16SrRNA基因在临床上的应用进展
16s全长扩增子
16s全长扩增子16S全长扩增子是一种用于分析微生物群落结构的常用技术。
本文将介绍16S全长扩增子的原理、应用以及未来发展方向。
一、16S全长扩增子的原理16S rRNA是细菌和古细菌的小亚基核糖体RNA，在细菌和古细菌中高度保守。
通过对16S rRNA基因的扩增和测序，可以获得微生物群落中不同物种的16S rRNA序列信息。
为了获得16S全长扩增子，需要设计引物覆盖整个16S rRNA基因，并进行PCR扩增。
扩增子的测序结果可以通过比对数据库中的16S rRNA序列，确定微生物的分类学信息和丰度。
二、16S全长扩增子的应用1. 微生物多样性研究：通过16S全长扩增子可以获得微生物群落中不同物种的信息，从而研究微生物的多样性和组成结构。
2. 疾病诊断：微生物群落与宿主的健康状态密切相关，通过分析16S全长扩增子可以发现微生物与疾病之间的关联，为疾病的早期诊断提供依据。
3. 环境监测：16S全长扩增子可以应用于水体、土壤等环境中微生物群落的监测，了解环境中微生物的种类和数量变化，为环境保护提供科学依据。
4. 营养与代谢研究：通过16S全长扩增子可以研究微生物与宿主营养代谢的关系，了解微生物对宿主的影响，为肠道微生物相关疾病的治疗提供新的途径。
三、16S全长扩增子的未来发展方向1. 多组学研究：结合16S全长扩增子与其他组学技术，如转录组、代谢组等，可以更全面地了解微生物与宿主的相互作用，深入研究微生物的功能与代谢。
2. 单细胞测序技术：目前16S全长扩增子主要是通过测序得到微生物群落的平均信息，而单细胞测序技术可以研究微生物群落中个体微生物的基因组信息，更加精细地了解微生物群落的多样性和功能。
3. 数据分析与挖掘：随着高通量测序技术的发展，生成的测序数据量巨大，对数据的分析和挖掘能力提出了更高的要求。
未来需要开发更多的分析工具和算法，以提高数据的解读效率和准确性。
4. 微生物组工程：通过16S全长扩增子的分析结果，可以对微生物进行定向改造和调控，以实现特定功能的微生物群落的构建，为农业、环境和医学等领域提供新的解决方案。
16SrRNA基因与结直肠癌患者肠道相关分子微生态研究进展
［］刘 承基 ．脑血管外 科学［ ．南京 ：江苏科学技术 出版 ２ Ｍ］
社 ，２０ ：３ ７ ００ ０．
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云南 医药 ２ １ 年第 ３ 卷第 ２ ００ ｌ 期
群 的 影 响 ，首 先 要 正 确 获 得 肠道 这 一 复杂 微 生 态
癌 患 者 术后 ＢＥ 比值倒 置尤 为 明显 ，以双 歧 杆 菌 ／ 及乳 酸杆 菌 的减少 最 为显著 ，而双歧 杆菌 及乳 酸
环境 内的细菌构成 。传统研究肠道 菌群 的分离培 养方法 ，对培养条件要求较高 、费时 、费力 ，且 大 部分 肠 道共 生 菌 为专 性 厌 氧菌 ，难 以 培养 。 Ｇ ａ ｅ 等研究表明 ：培养法只能检出胃肠道菌群 ｕｒ ｒ ｎ
结直肠癌是 人类常见的恶性肿瘤之一 ，其 发 病率位居全球恶性肿瘤第三位Ⅲ ，在西方 国家居第 二位 ，亚洲国家发病率在继续上升 。在荷兰 ，发 病 率 为 ６３１ ０ ，在 美 国 为 ５２１ ０ ｔ 。研 究 ． ００ ０ ／ ． ０００ ／
证 明 ：肠道菌群与肠粘膜细胞长期直接接触 ，对
讨
论
脑 室 出 血 分 为 原 发 性 脑 室 出血 与 继
发性 脑 室 出血 ，其 临床 症状 主要 取决 于 ３个 因 素 ： 出血量 ；脑 室 系统 是 否 存 在 梗 阻 ； 以及 出血 部 位
夹管期 间要严 密观察病情 变化 ，若发现有颅 内压
明显 增 高 时 ，要 即 时开 放 引 流 。脑 室 引 流 管 外 接 专 用 脑 室 外 引流 装 置 ，引 流 速 度 不 宜太 快 ，应尽
16S rRNA基因及16S～23S rRNA基因区间在临床细菌学检验中的应用
