用镊子拔去，可使用第二个冰盒中的镊子，依次放入第三个皿（第二个冰盒）中洗净。
8、将洗净的心脏放入第四个放有1 mL 0.075%胰酶的平皿中，将皿倾斜，使心脏全部浸入胰酶的平皿中，将皿倾斜，使心脏全部浸入胰酶中，用剪刀剪碎心脏后，吸入所剩的149mL胰酶中4 ℃消化24h。
9、消化24h后，吸出11mL胰酶，加入9 mL0.1%的胶原酶Ⅱ（此时浓度为0.05%，配胶原酶需用0.2 μm滤器过滤），将18 mL的细胞液装入高压过的小烧杯中，加入磁力棒，在磁力搅拌器上搅拌30 min，温度维持在34-35 ℃左右，120 rpm。
10、配制两种培养液，DMEM-F12 10%FBS，DMEM-F12 15%FBS Brdu（10 mg/mL的Brdu母液，在DMEM-F12 15%FBS中每20mL加67μL，心肌细胞对Brdu的耐受性较其他细胞高，以保护心肌细胞减少其他细胞主要是成纤维细胞的污染）。
乳鼠心肌细胞分离步骤
一、细胞室灭菌1.将酒精灯、止血钳、枪、滴管架子、离心管架子、器械饭盒等清点无误后置于超净台内，紫外照射20-30min。
2.（注：物品不可重叠放置，否则会遮挡射线。
培养细胞和培养用液不可照射紫外。
）3.将实验服等摊开置于培养室，打开紫外照射20-30min。
4.紫外照射结束后，打开超净台风机，吹10min，吹走O3。
5.（注：若超净台内物品不全，向台内拿取物品前，应先用75%酒精喷洒消毒。
）二、胶原酶1的配置分离心肌细胞的胶原酶1浓度为：10mg胶原酶/12ml PBS。
具体方法为：（以下过程均在超净台内操作）1.称取10mg胶原酶于小烧杯中。
2.加入12ml PBS溶液。
3.灼烧止血钳，夹出青霉素小瓶，灼烧备用。
4.用10ml一次性无菌注射器吸取小烧杯中溶液，用一次性无菌滤器过滤于青霉素小瓶中，即得到无菌的胶原酶1溶液，呈淡土黄色。
三、取材并分离心肌细胞1.用止血钳取5-6个平皿，分别加入适量PBS溶液。
2.用止血钳夹住小烧杯壁，从器械饭盒中取出剪刀、镊子等器械。
3.准备2个小烧杯，加入75%酒精适量，一个置于超净台外，一个置于超净台内。
先将乳鼠头朝下置于外面的小烧杯中消毒2min左右，取出，拿进超净台内，置于内部的小烧杯中消毒2min.4.左手捏住乳鼠背部皮肤，暴露出胸腔，右手拿一直的小剪刀，在中间靠左处剪开皮肤，左手轻轻一捏，其心脏即弹出来。
5.剪下心室部分置于含PBS的平皿中。
6.待8只乳鼠心脏全部取定后，换手套，喷酒精。
7.左手拿镊子，右手拿剪刀，在心脏中间部位剪一刀，成“肉夹馍”形，在PBS中冲洗干净，洗去血细胞。
8.将心室转移到另一新的培养皿中，继续清洗，此时可继续打开心室，取出余血。
9.继续冲洗2-3遍，10.将洗好的心脏置于含转子的带盖玻璃瓶中（提前将转子取出置于干净处），加入2ml PBS溶液。
11.灼烧剪刀，左手拿玻璃瓶，右手拿剪刀剪碎心脏成不能再剪的碎片。
12.用枪吸掉上清，只留碎片，将转子放入玻璃瓶中，盖好盖子备用。
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养物品准备：6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。
操作步骤：（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。
（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。
使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。
（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。
（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。
注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。
消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。
（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。
（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。
不要收集倾向于漂浮的组织碎片。
（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。
（9）800r，离心5min。
（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。
（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。
