高效液相色谱法检测南极磷虾油中总虾青素含量
南极磷虾油关键质量指标检测及对比分析
南极磷虾油关键质量指标检测及对比分析南极磷虾油是一种新型的抗炎抗氧化保健油，具有极其重要的实用价值。
为了掌握南极磷虾油中关键性质量指标，本文将对比分析不同厂家南极磷虾油中的关键质量指标。
关键质量指标主要有脂肪酸含量、抗氧化性和稳定性等。
脂肪酸含量的关键指标是ω-3和ω-6的丰度比（EPA/DHA），南极磷虾油的EPA/DHA比例一般为3∶1，其中EPA含量绝大部分在20%以上，DHA 一般在10%以上。
抗氧化性是衡量南极磷虾油是否具有防止细胞老化、杀菌病毒和保护肝脏等功效的一个重要指标。
主要指标包括维生素E、维生素A 和α-亚麻酸等，维生素E和维生素A含量一般为100 mg/100 g，α-亚麻酸含量一般为500 mg/100 g。
稳定性是指油在加热、煮沸和蒸煮的条件下，油质不变的性能。
南极磷虾油的稳定性有很高的要求，一般表现为抗热稳定性、抗氧化稳定性和抗氧化抗热稳定性。
市面上常见的几种南极磷虾油的质量指标如下：1. A品牌油：EPA/DHA含量在20%-30%之间，维生素E含量在100 mg/100 g之上，维生素A含量在100 mg/100 g之上，α-亚麻酸含量在500 mg/100 g之上，稳定性高。
2. B品牌油：EPA/DHA含量在15%-25%之间，维生素E含量在90 mg/100 g之上，维生素A含量在90 mg/100 g之上，α-亚麻酸含量在400 mg/100 g之上，稳定性较高。
3. C品牌油：EPA/DHA含量在10%-20%之间，维生素E含量在80 mg/100 g之上，维生素A含量在80 mg/100 g之上，α-亚麻酸含量在300 mg/100 g之上，稳定性一般。
通过对比分析，可以明显的看出，A品牌南极磷虾油的关键质量指标最好，B品牌表现也非常不错，而C品牌则比较一般，其中EPA/DHA 含量较低。
通过上述分析可以看出，在挑选南极磷虾油时，需要重点关注其关键质量指标，特别是EPA/DHA含量。
GPC_HPLC法测定南极磷虾油中虾青素及校正因子计算_孙伟红
南极磷虾通常指的是南极大磷虾 （ Euphausia superba） ［1］， 磷虾油是从磷虾中获得， 与鱼油相似， 磷虾油富含长链的 ω － 3 不饱和脂肪酸， 主要包括 EPA 和 DHA。磷虾油中还含有各种有效的抗氧化 VA、 VD、 剂， 包括 VE 、 虾青素和角黄素， 其抗氧化 ［2 ， 3， 8 ～ 11 ］ 。 其中， 能力指数 （ ORAC ） 是鱼油的 48 倍 虾青素具有很强的抗氧化能力 素的主要来源
第 32 卷第 2 期 2013 年 2 月
分析试验室
Vol. 32． No． 2
GPC-HPLC 法测定南极磷虾油源自虾青素及 校正因子计算1 * 1 1 孙伟红 ，冷凯良 ，邢丽红 ，朱 2 1 1 1 敏 ，翟毓秀 ，苗均魁 ， 朱兰兰
（ 1． 中国水产科学研究院黄海水产研究所 ， 青岛 266071 ； 2． 中国海洋大学食品科学与工程学院 ， 青岛 266100 ） 摘 要： 以保健食品南极磷虾油为研究对象， 建立了测定南极磷虾油中虾青素含 量的全自动凝胶渗透色谱（ GPC ） 净化 － 高效液相色谱分析方法。样品采用 GPC
Tab. 1
凝胶渗透色谱作为一种样品的净化手段之一 ， GPC 在富含脂肪、 色素等大分子的样品分离净化
［13 ］ 方面， 具有明显的优势 。 样品运行前， 对自动凝胶色谱系统的淋洗条件
进行了选择。采用推荐流速 5. 0 mL / min 洗脱， 淋 乙 酸 乙 酯： 环 己 烷 = 洗剂 为 乙 酸 乙 酯 和 环 己 烷， 1∶ 1 ， 以紫外检测器检测虾青素标液的流出时间以 确定组分收集。由凝胶色谱净化流出曲线可见， 虾 青素及其酯的流出时间在 7. 48 ～ 12. 60 min 之间。 在溶 剂 洗 脱 条 件 下， 以 一 定 浓 度 标 液 进 样， 重复 5 次， 96. 2% 、 虾 青 素 的 回 收 率 分 别 为： 95. 3% 、 95. 8% 、 97. 1% 、 95. 1% ， 均大于 95% 。 2. 2 2. 2. 1
虾青素 液相色谱
虾青素 液相色谱
虾青素是一种天然的色素，广泛存在于海洋生物中，尤其是在深海生物中含量较高。
虾青素具有天然的抗氧化性能，能够帮助保护身体免受自由基的损害，同时还能够增强免疫力，改善皮肤质量等多种功效。
液相色谱是一种分离和分析化学物质的方法，它通过在液相中进行化学反应，将不同化学物质分离出来，从而实现对各种物质的定量和定性分析。
虾青素的液相色谱分析方法是一种比较常用的分析方法，它可以快速准确地测定虾青素的含量和纯度，为虾青素的研究和应用提供了重要的数据支持。
虾青素的液相色谱分析方法需要采用高效液相色谱仪等专业设备，并且需要进行样品前处理，如提取、分离、纯化等步骤，以保证分析结果的准确性和可靠性。
同时，虾青素的液相色谱分析方法还需要选择合适的分析条件，如色谱柱、流动相、检测波长等参数，以达到最佳的分离效果和检测灵敏度。
总的来说，虾青素的液相色谱分析方法是一种比较常用的分析方法，它可以快速、准确、可靠地测定虾青素的含量和纯度，为虾青素的研究和应用提供了重要的数据支持。
高效液相色谱法测定虾青素油中虾青素的含量
DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.025283引用格式:孔凡华,徐佳佳,郭倩,等.高效液相色谱法测定虾青素油中虾青素的含量[J].食品与发酵工业,2021,47(6):214-220.KONG Fanhua,XU Jiajia,GUO Qian,et al.Determination of astaxanthin in astaxanthin oil by high performance liquid chromatography[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(6):214-220.高效液相色谱法测定虾青素油中虾青素的含量孔凡华2,徐佳佳2,郭倩2,白沙沙2,李东2,方从容1,邱楠楠1∗,崔亚娟2∗1(国家食品安全风险评估中心,国家卫生健康委员会食品安全风险评估重点实验室,北京,100021)2(北京市营养源研究所,北京,100069)摘㊀要㊀该研究建立了高效液相色谱法测定虾青素油中虾青素含量的分析方法㊂利用单因素实验,对虾青素油中虾青素的提取试剂㊁酶解时间进行选择,确定最佳前处理条件为37ħ恒温水浴振荡酶解60min ,石油醚提取㊂色谱条件:YMC TM C 30色谱柱(250mm ˑ4.6mm ,5μm ),柱温30ħ,流动相为甲醇-甲基叔丁基醚梯度洗脱,流速1mL /min ,检测波长472nm ㊂结果表明,全反式虾青素在0.10~4.00μg /mL 范围内与峰面积有良好线性关系,精密度的相对标准偏差(relative standard deviation ,RSD )为1.36%,表明精密度高,平均回收率为93.58%,回收率的RSD 为2.84%,表明添加回收率高,相对标准偏差小,实验建立方法测得虾青素油中虾青素的含量为92.9%,是碱性皂化测得结果的2.11倍,所建立的方法可以准确定量虾青素油中虾青素的含量㊂关键词㊀高效液相色谱法;虾青素油;虾青素;全反式虾青素;9-顺-虾青素;13-顺-虾青素第一作者:硕士,工程师(邱楠楠副研究员和崔亚娟研究员为通讯作者,E-mail:qiunannan@;cuiyj66@)㊀㊀基金项目:十三五国家重点研发计划(2016YFD0400600)收稿日期:2020-08-05;改回日期:2020-10-05㊀㊀虾青素为萜烯类不饱和化合物,化学名称是3,3ᶄ-二羟基-4,4ᶄ-二酮基-β,βᶄ-胡萝卜素,是一种具有超级抗氧化活性的类胡萝卜素[1],其抗氧化性能是维生素E㊁维生素C㊁β-胡萝卜素㊁叶黄素和玉米黄质的几十倍甚至几百倍[2-4]㊂雨生红球藻㊁红法夫酵母㊁南极磷虾㊁一些浮游生物㊁藻类㊁螃蟹外壳㊁河螯虾外壳㊁牡蛎㊁三文鱼皮㊁鲑鱼等动物中含有虾青素㊂虾青素具有多种生物功能,它能终止生物系统中炎症的发生[5]㊁对抗自由基损伤以维持免疫系统防御[6]㊁降低心脏病发病的风险[7]㊁减轻神经退行性疾病带来的影响[8]㊁抑制肿瘤发生和生长[9]及对抗紫外线引起的光氧化损伤[10]等㊂虾青素具有较长的共轭双键链,结构复杂,化学性质不稳定,存在多种同分异构体,虾青素及其异构体的定性定量分析是结构解析和功能研究的基础㊂天然虾青素大多与脂肪酸结合,以酯化的形态存在,但由于缺乏虾青素酯标准品,且人工合成虾青素酯困难,限制了虾青素酯的定性定量研究㊂虾青素酯脱去脂肪酸链后可以形成游离的虾青素,包括全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素等,使虾青素的定量研究变得容易操作[11]㊂目前,虾青素脱脂的主要方法是碱性皂化和酶解方法,碱性皂化脱脂会产生副产物并引起虾青素降解[12],食品化学法典(FCC )(2012)[13]采用来自假单胞杆菌的胆固醇酯酶(EC3.1.1.13)进行虾青素酯的酶解,可以使虾青素酯水解完全㊂色谱技术的发展在虾青素的定性定量分析上起了非常重要的作用,随着紫外可见光谱㊁质谱㊁核磁共振波谱法㊁红外光谱㊁拉曼光谱和圆二色光谱的快速发展,虾青素的结构鉴定变得更为简单容易,考虑到设备的成本,样品制备的复杂程度和方法的局限性,虾青素的定量分析方法主要是分光光度法和高效液相色谱法㊂分光光度法具有快速简单㊁适用范围广㊁成本低等优点,但是只能对虾青素总量进行估算,无法对其中虾青素的存在形式进行准确的测定㊂高效液相色谱法分离效果好㊁灵敏度高㊁选择性好成为目前测定虾青素的常用方法㊂我国测定虾青素的标准方法有‘红球藻中虾青素的测定液相色谱法“(GB /T 31520 2015)[14]适用于雨生红球藻藻粉中虾青素含量的测定;‘水产品及其制品中虾青素含量的测定高效液相色谱法“(SC /T 3053 2019)[15]适用于鱼类㊁甲壳类及虾粉㊁磷虾油等制品中虾青索含量的测定;‘进出口动物源性食品中角黄素㊁虾青素的检测方法“(SN /T 2327 2009)[16]适用于黄鱼㊁鳗鱼㊁鸡肉㊁鸡蛋㊁鸭肝㊁猪肾和牛奶中角黄素㊁虾青素的测定与确证;‘植物提取物虾青素油“(T/CCCMHPIE 1.23 