虾青素试验方法
天然虾青素分析方法的研究进展
天然虾青素分析方法的研究进展虾青素是一种特殊生理活性的物质，具有超强的抗氧化、抗衰老、抗癌、提高免疫力等作用。
近些年国内外在天然虾青素的分析方法上有了一定的进展，本文对薄层层析法、紫外光谱法，液相色谱法等分析方法进行了综述。
标签：虾青素；薄层分析；比光谱导数法；光镊拉曼光谱法；高效液相色谱法1前言虾青素是一种端基为酮基的类胡萝卜素色素，化学名称为3，3’-二羟基-4，4’-二酮基-β，β’-胡萝卜素，分子式为C40H52O4，又名虾黄素，虾黄质，龙虾壳色素，是一种非维生素A源类胡萝卜素。
虾青素不仅具有很强的抗氧化性、抗肿瘤及增强免疫的生理功能，而且拥有艳丽的红色及极强的色素沉积能力，国外已成功用于高档水产养殖[1]。
基于虾青素特殊的结构，分别在两端的环结构上存在手性中心，每个手性中心有两种构象，因此存在三种立体异构体，分别是左旋、右旋和消旋体[2]。
虾青素色泽为粉红色，具脂溶性，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮、苯和二硫化碳等有机溶剂[3]。
动物实验表明，虾青素可以清除二氧化氮、硫化物、二硫化物，也可降低脂质过氧化作用，有效的抑制自由基引发的脂质过氧化。
另外，虾青素还具有很强的抑制肿瘤发生、增强免疫功能等生理作用[4]。
因而在食品添加剂、水产养殖、化妆品、保健品和医药工业方面有广阔的应用前景。
目前虾青素的主要来源是从水产品废弃物中提取、利用藻类和酵母生产[5]，因此研究快速、简便、准确的虾青素含量测定方法是十分必要的。
本文论述了薄层层析法、比光谱导数法、分光光度法、光镊拉曼光谱法、高效液相色谱法五种检测方法。
2虾青素的分析方法2.1薄层层析法薄层层析以其简单、廉价、快速、适用范围广的优点而成为天然藥物提取、分离过程中常用的检测、分析手段。
样品溶液用毛细管点在薄层板的一端，置密闭槽中，加入适宜溶剂为流动相。
由于毛细管原理，溶剂被吸上，沿板移动，并带动样品中各组分向前移动，这个过程称为展开。
由于各组分性质不同，移动距离不同，展开一定距离后，即得互相分离的组分斑点。
虾青素分析测定方法的研究
虾青素分析测定方法的研究【摘要】选择分光光度法及高效液相色谱法对测定虾青素的分析条件进行研究，从而得出最佳的测定条件。
用分光光度法和高效液相色谱法测定虾青素，标准曲线的回归方程的r2都超过了0.99。
用分光光度法测定虾青素，回收率范围为99.3-101%，相对标准偏差rsd值为0.78-1.3%；用液相色谱法测定虾青素，回收率范围为100-102% ，相对标准偏差rsd为0.62-1.4%。
这些值都在定量分析所要求的阈值范围内，可以用于定量分析。
【关键词】分光光度法；高效液相色谱法；虾青素abstract： choice two based on the spectrophotometry and high performance liquid chromatography (hplc) were developed for determination the astaxanthin. and the optimum conditions was investigated in detail. the total amount of astaxanthin was measured by spectrophotometry, the recoveries were in the range of 99.3-101%, and rsd were in the range of 0.78 %-1.3 %. also the astaxanthin was determined by hplc, and the recoveries were in the range of 100% -102%, rsd