虾青素化学分析方法

虾青素化学分析方法
富士化学测试方法：
前言：高效液相色谱法（HPLC）分析虾青素含量包括两个重要步骤：藻粉中虾
青素的提取及之后的脱脂过程。

这两个过程都会影响色谱分析结果，而分光光度计法
则只要求虾青素的提取过程完全彻底即可。

因为微藻体内的虾青素在化学结构上有两个羟
基（3和3’位置上），因此其往往与脂肪酸结合形成酯类，故虾青素存在形式主要有三种：二酯、单酯和自由体，不同藻系三种形式的含量不同，一般二酯成分最高70-80%左右，单酯10%左右，而自由体仅占5%左右。

相比较二酯和单酯形式自由体的极性更强。

分光光度法测定的是474nm波长下类胡萝卜素的吸光度，以此计算出的含
量中包含其他一些类胡萝卜素成分，如β-类胡萝卜素、角黄素和叶黄素等，因此不
甚准确；而在HPLC 分析中，很难对酯化虾青素成分进行精确定量，因此常常采用酶水解
的方法将二酯和单酯结构的虾青素水解为自由体，然后进行色谱分析。

一般化学脱脂反应
如皂化反应不能用于虾青素脱脂，因为皂化反应条件易造成虾青素的氧化和降解，使得测
量结果偏低。

在HPLC分析中，若酶水解不完全，在色谱图中11min左右的反式结构的虾
青素色谱峰会相对较小，且在保留时间约20-30min处会看到大量酯化成分的色谱峰，可
作为判断样品是否完全水解的依据。

试剂及设备：试剂：0.05M Tris-HCl缓冲液（PH 7.0）；胆固醇酯酶；Trans-bata-apo-8’-carotenal；
虾青素；1%（v/v）磷酸；丙酮；正己烷，石油醚，甲醇；甲基异丁基谜；十水硫酸钠；无水硫酸钠。

设备：10ml 离心管；30ml、100 ml 、200 ml、500ml容量瓶；0.45um 针筒过滤
器；水浴锅；分析天平；离心机；超声波破碎仪；分光光度计；HPLC；色谱柱。

（具
体试剂及设备型号见文献）
实验步骤：
2.0 水解酶的配置：
准确称取一定量的胆固醇酯酶溶解于50mM Tris-HCL(PH 7.0) 中，使最终酯酶浓度为
4单位/ml. (现配现用，不能冷冻保存)。

3.0 内标液配置：
准确称取7.5mg 类胡萝卜素醛，丙酮定容至200ml。

（I.S.solution,内标液）
4.0 标准液配置：
A, 称取5mg虾青素（SIGMA公司）至200ml容量瓶，加入100ml 丙酮超声波溶解
1min 后冷却至室温，15min 后定容至200ml。

(标准储备液)
B, 移取3.0ml 储备液至30ml 容量瓶，丙酮定容，混匀。

（标准液A）
C, 移取 3.0ml 储备液和10.0ml内标液至30ml容量瓶，丙酮定容混匀。

（标准液B）
5.0 分析准备：
A, 取50mg 样品（Astareal P2AF）到10ml 离心管内，加入1ml 纯水，充分震
荡使藻粉完全分散，必要情况下可使用超声波打散藻块。

B, 加10ml 丙酮到离心管内，40-50℃温度范围内超声波粉碎5min. C, 3000rpm 离
心5min, 将上清液转移到500ml 容量瓶。

D, 重复B、C 两步直至上清液变为无色，残留物变为土黄色为止。

（大约需3-4次）（充分提取非常重要）
E, 将上清液室温下静止15min ,丙酮定容，混匀。

（分析液A）
F, 取 3.0 ml 分析液A到10ml 的玻璃离心管内，加入1.0 ml内标液，混匀后加入3.0ml 酯酶溶液，轻轻倒置混匀。

G, 干浴器到37℃后将离心管放入，反应45min, 每10min 轻轻倒置混匀，反应过程
中至少倒置混匀2次。

H, 反应结束后加入1g 十水硫酸钠和 2ml石油醚，震荡30秒混匀，3000rpm离心
3min.
I, 将上层石油醚转移到含有1g无水硫酸钠的玻璃离心管内。

室温下惰性气体吹干石
油醚，加入3ml丙酮，超声波溶解过滤。

（分析液B）
6.0 总类胡萝卜素含量的分光光度法分析
A, 丙酮为试剂对照，测分析液A在474nm下的吸光度AAa. 计算公式如下：
Car (% w/w)=AAa*500/210/ W*100 （ w为样品中，mg.）
7.0 反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析虾青素含量 A, 测定标准液A在474nm下的
吸光度ASa。

（理论上5mg标准虾青素溶解在2000ml丙酮中其吸光度是0.525）
B，HPLC分析标准液B和分析液B的色谱图。

（HPLC条件和各成分保留时间见文献）
C, 标准液A中虾青素含量计算：CSa= Car (mg/ml) = ASa /210 D, 分析液B和标准液B相对内标的色谱峰系数：分析液B : RAb =(1.3P13-cis+Ptrans+1.1P9-cis) / PI.S.
标准液B : RSb =(1.3P13-cis+Ptrans+1.1P9-cis) / PI.S. （Pi 为组分i的色谱峰面积）
E, 样品中虾青素含量：ASTA (% w/w) = CSa (RAb /RSb) *500/W*100感谢您的阅读，祝您生活愉快。