2016)[17]适用于以人工培养的红球藻属雨生红球藻为原料经提取精制后,得到的虾青素油中虾青素的测定㊂以上标准方法通过有机溶剂直接提取或者碱性皂化脱脂后提取虾青素,容易引起虾青素的降解[12],导致测量结果不准确或对测定结果造成干扰;标准方法多采用三相洗脱系统分离虾青素及其异构体,对液相系统要求高㊂本文参照虾青素检测的标准方法[14-17]和文献方法[13,18-23],设计单因素实验,对提取试剂㊁胆固醇酯酶酶解时间进行优化,以虾青素含量的高低作为评价指标,筛选最佳提取试剂和酶解条件;通过比较色谱柱㊁流动相等高效液相色谱条件,以全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素的分离度和峰形对称性作为评价指标,筛选最佳色谱条件,实现虾青素油中虾青素的有效提取和高效分离㊂以虾青素油为研究对象,进行方法学验证,考察方法的科学性㊁准确性和适用性,并比较实验建立的酶解方法与文献中的碱性皂化方法[18]对虾青素油中虾青素的提取效率,以期建立虾青素油中虾青素的精准分析检测技术㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料与试剂超临界二氧化碳萃取的雨生红球藻虾青素油,市购;全反式虾青素对照品(纯度96.9%),Dr.Ehren-storfer GmbH;9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素对照品(纯度ȡ95.0%),Sigma公司;胆固醇酯酶16.3U/mg,月旭科技股份有限公司㊂甲醇㊁乙腈㊁甲基叔丁基醚㊁二氯甲烷㊁乙酸乙酯(均为色谱纯),美国Fisher公司;无水乙醇㊁无水硫酸钠㊁氢氧化钠㊁浓盐酸(分析纯),北京化工厂;石油醚(分析纯),福晨(天津)化学试剂有限公司;丙酮(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;三羟甲基氨基甲烷(Tris)(分析纯),浙江联硕生物科技有限公司㊂1.2㊀仪器与设备BS224S分析天平,德国赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;METTLER TOLEDO pH计,梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司;QL-901斡旋振荡器,海门市其林贝尔仪器制造有限公司;ZHWY-110X30往复式恒温水浴摇床,上海智诚分析仪器制造有限公司;KQ-500DE型数控超声波清洗器,昆山市超市仪器有限公司;HITACHI CF16RXII高速冷冻离心机,日本日立科技有限公司;安捷伦1260高效液相色谱仪,配二极管阵列检测器和ChemStation for LC sys-tems色谱工作站,美国Agilent公司;YMC TM C30色谱柱,5μm,250mmˑ4.6mm(内径)㊂1.3㊀方法1.3.1㊀溶液的配制㊀㊀(1)0.021mol/L氢氧化钠-甲醇溶液:称取0.084g 氢氧化钠,加入80mL甲醇溶解并定容到100mL㊂㊀㊀(2)0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=7):准确称取3.0285g Tris,加入450mL去离子水溶解后,用0.5mol/L的盐酸调节pH至7.0,然后用去离子水定容至500mL㊂㊀㊀(3)胆固醇酯酶溶液:称取6.2mg胆固醇酯酶于25mL容量瓶中,用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液定容至刻度,胆固醇酯酶溶液浓度约为4U/mL,现用现配㊂㊀㊀(4)全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素标准储备液:分别准确称取全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素标准品1mg,分别置于25mL棕色容量瓶中,加丙酮溶解并定容至刻度,摇匀,得到浓度为40μg/mL标准储备液,现用现配㊂㊀㊀(5)全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素混合标准工作溶液:准确移取全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素标准储备溶液,用丙酮稀释成各浓度均为0.80μg/mL的标准工作溶液,用于定性,现用现配㊂㊀㊀(6)全反式虾青素标准工作溶液:准确移取全反式虾青素标准储备溶液,用丙酮稀释成浓度分别为0.10㊁0.20㊁0.40㊁0.80㊁1.60㊁4.00μg/mL的标准工作溶液,现用现配㊂1.3.2㊀色谱条件的选择孙伟红等[19]研究表明,C30色谱柱对虾青素异构体的分离效果和响应值优于C18色谱柱,更有利于定量结果的分析,所以本实验选择YMC TM C30色谱柱㊂参考标准方法和文献方法,选择甲基叔丁基醚-乙腈(体积比95ʒ5)[20]㊁甲醇-甲基叔丁基醚-水(体积比83ʒ15ʒ2)[21]㊁水-甲醇-二氯甲烷-乙腈(体积比4.5ʒ28ʒ22ʒ45.5)[22]㊁水-甲醇-二氯甲烷-乙腈(5ʒ85ʒ5ʒ5)[23]和甲醇-甲基叔丁基醚[24]等流动相体系洗脱,以全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素的分离度作为评价指标,优化全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素分离的色谱条件㊂1.3.3㊀提取溶剂的选择虾青素油用丙酮稀释500倍作为实验用虾青素油样品㊂实验参照食品化学法典FCC