were in the range of 0.62%-1.4%. all these values were within the range of permissive threshold value on quantitative analysis, which showed that it’s feasible for measuring the content of astaxanthin by these two methods.key words: spectrophotometry；hplc；astaxanthin从动植物及菌类中提取虾青素目前还处于实验研究的基础阶段，要实现产业化生产虾青素，还必须对其提取工艺进行广泛深入的研究。
虾青素化学分析方法
虾青素化学分析方法富士化学测试方法：虾青素含量的高效液相色谱分析包括两个重要步骤：海藻粉中的虾青素的提取及之后的脱脂过程。
这两个过程都会影响色谱分析结果，而分光光度计法则只要求虾青素的提取过程完全彻底即可。
因为微藻体内的虾青素在化学结构上有两个羟基（3和3’位置上），因此其往往与脂肪酸结合形成酯类，故虾青素存在形式主要有三种：二酯、单酯和自由体，不同藻系三种形式的含量不同，一般二酯成分最高70-80%左右，单酯10%左右，而自由体仅占5%左右。
相比较二酯和单酯形式自由体的极性更强。
采用分光光度法测定了类胡萝卜素在474nm波长处的吸光度，并计算了类胡萝卜素的含量量中包含其他一些类胡萝卜素成分，如β-类胡萝卜素、角黄素和叶黄素等，因此不甚准确；而在hplc分析中，很难对酯化虾青素成分进行精确定量，因此常常采用酶水解的方法将二酯和单酯结构的虾青素水解为自由体，然后进行色谱分析。
一般化学脱脂反应如皂化反应不能用于虾青素脱脂，因为皂化反应条件易造成虾青素的氧化和降解，使得测量结果偏低。
在hplc分析中，若酶水解不完全，在色谱图中11min左右的反式结构的虾青素色谱峰会相对较小，且在保留时间约20-30min处会看到大量酯化成分的色谱峰，可作为判断样品是否完全水解的依据。
试剂和设备：试剂：0.05 mtris HCl缓冲液（pH7.0）；胆固醇酯酶；反式-bata-apo-8'-胡萝卜素虾青素；1%（v/v）磷酸；丙酮；正己烷，石油醚，甲醇；甲基异丁基谜；十水硫酸钠；无水硫酸钠。
设备：10ml离心管；30ml、100ml、200ml、500ml容量瓶；0.45微米注射器过滤器；水浴锅；分析天平；离心机；超声波破碎仪；分光光度计；hplc；色谱柱。
（具体试剂及设备型号见文献）实验步骤：2.0水解酶的配置：准确称量一定量的胆固醇酯酶，并将其溶解在50mmtris HCl（pH7.0）中，使最终酯酶浓度为4单位/毫升。
标准 虾青素 测定
虾青素的测定主要有分光光度法和高效液相色谱法两种方法。
分光光度法：这种方法主要是利用虾青素的最高吸收峰为478，因此在波长为478下进行比色即可测定虾青素的含量。
由于该种方法比较简单，可能存在的误差也较大，所以高效液相色谱法是检测虾青素的主流方法。
高效液相色谱法：这是一种分离效果好、灵敏度高、检测速度快的方法，是最为常见的虾青素检测方式。
例如，GB/T 31520-2015就规定了用液相色谱法检测红球藻中虾青素。
请注意，虾青素的测定方法具有一定的复杂性，需要专业的技术人员进行操作。
虾青素试验方法
虾青素试验方法警告----本产品对光敏感，在操作过程中应避光操作。
三氯化锑-三氯甲烷溶液有强腐蚀性，在操作过程中应注意避免与皮肤接触，如不慎接触到皮肤，应立即用清水冲洗。
本标准所用的试剂和水，除非另有说明，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。
4.1 试剂和溶液4.1.1 三氯甲烷。
4.1.2 无水乙醇。