第39卷 第4期2003年12月青岛大学医学院学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE QIN G DAO UNIV ERSITATISVol.39,No.4December 2003[收稿日期]2002210218; [修订日期]2003202216[作者简介]毕春霞(19692),女,硕士,主管检验师。
16S rRNA 基因及16S ～23S rRNA 基因区间在临床细菌学检验中的应用毕春霞1,闫志勇2,王 斌2(1 青岛市市立医院检验科,山东青岛 266011; 2 青岛大学医学院微生物学教研室) 核糖体16S RNA (16S rRNA )为所有细菌所共有,其编码基因兼保守性和变异性于一身,素有细菌的“分子化石”之称。
通过对16S rRNA 基因保守区引物进行聚合酶链反应(PCR )扩增,可早期、快速判断细菌的存在与否,因此在临床细菌感染的检验中有较高的应用价值。
本文就细菌16SrRNA 基因的特征、在检测临床细菌感染中的应用,以及一种新方法———16S ～23S rDNA 区间序列在分类及鉴别细菌的应用研究等作一综述。
1 16S r RNA 基因及16S ～23S r RNA 基因区间的基本特征细菌的核糖体RNA 按沉降系数分3种,分别为5S 、16S 和23S 。
其编码基因(rDNA )的链长依次为3300、1540和120个核苷酸。
一般来说,原核生物基因组结构不像真核生物那样具有高度重复序列,但细菌中的rDNA 在染色体上却以多拷贝形式存在,且微生物中rDNA 的拷贝数与其生长速率相关,现已确知大肠杆菌中rDNA 的拷贝数是7,结核杆菌中为2,枯草杆菌是10,这就使针对细菌rRNA 基因进行的分子生物学检测具有较高的灵敏度。
rRNA 操纵子被转录成前rRNA 时包含以下几个成分(从5′→3′):16S 、区间、tRNA 、区间、23S 、区间和5S rDN A 序列[1]。
16sDNA的应用
16sDNA简介及其应用于细菌鉴定的优点近年来，基于PCR扩增的基因诊断技术备受青睐，细菌核糖体16S小亚基基因(16SrDNA)鉴定引起了科研人员的广泛关注。
16S rDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大(约占细菌RNA含量的80%)，分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。
在大多数原核生物中rDNA都具有多个拷贝，5S、16S、23S rDNA的拷贝数相同。
16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在细菌基因组中，编码16S rRNA 的rDNA 基因具有良好的进化保守性，适宜分析的长度( 约为1 5kb)，以及与进化距离相匹配的良好变异性，所以成为细菌分子鉴定的标准标识序列。
目前16SrDNA 的序列信息已经广泛应用于菌种鉴定和系统发生学研究。
那么，利用16SrDNA进行细菌鉴定有哪些优点呢?1、16S rRNA 普遍存在于原核生物中。
rRNA 参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。
2、在16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。
3、16S rRNA 的相对分子量大小适中，约1540 个核苷酸，便于序列分析。
4、可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
由上可知，细菌核糖体16S小亚基基因(16SrDNA)鉴定拥有其他类似技术不能比拟的优势，16S rDNA的潜力不容忽视，我们可以预见，未来这一技术将在各个生物领域大有可为。
16SrRNA基因在医学微生物鉴定中的应用效果观察