（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。
（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。
此时成纤维细胞类似于小圆点。
（14）收集并丢弃上清液。
用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。
在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。
乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞的原代培养
１ ３ 实验 仪 器 超 净 工 作 台 （ 海 浦 东 物 理 光 学 ． 上
仪器 厂 ） Ｃ 培养 箱 （ 国 Ｓ Ｅ ＬＬ Ｂ公 司 ） 普 、Ｏ 美 Ｈ Ｌ Ａ 、
通光 学显微 镜 （ 日本 Ｏ ｙ ｕ ） 离心 机 （ 大利 Ａ Ｃ ｌ ｍｐ ｓ 、 意 Ｌ 公 司） 。 等
胎 牛血清 为接 种培养 液 ， 加入 １ ％新 生 牛 血清 为 交 ０
换 培养液 。酶 消化液 ： 将胰 蛋 白酶溶 于 Ｐ Ｓ缓 冲液 Ｂ （ Ｈ ７ ２～ ． ） ， ｐ ． ７ ４ 中 配成 ０ １ ． ％胰 蛋 白酶 消化 液 ； 将
Ｉ 型胶原 酶 溶 于 Ｐ Ｓ缓 冲 液 （ Ｈ ７２～７４ 中 ， Ｂ ｐ ． ． ） 配 成 ０ ０ ％ 的 胶 原 酶 消 化 液 。０ １ 胰 蛋 白 酶 及 ．８ ．％
１４ 方 法 ．
维细胞 培养 常存 在 污染 、 消化 不 全 和 纯度 不 够 等 现 象 。为此 ， 们 参 照 Ｓｍ ｓｎ等 的 培养 方 法 并 作 我 ｉｐｏ
了改进， 摸索 出一种简便 、 可靠 ， 且同时能培养出心 肌细 胞和心 脏成 纤维 细 胞 的方法 ， 心肌 细 胞 和 心 为 脏 成纤 维 细胞 的 体外 研究 提供 了 更 有 效Байду номын сангаас的技 术 手 段 ， 作报道 。 现
０ ０ ％ Ｉ型胶原 酶 以 ２ １ ．８ ： 混合 ， 配现用 。 现 １ ２ 实验 动物 １～ Ｆ龄 Ｓ ． ３ ｔ Ｄ大 鼠 １ ２ ０～ ５只 ， 由 本 院实验 动物 中心提 供 。
［ 收稿 日期 ］２ ０ －６３ ０９０ －０ ［ 作者单位 ］１蚌埠 医学院 药理学教 研室 ， ． 安徽 蚌埠 ２ ３ ３ ２ 蚌 ３０ ０；． 埠医学 院第一附属医院 心血管 内科 ， 安徽 蚌埠 ２ ３０ ３ ０４ ［ 作者简介 ］张乃菊 （９ １一） 女 ， 士研究生． １８ ， 硕 ［ 通讯作者 ］祝晓光 ， 研究生导师 ， 教授．
小鼠成纤维细胞原代培养
实验-小鼠成纤维细胞的原代培养一、实验目的1.掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术与操作过程。
2.熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态与生长状况的方法。
3.了解细胞原代培养与传代培养的原理与方法。
二、实验原理自17世纪下半叶Robert Hooke提出“细胞”概念直至20世纪中叶,细胞培养(Cell culture)才逐渐发展起来。
现代生命科学以及相关领域的研究前提就是细胞的维持与增殖,因此,细胞培养不仅就是细胞生物学的密不可分的组成部分,而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学与神经科学、甚至临床医学的重要内容。
细胞培养也就是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。
如今,细胞培养已经成为生命科学与医学研究最常用的基础技术之一。
细胞培养就是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下,使其生存、生长、繁殖与传代,进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
细胞培养的直接目的就是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞,细胞培养分为原代培养与传代培养。
1.原代培养(primary culture)就是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
原代培养就是建立细胞系的第一步,其最基本的方法有两种:组织块培养法与消化培养法。