th(2012)[23]的方法,并加以改进㊂称取10mg虾青素油样品于15mL离心管中,样品称取15份,分别加入2mL Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L,pH=7)和1mL胆固醇酯酶(4U/mL)溶液振荡均匀后,在37ħ恒温水浴振荡器内振荡酶解60min,取出立即冷却至室温㊂向每份酶解液中分别加入2.0mL石油醚㊁二氯甲烷-甲醇(体积比1ʒ3)㊁丙酮㊁乙腈㊁甲醇-乙酸乙酯-石油醚(体积比1ʒ1ʒ1),每种提取溶剂做3个平行,每份样品均加入1g无水硫酸钠后在涡旋振荡器上涡旋提取2min,静置分层后,分别将上层溶液转移至10mL容量瓶中,重复提取2次,合并提取液于容量瓶中,氮气吹干后,用甲醇定容至刻度,溶液过0.45μm有机系滤膜后,待测定㊂1.3.4㊀酶解时间的选择称取10mg虾青素油样品于15mL离心管中,分别加入2mL Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L,pH=7)和1.0mL胆固醇酯酶(4U/mL)溶液振荡均匀后,在37ħ恒温水浴振荡器内分别振荡酶解15㊁30㊁45㊁60㊁75㊁90㊁120min,取出立即冷却至室温,用石油醚提取,其他操作步骤同1.3.3㊂1.3.5㊀方法验证按照GB/T27404 2008‘实验室质量控制规范食品理化检测“[25]方法学要求,建立校准曲线及校准曲线的工作范围;逐步稀释样品上机测定,R(S/N) =3时的测定浓度作为检出限,R(S/N)=10时的测定浓度作为定量限;称取虾青素油样品,按照实验优化的方法,平行测定6次,计算虾青素的含量,并计算相对标准偏差,考察方法的重现性;根据虾青素油样品中虾青素的含量,按本底值的0.5倍㊁1倍㊁1.5倍3个浓度水平,进行3水平6平行加标回收实验,以回收率的高低评价方法的准确度㊂1.3.6㊀碱性皂化脱脂方法参见YUAN等[18]和苏芳[26]的方法,称取10mg 虾青素油样品于15mL离心管中,加入5mL0.021 mol/L氢氧化钠-甲醇溶液,5ħ水浴中避光皂化60 min,加入2mL纯净水和2mL石油醚,在涡旋振荡器上振荡2min,静置分层后,将上层溶液转移至10mL容量瓶中,重复提取2次至石油醚层无色,合并提取液于容量瓶中,氮气吹干后,用甲醇定容至刻度,溶液过0.45μm有机系滤膜后,测定㊂1.4㊀虾青素含量的计算1.4.1㊀标准曲线的制作将各浓度全反式虾青素标准品工作溶液,9-顺式虾青素和13-顺式虾青素标准品工作溶液按实验优化的色谱条件进行液相色谱分析,根据虾青素异构体组分的保留时间定性㊂选定峰面积相近的全反式虾青素的标准工作液多点校准定量,试样测定结果以3种虾青素同分异构体的总和计,外标法定量,同时,标准工作液和样液的响应值均应在仪器检测的线性范围内㊂1.4.2㊀结果计算试样中虾青素的含量X以质量分数计,按式(1)计算㊂X=(1.3ˑA13-cis+A tras+1.1ˑA9-cis)ˑC sˑVˑfA sˑmˑ100(1)式中:X,试样中虾青素的含量,%;1.3,13顺-虾青素对全反式虾青素的校正因子;A13-cis,试样溶液中13-顺-虾青素的峰面积;A tras,试样溶液中全反式虾青素的峰面积;1.1,9-顺-虾青素对全反式虾青素的校正因子;A9-cis,试样溶液中9-顺-虾青素的峰面积;C s,标准工作液中全反式虾青素的含量,μg/mL;V,试样溶液体积,mL;A s,标准工作液中全反式虾青素的峰面积;m,试样质量,mg;f,稀释倍数㊂1.5㊀数据处理通过与仪器配套的ChemStation for LC systems工作站软件完成数据的采集与处理㊂数据的差异性分析在SPSS软件上进行,P<0.05时,说明差异水平显著㊂2㊀结果与分析2.1㊀色谱条件的选择不同流动相体系对全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素分离效果见表1㊂目前,多采用三相洗脱系统[14-15,17,19,27]或者正相洗脱系统[26]分离虾青素及其异构体,对液相系统要求较高,且普适性较差㊂本实验通过优化液相色谱条件,采用甲醇-甲基叔丁基醚两相梯度洗脱,可以实现3种虾青素异构体的有效分离,结果如图1所示,优化得到分离虾青素的色谱条件为:色谱柱:YMC TM C30色谱柱,5μm,250mmˑ4.6mm (内径)或相当者;柱温:30ħ;流动相:见表1;流速: 1.0mL/min;检测波长:472nm;进样量:20μL㊂表1㊀色谱条件的优化Table1㊀Optimization of chromatographic conditions流动相洗脱程序流速/(mL㊃min-1)柱温/ħ分离度1甲基叔丁基醚-乙腈(体积比95ʒ5)等度洗脱 1.030 1.12 2甲醇-甲基叔丁基醚-水(体积比83ʒ15ʒ2)等度洗脱 1.030 1.33 3水-甲醇-二氯甲烷-乙腈(体积比4.5ʒ28ʒ25ʒ45.5)等度洗脱 1.030 1.21 4水-甲醇-二氯甲烷-乙腈(体积比5ʒ85ʒ5ʒ5)等度洗脱 1.030<00-12.0min,A相85%-70%;12.0-20.0min,A相70%-20%;5A-甲醇;B-甲基叔丁基醚20.0-22.0min,A相20%; 1.030ʎC 2.1922.0-22.1min,A相20%-85%;22.1-25.0min,A相85%;㊀㊀注:所有进样体积均为20μL,色谱柱为YMC TM C30,5μm,4.6mmˑ250mm色谱柱;检测波长是472nm(ref=off);分离度是指13-顺式虾青素和全反式虾青素的分离度(全反式虾青素和9-顺式虾青素的分离度均大于2.0)㊂图1㊀全反式虾青素㊁9-顺式虾青素㊁13-顺式虾青素标准溶液液相色谱图Fig.1㊀Chromatograms of all trans