［ ］ 雷正瑜．６ ｒ Ｎ １ １ＳＤ Ａ序列分析技术在微生物分 类鉴定 中的应用 ［ ］ 湖北 Ｊ． 生态工程职业技术学院学报 ，０ ６４（ ） ３— ． ２ ０ ， １ ： ７ ［ ］ Ｍｉ ｅ ｗ Ｉ ＯｓｎＫ，ｏａｏＪｅ ａ． ａｎ ｓｃ ｔｉ ｎ ｌ ｉａ ｓｎｆ ２ ｃ ｌ Ｃ， ｌ Ｌ ｚｎ ，ｔ Ｄｉ ｏｔ ｉｔ ａｄｃｉｃｌｉ ｉ ｈｏ ｅ １ ｇ ｉｕ ｌ ｙ ｎ ｇ － 从（ 上表中可以看出） 采用 １ Ｓ Ｎ ， ６ ｒ Ａ基 因检查诊 断支原体肺炎 较采用 Ｒ 血清学检查诊 断支原体肺炎在假 阳性率 、 敏度、 灵 耗时方面有明显的优势 ， Ｐ ＜ ．５ 比较差 异有统计学意义 。 Ｏ０ ，
标准。
【 关键词 】６ ｒ Ｎ １ＳＲ Ａ基 因； 医学微生物检 定； 效果评价 ｄ ｉ１ ．９ ９ｊｉ ｎ １０ ０：０ ３ ６ ／．ｓ ．０ ６—１５ ．０ １０ ．７ ｓ ９ ９２ １ ．８０ ９ 文章编号 ：０ ６—１５ （ ０ １ ０ ３ ９ １０ ９９ ２ １ ）一 ８— ５ ４—０ ２ １Ｓ Ｎ ６ ｒ Ａ基因序列检测技术的原理是 ： Ｒ 细菌染 色体上编码 ｒ Ｎ Ｒ Ａ的相 对 应 的 Ｄ Ａ序列存在于所有细 菌及衣 原体 、 克次体 、 Ｎ 立 支原体 、 旋体 、 线 螺 放 菌等原核生物的染色体基 因中 ， 不存在 于病毒 、 真菌等非 原核生 物体 内， 而 目前 ， 几乎所有病原 菌的 １ Ｓ Ｎ ６ ｒ Ａ基因测序均 已完成 ， Ｒ 这样 ， 使得采用基 因 序列图谱进行对比分 析测试 病原菌 的种 类成为 了可能 ， 过该技术 可 以准 通 确快速的鉴定细菌的种类 … 。 养、 免疫学和生化反应等方法 ， 这些检测方 法的检 测结果受 多种因索影响 ， 均存在特异性差、 耗时长 、 敏感 度低等问题 ， 以满 足临床 医学 检验的发展 难 要求 Ｌ． 。近年来 ， ２ ｊ Ｊ 随着聚合酶链式反应 （ Ｃ 技术的出现及核酸研究技术 Ｐ Ｒ） 的不断完善以及其它分子生 物学技术 的迅 速发展 ， 生了很多新 的细菌分 产 类鉴定 方法 ， 常见 的如 限制 性片段 长度多态 性分 析、 质粒 图谱 、 Ｎ ｒ Ａ基 因 Ｒ （ ｒ Ｎ ） 即 Ｄ— Ａ 指纹 图 、 Ｃ Ｐ Ｒ指纹 图、 ６ １ Ｓ核糖 体核 糖核 酸 （ｉ ｓ ａ Ｒ Ａ ｒｏ ｍ ｌ Ｎ 。 ｂｏ １资 料 与 方 法 ． ｒＮ 序列分析等＿ 。这些 技术均 基于对细 菌染色 体或染 色体外 的 Ｄ Ａ Ｒ Ａ） ４ Ｊ Ｎ １ １ 一般资料 ： ． 本组 ５ ４例患者 中 ， 男性 ２ ３例 ， 女性 ３ １例 ， 年龄 ２一ｌ 片段进行分析 ， １ 从分子遗传的角度对细菌进行分类鉴定 ， 从而使细菌分类更 岁， 平均年龄 ６ ２ ．３岁 。所有患者均进行血清学检查诊 断和 １ＳＲ Ａ基 因序 精确 、 ６ｒＮ 更科学。特别今年来出现的 １ＳＲ Ａ基因序列分 析技术 ， 以做到用 ６ｒＮ 可 列检测肺炎支原体。以上患者的临床表现主要有 ： 头痛、 发热伴有无力 和干 实验 研 究 来 研 究 证实 细 菌 进 化 与 否 ， 是 细 菌 分 类 史 上 的一 次 革 命 【ｊ 目 这 ５。 咳等。 前， 大多 数致病 菌 的 １ ＳＲ Ａ基 因序 列 已经被测 定 完成 ， 于 Ｐ Ｒ扩增 ６ ｒＮ 关 Ｃ １２ 检查方法 ： ． 分别对 ５ ４例患 者进行血清 血检查 诊断 和 １ＳＲ Ａ基 １ＳＲＮ ６ｒＮ ６ ｒ Ａ基因用 于细菌分类和鉴定 的研究越来越多ｔ］ ６。 因序列检查诊 断， 统计两种检查方法的假阳性率 、 灵敏 度、 检测耗时等指标 ， 肺炎支原体是一类能在无生命人 工培养基 中生 长、 繁殖 的最小 的原核 分析两种检测 方法在诊断肺炎支原体感 染时的优劣 。 型微生物 ， 曾被称 为胸膜炎微 生物（ ｌ ｒｐ ｅｍ ｎａ ｉｅｏｇｎｓ Ｐ Ｌ 。 ｐｅ ｏ ｎｕ ｏｉ —ｌ ｒａｉ ｕ ｋ ｍ， Ｐ ０） １２ １ 血清学检查诊断 ： 体感染肺 炎支原 体后 ， ．． 