组织块培养法就是指直接从机体取下组织与器官,通过组织块直接长出单层细胞,该培养法就是最常用的原代培养方法,其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料,一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行,培养的细胞较易存活,适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后,在不加任何粘附剂的情况下,直接移植在培养瓶壁上,加入培养基立即进行培养的方法。
心包膜成纤维细胞原代培养报告---细胞定制案例
心包膜成纤维细胞的分离、培养和鉴定材料和试剂：来源：c57小鼠心脏手术器材：手术剪（镊）、解剖镊、眼科剪（镊）清洗液：PBS培养液：DMEM添加20%FBS 200IU双抗破红液：常规配方具体操作：1、将100uL的4％戊巴比妥注入C57小鼠体内，待小鼠麻醉至昏厥状态时，将小鼠转入75%的酒精最浸泡5min。
2、在无菌条件下，将小鼠放置于泡沫板上，四肢用针头固定。
3、用左手持直头眼科镊子夹住小鼠腹部最下方的皮毛，右手拿手术剪将小鼠的皮剪开，沿着腹部下方一直剪至小鼠下颚。
4、左手换一个无菌的弯头眼科镊子夹住最下方的腹腔，右手拿另一个无菌的手术剪将小鼠的腹腔剪开，剪开胸膜，找到心脏。
5、在无菌条件下，左手拿弯头眼科镊子将心脏轻轻固定，右手拿手术剪，剪去连在心脏上的结缔组织，取C57小鼠心脏，去除多余的组织，用预冷的PBS清洗3次。
6、左手拿直头眼科镊子，轻轻心脏固定，右手拿弯头眼科镊子撕取心脏的两层外包膜，尽量不带其他组织，若不小心带上其他组织，可用镊子轻轻的将其他组织捋去。
7、左手拿直头眼科镊子将分离的心包膜轻轻固定，右手用动脉剪剪成1mm³大小的组织块后，用破红液浸泡2分钟，去除血细胞，再用PBS清洗2-3次。
8、将组织块植入6孔板，组织块之间的间隙在3 mm³左右，用枪头吸取多余的液体，将6孔板倒扣在培养箱中2小时，加入培养液1mL静置培养7天，7天即可观察到心包膜成纤维细胞爬出，如图所示。
9、7天后移去组织块，待细胞长满6孔板后，用时差贴壁法纯化细胞，细胞纯度达90%以上后，可冻存保种。
结果展示：1.从细胞形态学：成纤维细胞为长梭形状，且从心包膜组织块中爬出，知道长满整瓶图1.成纤维细胞正从心包膜组织块中爬出2、荧光鉴定：使用波形蛋白Vimentin抗体进行荧光鉴定图2，用波形蛋白抗体对成纤维细胞进行免疫荧光鉴定结果图3，用波形蛋白抗体对成纤维细胞进行免疫荧光鉴定结果武汉云克隆诊断试剂研究所。
高效分离培养乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的方法[发明专利]
![高效分离培养乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/a9884f7d842458fb770bf78a6529647d272834c1.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010680696.2(22)申请日 2020.07.15(71)申请人 四川大学华西医院地址 610041 四川省成都市武侯区国学巷37号(72)发明人 黄方洋 李君丽 田格尔 周骏腾 (74)专利代理机构 成都虹桥专利事务所(普通合伙) 51124代理人 伍云萍(51)Int.Cl.C12N 5/077(2010.01)(54)发明名称高效分离培养乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的方法(57)摘要本发明属于细胞分离培养技术领域，具体涉及一种高效分离培养乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的方法。
针对现有大/小鼠乳鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞分离效率低、活性差、操作条件不易控制的问题，本发明提供了一种方法，包括以下步骤：a、取乳鼠心脏，清洗后转移至含胰蛋白酶的分离液中，剪碎；b、组织块在分离液中消化后，吸走上清，剩余物中加入消化液，消化；c、移液管吹打混匀，静置，转移上部悬浮液，对下部的组织块再加入消化液消化；d、悬浮液混合，离心，弃上清，重悬细胞，孵育，成纤维细胞和心肌细胞。
本方法能够高效分离心肌细胞，得到的心肌细胞活性高，得率高；还能同时获得心肌成纤维细胞，适宜工业化生产。
权利要求书1页 说明书6页 附图2页CN 111876378 A 2020.11.03C N 111876378A1.高效分离培养乳鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：a、取乳鼠心脏，置于含Blebbistatin的PBS溶液中清洗后，转移至含胰蛋白酶的分离液中，剪碎心脏成小的组织块；b、将步骤a所述组织块在10～15ml分离液中消化，2～8℃消化4～12小时后，吸走上清，剩余物中加入消化液，在37℃下消化20～30min；c、步骤b消化完成后，采用移液管吹打混匀，静置，转移上部悬浮液，对静置后下部的组织块再加入消化液，在37℃下消化20～30min，直至无肉眼可见组织块；d、将步骤c消化后得到的悬浮液混合，离心，弃上清，采用铺板培养基重悬细胞，孵育30～60min，成纤维细胞铺于相应孔板中，上清中的细胞即为心肌细胞。