4.1.3 BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚）。
4.1.4 三氯化锑-三氯甲烷溶液：称取1g三氯化锑用4ml三氯甲烷溶解即得（现配现用）。
4.2 仪器和设备4.2.1 紫外-可见分光光度计。
4.2.2 分析天平。
4.2.3 超声波清洗器。
4.2.4 恒温水浴装置。
4.2.5 离心机（离心试管体积大于20ml）。
4.2.6 氮气吹干装置。
4.2.7 孔径为0.84mm的分析筛。
4.2.8 孔径为0.425mm的分析筛。
4.3 鉴别4.3.1 取试样约10mg于试管中，加50℃-60℃热水1ml，于50℃-60℃热水浴中超声5min。
冷至室温后，加入三氯甲烷（4.1.1）10ml并振摇30s，静置分层后，取三氯甲烷层溶液3ml与三氯化锑-三氯甲烷溶液（4.1.4）1ml反应，溶液应立即显蓝紫色。
4.3.2 取含量测定项（4.4.1）下的待测液，以三氯甲烷为空白，使用1cm的比色皿，于分光光度计上扫描波长200nm-600nm之间的吸收光谱，其最大吸收波长应在波长 484nm-490nm之间，光谱图参见附录A。
4.4 含量4.4.1 测定待测液：称取试样0.15g（精确至0.0002g），置于250ml棕色容量瓶中，加入BHT（4.1.3）约10mg，加入蒸馏水10ml，在50℃-60℃热水浴中超声5min，流水冷却至室温，加入无水乙醇（4.1.2）100ml和三氯甲烷100ml，于室温水浴中超声5min，用三氯甲烷稀释至刻度摇匀。
取该溶液适量，置于具塞离心管中离心5min（转速为3000r/min），精密称取上层清液2ml于50ml棕色容量瓶中，将容量瓶置于约45℃的水浴中，用氮气流吹干，用三氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，即为待测液，应立即测定（于20min内完成测定）。
虾壳中虾青素的提取实验报告
虾青素（Astaxanthin），即3,3’-二羟基-4,4’-二酮基-β,β’-胡萝卜素，分子式为C40H52O4，相对分子质量为596，其结构式如下(其中R= CH3)。
呈鲜红色，在水生动物、鸟类羽毛及植物叶、花、果中广泛存在，具有极强的抗氧化、抗癌变、增强免疫作用的功能。
一虾青素的生理功能虾青素可淬灭单线态氧，清除自由基，阻止脂质过氧化，保护机体免受伤害, 预防癌症发生，还能促进人体免疫球蛋白的产生，具有更高的免疫调节活性。
研究表明，虾青素具有抗氧化活性的类胡萝卜素,虾青素的抗氧化性比β-胡萝卜素高约10倍，比维生素E高约500倍。
虾青素已被认为是“超级维生素E”。
体外细胞培养试验研究虾青素对鼠免疫活性细胞的繁殖及功能的影响，结果显示虾青素比裸藻酮和β-胡萝卜素具有更高的免疫调节活性。
最新研究表明，虾青素具有比β-胡萝卜素更强的抑制癌变的能力。
二虾青素的商业开发由于动物本身不能够合成虾青素，而且绝大部分动物也不能把其他类胡萝卜素转化成虾青素，因此必须从食物中摄取虾青素。
目前虾青素已经在美国被批准为食品添加剂，并且在三文鱼的养殖中得到了很好的应用。
现在市场上虾青素的售价很高，单价达2000-2500美元每公斤（虾青素含量3%），而虾青素软胶囊每瓶140元，每瓶虾青素总量为360mg。
在2000年，虾青素的市场容量估计就已经达到了每年2亿美元。
因此进一步研究虾青素对人体的作用，开发相关的保健品和保健化妆品，则可以扩大天然虾青素的应用范围和市场。
三虾青素的来源虾青素主要有两种生产方式，即化学合成和天然提取。
一）化学合成虾青素化学合成法要经过多步化学和生物催化反应才能完成，其化学合成的前体物质为（S-3-乙酸基-4-氧代-β-紫罗酮，它是不同的微生物对（R）萜烯醇醋酸盐不对称水解，经过萃取，反流分布及重结晶等技术处理而得到产物。
人工合成的虾青素大多为顺式结构，而生物体合成的虾青素大多为反式结构。