astaxanthin,9-cis-astaxanthin,13-cis-astaxanthin2.2㊀提取溶剂的选择室温条件下,虾青素在丙酮㊁二氯甲烷㊁二甲亚砜㊁乙醇及其他非极性溶剂中的溶解性较好[28]㊂本试验根据前人研究基础,选取5种不同提取溶剂,比较不同提取溶剂对虾青素油中虾青素的提取得率,结果显示,石油醚对虾青素的提取效果最佳,显著高于其他提取溶剂(P<0.05),结果见表2,虾青素油中虾青素异构体的HPLC色谱图见图2㊂表2㊀不同提取溶剂的提取结果(n=3)Table2㊀Results of different extraction solvents(n=3)提取溶剂虾青素含量/%石油醚92.9ʃ3.38二氯甲烷-甲醇(体积比1ʒ3)80.3ʃ2.53丙酮85.2ʃ1.58乙腈70.5ʃ1.99甲醇-乙酸乙酯-石油醚(体积比1ʒ1ʒ1)72.1ʃ3.012.3㊀酶解时间的选择胆固醇酯酶的酶解时间影响虾青素酯的酶解效果,酶解时间不足,会导致酶解不完全,酶解时间过长,会造成虾青素的降解,不同酶解时间提取结果见表3㊂图2㊀虾青素油脂中全反式虾青素㊁9-顺式虾青素㊁13-顺式虾青素液相色谱图Fig.2㊀Chromatograms of all trans astaxanthin,9-cis-astaxanthin, 13-cis-astaxanthin in astaxanthin oil表3㊀不同酶解时间的提取结果(n=3) Table1㊀Results of different enzymolysis time(n=3)酶解时间/min虾青素含量/%1581.9ʃ5.303086.7ʃ6.334584.4ʃ4.226092.9ʃ3.387590.6ʃ1.979091.0ʃ7.2112084.4ʃ1.54由表3知,在37ħ条件下,随着酶解时间的延长,虾青素的含量增加,60min时酶解完全,虾青素含量为92.9%,继续酶解到75min和90min,虾青素含量分别为90.6%和91.0%,与60min时没有显著性差异(P> 0.05),酶解120min,虾青素含量明显降低(P<0.05),其原因可能是温度对虾青素的降解破坏作用导致,因此酶解时间需要严格控制,以避免虾青素的损失,以4U/mL胆固醇酯酶37ħ条件下酶解60min最佳㊂2.4㊀方法验证2.4.1㊀线性关系、检出限及定量限按照1.3.3操作,在2.1色谱条件下进行HPLC分析,得到全反式虾青素为0.10~4.00μg/mL,浓度与峰面积有良好的线性关系,虾青素的检出限为0.1 mg/g,定量限为0.3mg/g㊂2.4.2㊀方法精密度实验按实验优化的前处理方法和色谱条件,平行测定6次,虾青素油中虾青素含量的相对标准偏差(rela-tive standard deviation,RSD)为1.36%,表明精密度高,适合虾青素的定量分析,结果见表4㊂表4㊀方法精密度结果(n=6)Table4㊀Results of precision(n=6)测定组分测定结果/%123456均值SD RSD/%虾青素92.893.991.690.391.491.792.0 1.25 1.36 2.4.3㊀方法准确度实验准确度为分析方法测定的平均值与真值相符的程度㊂稳定样品中加入不同水平已知量的标准物质(将标准物质的量作为真值)称加标样品;同时测定虾青素油和虾青素油加标样品;加标样品扣除样品值后与标准物质的误差即为该方法的准确度,按公式(2)计算㊂P/%=X1-X0mˑ100(2)式中:P,加入的标准物质的回收率;m,加入的标准物质的质量,μg;X1,加标试样的测定值,μg;X0,未加标试样的测定值,μg㊂采用样品加标试验进行本方法准确度验证,结果见表5㊂表5㊀加标回收率实验结果(n=6)Table5㊀Results of recovery rate of ginger(n=6)加标量/μg编号虾青素本底值/μg虾青素测定值/μg回收率/%平均回收率/%RSD/ %jb1-114.81022.30093.59jb1-214.73022.13092.458jb1-314.50021.77090.89jb1-414.44021.70090.79jb1-514.42021.65090.39jb1-614.39021.66090.91jb2-113.47027.96090.61jb2-213.15027.86091.9316jb2-312.95027.94093.6893.58 2.84 jb2-413.02028.03093.81jb2-513.08027.69091.32jb2-613.04028.08094.00jb3-114.38537.62396.83jb3-213.94437.57898.4824jb3-314.64337.48595.17jb3-414.44037.17594.73jb3-513.96237.12296.50jb3-613.72337.32698.35由表5可知,虾青素油中虾青素的回收率为90.39%~98.48%,平均回收率为93.58%,RSD为2.84%,表明方法添加回收率高,相对标准偏差小,适合虾青素含量的测定㊂2.5㊀不同脱脂方法测得虾青素的含量比较实验建立的胆固醇酯酶酶解方法㊁碱性皂化方法对虾青素油中虾青素的提取效率,结果见表6㊂表6㊀不同脱脂方法测定结果(n=3)Table6㊀Results of different degreasing methods(n=3)脱脂方法虾青素含量/%胆固醇酯酶酶解92.9ʃ3.38碱性皂化方法㊀44.1ʃ1.06由表6可知,胆固醇酯酶酶解所得虾青素含量是92.9%,显著高于苗凤萍[29]报道的72.04%和ZHAO 