杂交瘤细胞制备
单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理
单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞(用选择培养基）,第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞.第一次筛选的原理和方法：细胞融合后,杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。
普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。
其一居室细胞中的DNA合成油两条途径：一条途径是生物合成途径(“D途径”)，即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。
再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。
另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。
因此，在HAT培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断,随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。
对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞,因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡.只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性,因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖.第二次筛选的原理和方法：在单克隆抗体的生产过程中,由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，是每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体，上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。
杂交瘤细胞培养方法
杂交瘤细胞培养方法
杂交瘤细胞培养方法：
1. 杂交瘤的制备：
将骨髓瘤细胞与抗原刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞。
2. 细胞培养：
将杂交瘤细胞接种于含有高浓度鸟嘌呤或潘孔霉素的无血清培养基中进行培养。
3. 无血清培养基的制备：
取无血清培养基中所需的基础培养液（例如：DMEM、RPMI 1640等），添加必要的生长因子、维生素、矿物质和氨基酸等，经过过滤和灭菌处理即可。
4. 细胞培养条件：
培养杂交瘤细胞时，需保持其在适宜的温度、CO2浓度和湿度下生长，通常在37℃、5% CO2气氛下进行培养。
5. 细胞检测：
在培养过程中，需定期检测细胞形态、增殖情况、表达抗原的能力等，以确保细胞的纯度和功能性。
注意事项：
为避免污染和交叉感染，需采取有效的无菌技术和严格的操作规范；同时，在培养过程中应注意细胞的生长情况和营养状况，及时调整培养条件以保证细胞的最佳生长状态。
杂交瘤技术的实验原理
融合方法
通过物理或化学方法诱导 细胞融合，如电融合、聚 乙二醇等。
融合率
确保高融合率，以获得足 够数量的杂交瘤细胞。
抗体生成原理
通过筛选获得高亲和力的 特异性抗体。
产生的抗体可以是IgG、 IgM等不同类别。
杂交瘤细胞在适宜的条件 下产生特异性抗体。
抗体产生
抗体亲和力 抗体类别
抗体筛选原理
筛选方法
生物标志物发现
利用杂交瘤技术可以发现新的生物标志物，有助于深入了解生物学过程和疾病 发病机制。
THANK YOU
05
杂交瘤技术的应用前景与展望
杂交瘤技术在疾病诊断和治疗中的应用
肿瘤标志物检测
利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体可以用于肿瘤标志物的检测，有助于肿瘤的早期发现和诊断。
免疫治疗
杂交瘤技术制备的单克隆抗体可以用于肿瘤的免疫治疗，通过与免疫细胞结合，激活免疫系统对肿瘤细胞的攻击。
杂交瘤技术在疫苗研发中的应用
1980年代
1990年代至今
随着基因工程技术的发展，出现了多 种改进的杂交瘤技术，如基因敲除、 转基因动物模型等，进一步拓展了杂 交瘤技术的应用范围。
杂交瘤技术开始应用于临床诊断和生 物治疗领域，成为单克隆抗体产业化 的基础。
02
杂交瘤技术的实验原理
细胞融合原理
01
02
03
细胞融合
将免疫细胞与肿瘤细胞融 合，形成杂交瘤细胞。
杂交瘤技术的实验原理
目 录
• 杂交瘤技术概述 • 杂交瘤技术的实验原理 • 杂交瘤技术的实验步骤 • 杂交瘤技术的优缺点 • 杂交瘤技术的应用前景与展望
01
杂交瘤技术概述
定义与特点
定义
杂交瘤技术是一种将免疫系统的B细 胞和骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细 胞的技术。
杂交瘤细胞制备流程
杂交瘤细胞制备流程
杂交瘤细胞制备流程简述如下：
1. 免疫动物：首先将特定抗原注射到小鼠体内，激活其免疫系统产生特异性抗体的B淋巴细胞。
2. 细胞融合：从小鼠脾脏中分离出已免疫过的B淋巴细胞，与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞在特定条件下（如聚乙二醇诱导）进行融合。