小鼠心脏成纤维细胞说明书
小鼠心脏成纤维细胞说明书
1、组织来源：小鼠乳鼠
2、产品规格：25cm2培养瓶
3、细胞简介：
小鼠心脏成纤维细胞分离自正常大鼠心脏组织，细胞呈梭型、多边形等不规则形状。
体外培养的小鼠心脏成纤维细胞对于研究其生理功能、药物作用以及各种致病因素作用下的病理生理改变具重要意义。
本公司生产的小鼠心脏成纤维细胞采用酶解法制备而来，细胞总量约为1×106个/瓶，细胞纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
二、使用方法
客户收到细胞后，请按照以下方法进行操作。
1、取出25cm2培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态；
2、待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养；
3、细胞传代
（1）吸出25cm2培养瓶中的培养基,用PBS清洗细胞一次；
（2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，37℃温浴1-2min左右；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化；
（3）用吸管轻轻吹打混匀，按1:2或1:3等适当的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5ml，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；
（4）待细胞完全贴壁后，培养观察。
之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。
（备注：由于实验所用试剂与操作环境的不同，以上方法供各实验室参考。
）
三、注意事项
1、培养基于4℃条件下可保存3-6个月；
2、在细胞培养过程中，请注意保持无菌操作；
3、传代培养过程中，胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态；
4、该细胞只可用于科研。
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原代小鼠心肌成纤维细胞提取方法
1.提前配置0.8%胰酶 3mL、0.1%胶原酶II 10mL（均用DMEM配置），放入37℃水浴锅中预热15min；准备1个50mL的离心管，提前加入10mL含10%FBS的完全培养基，冰浴备用；
2.取5-10只7天出生内的C57乳鼠，用灭菌或消毒的组织剪剪开胸腔，迅速取出心脏，置于含2%双抗的预冷的DMEM培养基中；
3.将心脏组织转移至超净台，用DMEM反复清洗，取出血液、大血管组织，将组织放入1个1.5mL的EP管中，充分剪碎（小于1mm3）;
4.用巴氏管向组织块中加入1mL预热的胰酶，反复吹打、吸入至含胰酶的离心管中，37℃水浴加热
3min，适当振荡；[循环1]
5.吸取上清液丢弃，余下的组织块中加入2mL胶原酶，37℃水浴加热5min，期间每分钟振荡1次，吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环2]
6.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次）后水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环3]
7.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀2min后（约30次），此时肉眼可见组织块逐渐变小，呈透明粘液状，随后再次水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环4、5]
8.向组织块中再次加入1mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次），此时肉眼可见组织块逐渐消失，消化液变得浑浊，再次水浴消化3min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环6、7]；
9.将50mL离心管中的液体分装入2个15mL离心管中，1000rpm离心6min，小心吸去上清液，组织/细胞沉淀加入1mL完全培养基吹打混匀后转移至50mL的培养瓶中，加3mL完全培养基（含4%双抗），2h后可见细胞贴壁，12h内换液；2-3d后常规传代（1:2），P1-2用于实验。