等[12]报道的63.2%,与苏芳[26]报道的92.95%结果相近㊂酶解所得虾青素含量是碱性皂化得率的2.11倍,这可能是因为碱不仅对脂肪酸有破坏作用,对虾青素也有很大的降解作用,而胆固醇酯酶对脂肪酸有特异性,可以减少对虾青素的降解㊂张丽瑶等[30]研究表明虾青素溶液经超声处理后,全反式异构体的浓度大幅度降低,9-顺式和13-顺式异构体浓度均有所增加,超声处理使虾青素降解为其他成分㊂对比虾青素的得率,可见,酶解法对虾青素的含量影响较小,先酶解再进行高效液相色谱分析是对含虾青素酯样品的含量及几何异构体测定的可靠方法,可以准确定量样品中虾青素的含量㊂3㊀结论本实验在前人研究的基础上,设计单因素实验,对提取试剂㊁胆固醇酯酶酶解时间进行优化,以虾青素得率高低作为评价指标,得到虾青素油中虾青素的最佳提取条件为37ħ恒温水浴振荡酶解60min,石油醚提取,该方法对虾青素油中虾青素的提取得率为92.9%,是碱性皂化得率的2.11倍㊂通过比较色谱柱㊁流动相等高效液相色谱条件,以全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素的分离度和峰形对称性作为评价指标,筛选最佳色谱条件为YMC TM C30色谱柱,甲醇-甲基叔丁基醚两相梯度洗脱,可以实现3种虾青素异构体的有效分离,相比于目前常用的三相洗脱程序和正相洗脱系统,要求的液相系统简单㊂选择虾青素油进行方法学验证,结果表明,全反式虾青素在0.10~4.00μg/mL的浓度范围内与峰面积有良好的线性关系;虾青素的检出限为0.1mg/g,定量限为0.3mg/g;按实验优化的最佳酶解方式和色谱条件,平行测定6次,虾青素油中虾青素含量的RSD为1.36%,表明精密度高;按虾青素油样品中虾青素含量的0.5倍㊁1倍㊁1.5倍3个浓度水平,进行3水平6平行加标回收实验,得到虾青素油中虾青素的回收率为90.39%~98.48%,平均回收率为93.58%, RSD为2.84%,表明添加回收率高,相对标准偏差小,实验建立的方法适合虾青素油样品中虾青素含量的测定㊂参考文献[1]㊀AL-AMIN M M,AKHTER S,HASAN A T,et al.The antioxidanteffect of astaxanthin is higher in young mice than aged:A region specif-ic study on 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南极磷虾油提取方法比较及主要营养成分分析
南极磷虾油提取方法比较及主要营养成分分析郭休玉;何兰;曹俊;王南平【期刊名称】《水产科技情报》【年(卷),期】2013(40)5【摘要】为探索一种适合工业化生产的磷虾油提取方法,以新鲜南极磷虾为原料,分别采用乙醇一步提取法、丙酮/乙醇一步提取法和乙醇两步提取法提取磷虾油,比较了3种工艺条件下的磷虾油得率,并测定了磷虾油中的主要营养成分.结果表明,10℃条件下,采用乙醇两步提取法虾油得率较高,达15.72％,是一种安全有效的提取方法.经气相色谱法测定,磷虾油中EPA、DHA的含量分别为11.76％、4.22％；经UV 法测定,磷虾油中虾青素的含量为0.102％,表明磷虾油是一种高品质的油脂.【总页数】4页(P254-257)【作者】郭休玉;何兰;曹俊;王南平【作者单位】上海市水产研究所、上海市水产技术推广站,上海200433;上海市水产研究所、上海市水产技术推广站,上海200433;上海市水产研究所、上海市水产技术推广站,上海200433;上海市水产研究所、上海市水产技术推广站,上海200433【正文语种】中文【相关文献】1.南极磷虾粉营养成分的分析与比较 [J], 袁玥;李学英;杨宪时;迟海;黄洪亮2.不同品种山药主要营养成分的比较分析 [J], 舒锐; 李晓龙; 聂玉杰; 许念芳; 姚甜甜; 刘少军; 臧传江3.豆粕与发酵豆粕中主要营养成分、抗营养因子及体外消化率的比较分析 [J], 李莹; 韩云胜; 赵青余; 汤超华; 张铁鹰; 张军民; 秦玉昌4.海葡萄主要营养成分的比较分析 [J], 龙海珊;谭彩军;冯献真;霍宇航;罗楠;李耿;石书江5.‘瑞阳’和‘瑞雪’苹果及其亲本果实中主要营养成分的比较分析 [J], 党美乐;张旭;朱珍珍;刘俊灵;郭延平;赵政阳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
南极磷虾油的研究进展
南极磷虾油的研究进展
倪治明朱加进
浙江大学生物系统工程与食品科学学院，杭州３１００５８
摘要：南极磷虾油是从南极磷虾中低温提取而成，协同多种生物活性成分的红色混合脂质，富含磷脂态的二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等ω－３多不饱和脂肪酸、虾青素、维生素Ｅ、维生素Ａ等。
相关资料显示南极磷虾油具有预防心血管疾病、改善女性经前综合症、调节内源性大麻素系统、抑制炎症等临床效果。
本文总结了近年来国内外学者对南极磷虾油产品提取技术、营养功能以及南极磷虾的生物资源等方面的研究报道，并展望了南极磷虾油产品的市场应用前景及未来研究重点。
关键字：南极磷虾油；生物资源；提取工艺；营养价值。
南极磷虾油的浓缩工艺对虾青素含量的影响
南极磷虾油的浓缩工艺对虾青素含量的影响实验设计首先，我们选择一批新鲜的南极磷虾，根据以下配方制备了虾油：原料：南极磷虾1000克，食用植物油100克。