3. 选择培养：将融合后的细胞接种于选择培养基上，如HAT培养基，该培养基可使非融合细胞和自身融合的骨髓瘤细胞死亡，仅允许杂交瘤细胞存活及增殖。
4. 单克隆筛选：通过有限稀释法或克隆环等方法进一步筛选单个杂交瘤细胞克隆，确保每个克隆来源单一，能稳定分泌目标抗体。
5. 抗体检测与鉴定：对获得的单克隆杂交瘤细胞株进行抗体特性分析，确认其分泌的抗体具有所需特异性和亲和力。
6. 扩增保存：成功筛选出的杂交瘤细胞株进行大量扩增，并长期冷冻保存以供后续研究和生产使用。
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理一、引言单克隆抗体（Monoclonal Antibody，mAb）是由单一B细胞克隆产生的抗体，具有高度特异性和亲和力。
其制备方法主要有杂交瘤技术、酶联免疫吸附试验法（ELISA）、荧光激发技术等。
其中，杂交瘤技术是制备单克隆抗体最重要的方法之一。
二、杂交瘤技术基本原理1. B细胞与肿瘤细胞的融合杂交瘤技术的基本原理是将体内产生的特异性抗体B细胞与无限增殖能力的肿瘤细胞进行融合，形成可分泌大量同种特异性抗体的杂交瘤细胞。
在此过程中，B细胞提供了高度特异性的抗体基因组，而肿瘤细胞提供了无限增殖能力。
2. 杂交瘤细胞筛选和分离将获得的杂交瘤细胞进行筛选和分离，以获取单一同种特异性抗体产生的杂交瘤细胞株。
这里需要注意的是，筛选和分离的条件需要严格控制，以确保所得到的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力。
3. 单克隆抗体的大规模制备通过对单克隆抗体杂交瘤细胞株进行培养和扩增，可以大规模制备单克隆抗体。
此过程中需要注意对培养条件、生长因子、营养物质等进行优化，以提高单克隆抗体的产量和质量。
三、杂交瘤技术的优点1. 高度特异性和亲和力通过杂交瘤技术制备的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，可以用于检测、诊断、治疗等领域。
2. 无限复制能力杂交瘤细胞具有无限复制能力，可以大规模制备同种特异性抗体。
3. 可重复性好由于单一B细胞产生的同种特异性抗体都是完全相同的，因此通过杂交瘤技术制备出来的单克隆抗体具有良好的可重复性。
四、杂交瘤技术存在的问题及解决方法1. 杂交瘤细胞的稳定性杂交瘤细胞的稳定性对于单克隆抗体的制备至关重要。
为了提高杂交瘤细胞的稳定性，可以采用多种方法，如对培养条件进行优化、添加生长因子等。
2. 克隆选择在杂交瘤技术中，克隆选择是一个非常重要的环节。
为了确保所得到的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，需要对杂交瘤细胞进行筛选和分离。
这里需要注意的是，筛选和分离的条件需要严格控制。
医学检验技术：杂交瘤技术的基本原理
医学检验技术：杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术是事业单位考试免疫学检验的一个重要的部分，大家对于杂交瘤技术比较熟悉可能还是因为在高中的生物大家就有接触过这一部分，学起来也不那么吃力了。
杂交瘤技术的原理是使免疫的小鼠脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，成为杂交瘤细胞，最终获得既能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。
将这种杂交瘤细胞扩大培养,接种于小鼠腹腔,在小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。
技术本身包括两种亲本细胞的选择与制备，细胞融合，杂交瘤细胞的筛选与克隆化。
(一)小鼠骨髓瘤细胞
细胞株稳定，易于传代培养
细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子
该细胞是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶(HGPRT)的缺陷株
(二)免疫脾细胞
免疫用抗原尽量提高其纯度和活性，免疫途径多用腹腔内或皮内多点注射法
如为珍贵微量抗原，可用脾脏内直接注射法进行免疫
(三)细胞融合
PEG(聚乙二醇)可能导致细胞膜上脂类物质的物理结构重排，使细胞膜容易打开而有助于细胞融合。
(四)杂交瘤细胞的选择性培养
HAT培养液，是在基础细胞培养液内添加次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷
1.脾细胞(指B细胞)在一般培养基中不能生长繁殖
2.骨髓瘤细胞
因缺乏HGPRT而合成DNA，骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能增殖而死亡
3.杂交瘤细胞
由骨髓瘤细胞和脾细胞融合形成的杂交瘤细胞
由于与脾细胞融合，可获得其HGPRT，可以合成DNA。
因此，杂交瘤细胞在选择性培养得以生存而被筛选出来。
杂交瘤技术制备单克隆抗体PPT医学课件
HAT选择作用：
淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要 途径被A阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT和TK 缺乏，DNA合成的替代途径受阻 融合细胞：具有亲代双方的遗传性能，具有来自于淋 巴细胞的HGPRT和TK，可采用补救途径合成DNA， 因此可在HAT培养基上存活和繁殖。
免疫脾细胞
处于免疫状态脾脏中的B淋 巴母细胞或浆母细胞
动 物：
6～12周龄 20g～25g体重
2、骨髓瘤缺陷细胞株的培养和选择