动物体对人工合成的虾青素吸收能力较弱，而且人工合成的虾青素的着色能力和生物效价远比天然虾青素低。
虾青素检测方法
虾青素检测方法虾青素分析方法1.仪器：Agilent 1100 旋转蒸发器超声波2.试剂：无水乙醇三氯甲烷正己烷（HPLC）丙酮（HPLC）3.检测方法：色谱柱：ZORBAX RX-SIL 4.6×250mm,5um流动相：正己烷：丙酮=86：14柱温：25℃检测波长：470nm（VWD）流速：1.2ml/min进样体积：20ul4.溶液配制供试品溶液：精密称取虾青素（微粒）样品100mg，置于250ml容量瓶中，加5ml水，50℃水温超声10min，使样品完全溶解。
冷却到室温，加100ml无水乙醇，用三氯甲烷定容。
取一定量的溶液离心，转速2500/min，5min。
移取上清液5ml于蒸馏烧瓶中，50℃旋转蒸发，残渣用4ml三氯甲烷溶解，移入50ml容量瓶中，并用正己烷定容。
此溶液为供试品溶液。
标准品溶液：精密称取虾青素对照品10.0mg，置于100ml容量瓶中，加10ml 三氯甲烷，冷水超声溶解，加正己烷稀释至刻度，摇匀。
移取此溶液5ml于50ml容量瓶中，加4ml三氯甲烷，用正己烷稀释至刻度，摇匀，此溶液为标准品溶液。
5.计算虾青素含量＝样品峰面积×标准品质量×250×10×标准品含量×100％÷标准品峰面积÷样品质量÷100÷1010%虾青素干粉的紫外检测方法1.样品液配制取待测样品100毫克干粉至250毫升棕色容量瓶中，加5毫升去离子水，在50摄氏度条件下超声溶解5min，冷却后，加100毫升无水乙醇摇匀，再用氯仿定容，过滤。
取5毫升上述溶液至50毫升容量瓶中，再用氯仿定容至刻度。
2.虾青素空白溶液用氯仿做空白。
在474nm处测最大吸收值。
3.结果计算C=A*2500/（1830*W）A为吸光系数W为样品重量虾青素晶体、油悬检测方法1.样品液配制取待测样品20毫克晶体（或油悬液60毫克）至100毫升棕色容量瓶中，加入10毫升氯仿溶解，加正己烷定容，摇匀，取1毫升上述溶液至100毫升容量瓶中，再用正己烷定容至刻度。
一种全反式虾青素含量测定方法
一种全反式虾青素含量测定方法
一种全反式虾青素含量测定方法是利用高效液相色谱-质谱（HPLC-MS/MS）技术进行测定的方法。
1. 检测前样品准备
首先，需要将新鲜的虾青素样品在离心管中进行离心，保留上清液。
将上清液转移至经过滤的2ml微离心管中，加入甲醇进行稀释。
然后进行涡旋混合，再进行离心，将上清液转移到色谱小瓶中，进行
进一步的测定。
2. 仪器设置
采用HPLC-MS/MS系统进行虾青素含量的测定，HPLC参数为：色
谱柱为Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱（2.1mm×50mm，
1.8μm），流动相为乙腈和0.1%乙酸水溶液（V/V=8∶92），流速为
0.4 mL/min，柱温为40℃；MS/MS参数为：电喷雾离子化（ESI）正离
子模式，离子传输电压为1500 V，锥形电势为20 V，源温度为400℃，电离二次质量过滤器轻/重离子转换时间为50/950 ps，扫描模式为多
反应监测（MRM）模式。
3. 测定
将样品注射进入HPLC-MS/MS系统，进行检测和分析。
根据HPLC-MS/MS数据处理软件的分析结果得到各样品中虾青素的含量，并进行结果分析。
4. 结果分析
通过该全反式虾青素含量测定方法，可以得到准确、可靠的含量值。
同时，该方法还能检测出一些与虾青素相关的化合物，为后续药
物研究提供了更多的信息。
综上所述，该全反式虾青素含量测定方法具有测定精度高、灵敏
度高、可重复性好、同时还具备检测一些与虾青素相关的化合物的优点，可为虾青素的研究开发提供更多的技术支持。