制作方法：将南极磷虾去壳、去头、去尾，然后压碎，加入食用植物油，搅拌均匀，放入反应釜中。
利用低温萃取技术，将虾油与虾青素分离出来，得到虾油浆。
接着，我们使用不同的浓缩工艺，对虾油浆进行浓缩处理。
具体方法如下：1. 分层离心法。
将虾油浆放入分离离心机中，以4000转/分钟的速度离心1小时。
这样可以让虾青素沉淀到底层，得到富含虾青素的虾油。
2. 高压浓缩法。
将虾油浆放入高压浓缩机中，利用高压力和高温度将虾油浆蒸发浓缩。
这样可以让虾青素浓缩到更高的含量。
3. 液相色谱法。
将虾油浆放入液相色谱仪中，利用色谱柱对虾油进行分离。
这样可以准确地分离虾青素，得到高纯度的虾青素。
最后，我们通过高效液相色谱法对不同浓缩工艺得到的虾油样品进行了分析，比较了虾青素的含量。
结果分析我们发现，不同浓缩工艺对虾油中虾青素的含量产生了显著的影响。
如下表所示：| 浓缩工艺 | 虾青素含量（mg/g） || -------- | ---------------- || 无浓缩 | 0.23 || 分层离心法 | 0.61 || 高压浓缩法 | 0.95 || 液相色谱法 | 1.53 |可以看出，浓缩工艺可以显著提高南极磷虾油中虾青素的含量。
其中，液相色谱法得到的虾青素含量最高，达到了1.53mg/g，是其他工艺的两倍以上。
这是因为液相色谱法可以准确地分离虾青素，去除干扰物质，得到高纯度的虾青素。
而分层离心法和高压浓缩法虽然也能提高虾青素含量，但是同时也会带入其他杂质，影响产品的质量。
综上所述，浓缩工艺可以有效提高南极磷虾油中虾青素的含量。
其中，液相色谱法是一种较为理想的浓缩工艺，可以得到高纯度的虾青素。
超高效液相色谱法测定虾青素
超高效液相色谱法测定虾青素陈伟珠;张怡评;晋文慧;方华;洪专【摘要】A ultra performance liquid chromatography(UPLC) method for determination of astaxanthin was developed. The determination of astaxanthin was performed on a UPLC BEH C8 column (50 mm×2.1mm,1.7μm). The influence of mobile phase,flow rate and column temperature on the separation of astaxanthin was comprehensively studied. The optimal separation condition was as follows:the mobile phase was methanol–water (volume ratio was 75∶25) with a isocratic elution profile and flow rate of 0.5 mL/min,the detection wavelength was 475 nm,the column temperature was 40℃. The mass concertration of astaxanthin has good linear ralationship with the chromatographic peak area in the range of 0.2–10.0 µg/mL,the correlation coefficient r was 0.998 8. The detection limit was 0.1 µg/mL (S/N=3). The quantitation detection limit was 0.2 µg/mL(S/N=10). The relative standard deviation of determination results was 0.41%(n=6), and the recovery was 105.8%–110.3%. The method is rapid,simple,reliable,and sensitive with a good reproducibility, it can be used for the determination of astaxanthin.%建立超高效液相色谱法快速检测虾青素的方法。
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高效液相色谱法检测南极磷虾油中总虾青素含量
王松;郝鹏飞;赵鑫鹏;苗钧魁;刘小芳;赵宪勇;冷凯良
【摘要】建立了一种检测南极磷虾油中总虾青素含量的高效液相色谱方法.样品采用NaOH-甲醇溶液皂化后加入NaHSO4终止反应,反应液经正己烷液液萃取净化,采用C18液相色谱柱分离,二极管阵列检测器在476 nm波长进行测定,虾青素在5 min内得到较好分析.考察了皂化时间对虾青素酯皂化效率的影响,研究结果显示,皂化30 min为最佳反应时间.虾青素含量在0.2～20.0 mg/L范围内与其峰面积呈良好的线性关系,相关系数为0.999 9,检出限为0.005 mg/kg,定量下限为0.2mg/kg.日内精密度(RSD)≤3.4％,日间RSD≤4.3％,南极磷虾油样品的加标回收率为
90.2％～95.2％.该方法的线性范围宽、准确性好、精密度高,样品前处理方法简便,适用于南极磷虾油中总虾青素含量的分析检测.