对骨髓瘤细胞的要求：
（1）与免疫动物属同一品系（融合效率高、便于接种杂交瘤细胞在同一品 系小鼠腹腔中产生大量的单克隆抗体。） （2）选择HGPRT—株（次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型)或TK（胸 腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤细胞（细胞系在核酸类似物存在时会产生 HGPRT缺乏的突变株，该突变株不能在HAT培养基上生长。） (3)在细胞融合前两周复苏骨髓瘤细胞，保证骨髓瘤细胞处于对数 生长期。
骨髓瘤细胞的培养
1、采用一般的动物细胞培养液，小牛血清的浓度一般 在10%~20%，细胞的最大密度不得超过106cells/mL。
2、骨髓瘤细胞可以悬浮或半贴壁形一 般扩大培养以1:10稀释传代。）
HAT选择培养基的原理
HAT培养基：
H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要 途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替 代途径合成DNA
杂交瘤细胞的选择性培养
细胞DNA合成途经：
1.正常途径： 糖、氨基酸 核苷酸 DNA(可被A-氨基蝶呤阻断) 2、补救途径： 核苷酸前体 核苷酸 DNA （需要次黄嘌呤鸟嘌呤
杂交瘤细胞系的产生与筛选方法
杂交瘤细胞系的产生与筛选方法杂交瘤细胞是由两种不同细胞融合而成的细胞，具有两种不同细胞的特性。
它们能够生长并稳定传递某些嵌合基因，这使得研究人员可以得到一种长期稳定的细胞系，可以用于制备蛋白质、激素和抗体等生物制品。
以下是杂交瘤细胞系的产生和筛选方法。
1.细胞融合法。
该方法的原理是将两种细胞（通常是淋巴细胞和骨髓瘤细胞）使用聚乙二醇等化合物进行细胞融合，使得它们的核融合在一起，形成杂交瘤细胞。
这种方法需要较高的实验技术，且细胞融合成功的概率较低。
2.电穿孔法。
该方法通常使用高强度电脉冲将两种不同细胞膜穿透，并使它们互相融合。
这种方法比细胞融合法更加快速和高效。
3.病毒介导法。
该方法是使用病毒表面的融合蛋白合并两种细胞膜，使得它们融合在一起。
这种方法具有较高的效率和特异性，但需要选择合适的病毒。
1.限制性稀释法。
该方法是将杂交瘤细胞与未融合的母细胞混合后进行限制性稀释，使得每个混合物包含较少数量的杂交瘤细胞，并在培养液中筛选出杂交瘤细胞。
2.间接酶标记法。
该方法通过将嵌合基因的表达转移至细胞表面上的酶分子，使得可以通过底物反应检测到嵌合基因的表达水平。
对于酶标记法的反应物不会通过细胞膜进入细胞内，因此可以减少假阳性的可能性，提高筛选效率。
3.细胞抗原表面标记法。
这种方法将鉴定两个细胞表面分子不同的抗体分别标记上荧光素或放射性同位素等物质，然后将未融合的母细胞与杂交瘤细胞混合后进行筛选。
可以通过比较杂交瘤细胞和母细胞的表面标记，即可筛选出杂交瘤细胞。
综上所述，通过细胞融合法、电穿孔法和病毒介导法可以产生杂交瘤细胞。
通过限制性稀释法、间接酶标记法和细胞抗原表面标记法可以对杂交瘤细胞进行筛选，获得稳定的杂交瘤细胞系。
这些杂交瘤细胞系常用于蛋白质、激素和抗体等的生产。
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杂交瘤细胞的制备
1. 骨髓瘤细胞的准备
选择生长状态良好的细胞，浑圆透亮，大小均一，边缘清晰，排列整齐，呈半致密分布。
弃上清，以不完全培养基洗涤一次后，用10mL 不完全培养基将骨髓瘤细胞（SP2/0）轻轻吹下。
2. 脾淋巴细胞的准备
a、取加强免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血供分离阳性血清。
b、颈脱位将小鼠致死，用75%酒精消毒体表5min，随即放入超净台内小鼠解剖板上，左侧卧位，用7号针头固定四肢。
c、无菌打开腹腔取出脾脏，用基础培养基洗涤，并仔细去掉周围附着的结缔组织。
d、随后将脾脏转移到另一个盛有DMEM的平皿中。
以弯头针头压住脾脏，用小针头在脾脏上插孔，并用镊子挤压，使脾细胞充分释放，制成脾细胞悬液。
3. 饲养细胞的制备
取一只健康的ICR小鼠，摘眼球采血，颈脱臼处死，体表消毒和固定后，从大腿上剪开皮肤，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜。
用10mL注射器，12#针头，注射5-10mL HAT培养基到腹腔，右手固定注射器，
左手持酒精棉球轻轻按摩腹部，抽回腹腔内液体，注入已准备好的容器中。
4. 细胞融合
a、将上述制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于一支50mL的带盖的离心管中，1000rpm离心10min，上清要充分吸净，以免影响PEG的作用。
b、将融合管置于手掌中，轻轻振荡底部，务使两种细胞充分混匀。
c、用1mL吸管将预热的PEG在45~60s内缓慢加到融合管中，边加边轻轻摇匀。
d、立即滴加37℃预热的DMEM，使PEG稀释而失去作用，具体加法是用吸管在第一分钟内加1mL预热的不完全培养基，第二分钟内加2mL，第三分钟加8mL（遵照先慢后快的原则），37℃静置10min，1000rpm 离心10min，弃上清。
e、加入5mL的HAT培养基，轻轻悬浮沉淀细胞，再加入适量的腹腔巨噬细胞，最后补加HAT至50mL左右。
f、分装于96孔细胞培养板，然后将培养板置37℃，5%CO2培养箱内培养。
g、5d后用HAT培养基换出一半培养基。
h、观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞上清进行抗体检测。