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虾青素试验方法
警告----本产品对光敏感，在操作过程中应避光操作。
三氯化锑-三氯甲烷溶液有强腐蚀性，在操作过程中应注意避免与皮肤接触，如不慎接触到皮肤，应立即用清水冲洗。
本标准所用的试剂和水，除非另有说明，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。
4.1 试剂和溶液
4.1.1 三氯甲烷。
4.1.2 无水乙醇。
4.1.3 BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚）。
4.1.4 三氯化锑-三氯甲烷溶液：称取1g三氯化锑用4ml三氯甲烷溶解即得（现配现用）。
4.2 仪器和设备
4.2.1 紫外-可见分光光度计。
4.2.2 分析天平。
4.2.3 超声波清洗器。
4.2.4 恒温水浴装置。
4.2.5 离心机（离心试管体积大于20ml）。
4.2.6 氮气吹干装置。
4.2.7 孔径为0.84mm的分析筛。
4.2.8 孔径为0.425mm的分析筛。
4.3 鉴别
4.3.1 取试样约10mg于试管中，加50℃-60℃热水1ml，于50℃-60℃热水浴中超声5min。
冷至室温后，加入三氯甲烷（4.1.1）10ml并振摇30s，静置分层后，取三氯甲烷层溶液3ml与三氯化锑-三氯甲烷溶液（4.1.4）1ml反应，溶液应立即显蓝紫色。
4.3.2 取含量测定项（4.4.1）下的待测液，以三氯甲烷为空白，使用1cm的比色皿，于分光光度计上扫描波长200nm-600nm之间的吸收光谱，其最大吸收波长应在波长 484nm-490nm之间，光谱图参见附录A。
4.4 含量
4.4.1 测定
待测液：称取试样0.15g（精确至0.0002g），置于250ml棕色容量瓶中，加入BHT（4.1.3）约10mg，加入蒸馏水10ml，在50℃-60℃热水浴中超声5min，流水冷却至室温，加入无水乙醇（4.1.2）100ml和三氯甲烷100ml，于室温水浴中超声5min，用三氯甲烷稀释至刻度摇匀。
取该溶液适量，置于具塞离心管中离心5min（转速为3000r/min），精密称取上层清液2ml于50ml棕色容量瓶中，将容量瓶置于约45℃的水浴中，用氮气流吹干，用三氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，即为待测液，应立即测定（于20min内完成测定）。
以三氯甲烷为空白，使用1cm的比色皿，在分光光度计上测定待测液在487nm 附近最大吸收波长处的吸光度。
4.4.2 计算
试样中虾青素的含量X
以质量分数（%）表示，按式（1）计算：
1
×6250
A
max
X
=────── (1)
1
m
×1830
1
式中：
A
─待测液在487nm附近最大吸收处的吸光度；
max
6250─试样稀释的总体积，单位为毫升（ml）；
─称取试样的质量，单位为克（g）；
m
1
1830─试样中虾青素的标准百分消光系数（E1%
）；
1cm
4.4.3 允许差
取两次测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果相对偏差应不大于3%。
4.5 粒度
4.5.1 试验
称取试样50g，倾入分析筛中，振摇5min，取筛下物称量。
4.5.2 计算和结果的表示
以筛下物占试样的质量分数（%）表示，按式（2）计算：
粒度X
2
M
2
X
=────×100 (2)
2
M
3
式中：
─筛下物的试样质量，单位为克（g）；
M
2
─称取试样的质量，单位为克（g）。
M
1
4.6干燥失重
干燥失重按GB/T 6435规定的方法测定。
4.7重金属
按GB/T 5009.74规定的方法测定。
4.8 总砷
按GB/T 13079规定的方法测定。