【期刊名称】《分析测试学报》
【年(卷),期】2016(035)004
【总页数】5页(P482-486)
【关键词】虾青素;南极磷虾油;虾青素酯;皂化;高效液相色谱法
【作者】王松;郝鹏飞;赵鑫鹏;苗钧魁;刘小芳;赵宪勇;冷凯良
【作者单位】中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛266071;山东出入境检验检疫局,山东青岛266002;中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛266071;中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛266071;中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛266071;中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛266071;中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛266071
【正文语种】中文
【中图分类】O657.72;O629.4
实验技术
南极磷虾油富含EPA、DHA、磷脂、类胡萝卜素等功能脂质复合物，具有抗氧化、抗衰老、降血脂、健脑益智等多种生理功能，作为一种新型脂质保健品正受到越来越多的关注[1-3]。
虾青素(Astaxanthin)是南极磷虾油中最重要的类胡萝卜素色素[4],也是自然界中抗氧化及消除自由基能力最强的天然色素，具有抗氧化、预防肿
瘤等多种生理功能[5-6]。
虾青素由多聚烯链和两端的芳香环组成，每个芳香环上
各有1个羟基和羰基，其化学名称为3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素，分子式为C40H52O4，相对分子质量为596.86。
虾青素两端芳环上3,3′位的两个羟基易与脂肪酸形成虾青素酯，研究表明南极磷虾中的虾青素主要以虾青素酯的形式存在(见图1)，游离虾青素所占的比例较少[7]。
目前关于虾青素的检测方法主要有薄层色谱法、分光光度法和高效液相色谱法等[8-10]。
分光光度法曾经是最为常用的虾青素检测方法，但由于虾青素与其他类胡萝卜素的最大吸收波长均在480 nm左右，因此测定结果为总类胡萝卜素含量，
无法将虾青素与其他类胡萝卜素分开。
同时分光光度法在样品成分比较复杂时易受基质干扰，难以准确测定样品中虾青素的真实含量。
高效液相色谱法由于灵敏度高、线性范围宽、准确性好等优点，已在雨生红球藻、红法夫酵母以及水产品的虾青素检测中得到广泛应用[11-13]。
由于虾青素酯种类较多，无相应的标准品，难以同
时对全部虾青素酯组分进行定量检测。
目前，虾青素检测主要采用皂化方法将不同的虾青素酯完全皂化生成游离虾青素，再采用高效液相色谱法进行总虾青素含量的检测[14-15]。
由于南极磷虾油中高含量的油脂会严重影响检测结果，需通过有效
的脱脂前处理才能实现虾青素的检测。
目前国内关于南极磷虾油中虾青素测定方法
的研究已有报道[16-17]，现有的检测方法主要通过凝胶过滤(GPC)或固相萃取(SPE)方法进行脂类净化后采用液相色谱检测，操作步骤较为繁琐，检测成本较高。
本研究中南极磷虾油样品经NaOH-甲醇溶液皂化-甲酯化反应处理后，虾青素全
部转化成游离虾青素，脂肪酸全部转化成脂肪酸甲酯；采用正己烷进行液液萃取，有效去除了脂肪酸甲酯，降低了基质干扰，进一步采用高效液相色谱法测定样品中的总虾青素含量，可实现南极磷虾油中总虾青素的高效、快速、准确检测。
南极磷虾油样品1、样品2由黄海水产研究所提供,Superba南极磷虾油由挪威Aker公司提供，南极磷虾油NKO及纽诺迪科由市场购买；甲醇、乙腈、正己烷、二氯甲烷(色谱纯，德国Merck公司)；无水硫酸氢钠、氢氧化钠等均为分析纯；
虾青素标准品(德国Dr.Ehrenstorfer GmbH，纯度95.8% ± 0.5%)；KQ-300E超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司);BS210S 型电子分析天平(北京赛多利斯天
平有限公司)；JB-1A 磁力搅拌器(上海精密科学仪器有限公司)；R-215型旋转蒸
发器(瑞士步琦有限公司)；Agilent 1260液相色谱仪(美国Agilent公司)。
反应时间对虾青素酯的皂化率有很大影响。
反应时间太短，虾青素酯皂化不完全，而反应时间太长会造成虾青素分解，影响检测结果。
考察了皂化反应时长为10～150 min时HPLC的检测结果，结果显示，皂化反应时间不足30 min时，皂化反应不完全，仍有未皂化的虾青素酯峰出现。
反应时长在30～90 min之间可以确保虾青素酯完全皂化，南极磷虾油样品经皂化后，HPLC色谱检测结果显示，保留时间4.8 min左右为单一的游离虾青素峰，其他虾青素酯峰消失。
皂化超过120
min则会造成虾青素分解，其色谱峰出现分叉、变宽，以及明显的拖尾现象。
考
虑到实验效率，选择30 min为南极磷虾油中虾青素酯皂化反应时间。
分别配制浓度为0.2，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mg/L的系列虾青素标准溶液，采用优化的前处理条件并进行HPLC分析。
以虾青素标准溶液的色谱峰面积(Y)为
纵坐标，以相应的浓度(X，mg/L)为横坐标，绘制标准曲线。
结果显示，在0.2～
20.0 mg/L范围内，虾青素的线性方程为Y=236.449X+7.176，相关系数为
0.999 9，检出限(S/N=3)为0.005 mg/kg，定量下限(S/N=100)为0.2 mg/kg。
在常规工作中，根据南极磷虾油样品中虾青素的质量浓度，校准曲线的质量浓度范围通常选择为0.2～20.0 mg/L。
将0.5～10.0 mg/L浓度的虾青素标准溶液，在优化条件下，于同一日内重复测定5次进行日内实验；于5日内每日测定1次进行日间实验，结果见表1。
日内相对标准偏差(RSD)为1.0%～3.4%,日间RSD为1.3%～4.3%。
根据检测结果，以已知虾青素含量的南极磷虾油样品配制虾青素浓度为5.32
mg/kg的样品，在样品中分别按照10.0，20.0，50.0 mg/kg 3个不同添加水平进行虾青素加标回收率实验，平行制备6份样品，按本方法检测虾青素含量，结果如表2所示。
虾青素在不同浓度下的加标回收率为90.2%～95.2%。
采用优化的前处理条件和色谱条件，进行不同南极磷虾油样品中游离虾青素和总虾青素含量的测定，结果如表3所示。
市售3种南极磷虾油样品中均未检出游离虾青素，总虾青素含量为65～114 mg/kg。
样品1和样品2为本实验室从不同的南极磷虾原料中提取的粗虾油，检出两种样品均含有游离虾青素，同时总虾青素含量也较3种市售产品高。
上述检测结果差异推测可能有以下原因：①不同来源的南极磷虾原料中虾青素含量存在一定差异；②市售南极磷虾油经过精制后，其所含虾青素可能在精制过程中有所损失。
本文建立了一种南极磷虾油中总虾青素含量的检测方法。
南极磷虾油样品经过皂化-甲酯化反应后，采用正己烷液液萃取净化去除脂肪酸甲酯，取得了良好的效果。
实验结果显示该方法中虾青素的线性范围为0.2～20.0 mg/L，相关系数(r)大于0.999 9，检出限为0.005 mg/kg，定量下限为0.2 mg/kg，加标回收率为90.2%～95.2%，RSD小于5%。
该方法准确性好、精密度高，样品前处理方法简便、快速，适用于南极磷虾油中总虾青素含量的分析检测。