人 血清 中除了出现 特 临床 的上呼吸道感染 、 气管支气 管炎及非典 型肺炎经 常是 由肺炎支原 体感 异性抗体外还存在冷凝素 ， 患者的稀释血清 与 Ｏ型红细胞在 ４Ｃ ＂ 下可发生凝 染引起 。由于肺炎支原体感染 所致 的肺 炎患者临床表现 症状不典型， 需 集， 此为 Ｉ 型抗体 。以 Ｅ Ｉ ｇ Ｍ ＬＳ Ａ方法检 测患者 血清 中 Ｍ Ｐ—Ｉ ｇ Ｍ。以 Ｍ 要经过 １ Ｐ— ０～２ ｄ的潜伏期才 能表现 出来 ， ０ 临床 症状主要 为非特异性 的头痛 Ｉ ｇ Ｍ≥ｌ８ 和 （ ） 凝集 试验 ≥１３ ： ０ 或 冷 ： ２判断为有支原体感 染， 结合临床有发 和发热 ， 患者常常伴有无力和干 咳 ， 根据这些 临床 症状较难判断为肺炎支原 热、 头疼、 无力 、 干咳等症状判定为感染肺炎支原体 。 体感染 ， 因此临床 常被忽视而导致 严重 的并 发症 ， 因此 ， 利用实验 检查 就成 １２ ２ ６ ｒＮ ． ． １ Ｓ Ａ基因序列 检查 ： Ｒ 从鼻咽和 口腔采用拭子采 样进行 Ｐ Ｒ 为 了诊断肺炎支原体感染的主要依 据【 。近年来 ， Ｃ ８ Ｊ 对于肺 炎支原体感 染的 扩增 ， 引物取 自 肺炎支原体的 １ＳＲ Ａ， 照肺 炎支原体 的基 因序列进行对 流 行 病 学 特 征 、 病 机 制 、 子 生 物 学 检 测 方 法 的 研 究 报 道 较 多 。 目前 ， ６ ｒＮ 按 致 分 用 比分析 ， 符合肺炎支原体基因序列并 伴有发热 、 头疼 、 无力 、 咳等症状判定 于诊断支原体肺炎 的方法是取上呼吸道标本做 Ｐ Ｒ和急性期血 Ｉ 千 Ｃ ｓ Ｍ的复合 为感染肺炎支原体 。 测定 。但人们对于上呼吸道 ＭＰ携带者与急性 期肺炎上 呼吸道标本的 Ｐ Ｒ Ｃ １３ 统计学方法 ： ． 计量资料采用 ｔ 检验 ， 数资料采用 ｘ 检 验 ， 计 且以 Ｐ 阳性者较难区分， 且对于儿童诊 断 ＭＰ肺炎取材 的理想位置和方法还未明 而 ＜ ． ５为有统计学意义 。 ００ 确建立 。因此 ， 找到一种有效、 快速 、 期的支 原体肺 炎鉴定方法 就显 得尤 早
16S rRNA基因及16S～23S rRNA基因区间在临床细菌学检验中的应用
第39卷 第4期2003年12月青岛大学医学院学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE QIN G DAO UNIV ERSITATISVol.39,No.4December 2003[收稿日期]2002210218; [修订日期]2003202216[作者简介]毕春霞(19692),女,硕士,主管检验师。
16S rRNA 基因及16S ～23S rRNA 基因区间在临床细菌学检验中的应用毕春霞1,闫志勇2,王 斌2(1 青岛市市立医院检验科,山东青岛 266011; 2 青岛大学医学院微生物学教研室) 核糖体16S RNA (16S rRNA )为所有细菌所共有,其编码基因兼保守性和变异性于一身,素有细菌的“分子化石”之称。
通过对16S rRNA 基因保守区引物进行聚合酶链反应(PCR )扩增,可早期、快速判断细菌的存在与否,因此在临床细菌感染的检验中有较高的应用价值。
本文就细菌16SrRNA 基因的特征、在检测临床细菌感染中的应用,以及一种新方法———16S ～23S rDNA 区间序列在分类及鉴别细菌的应用研究等作一综述。
1 16S r RNA 基因及16S ～23S r RNA 基因区间的基本特征细菌的核糖体RNA 按沉降系数分3种,分别为5S 、16S 和23S 。
其编码基因(rDNA )的链长依次为3300、1540和120个核苷酸。
一般来说,原核生物基因组结构不像真核生物那样具有高度重复序列,但细菌中的rDNA 在染色体上却以多拷贝形式存在,且微生物中rDNA 的拷贝数与其生长速率相关,现已确知大肠杆菌中rDNA 的拷贝数是7,结核杆菌中为2,枯草杆菌是10,这就使针对细菌rRNA 基因进行的分子生物学检测具有较高的灵敏度。
rRNA 操纵子被转录成前rRNA 时包含以下几个成分(从5′→3′):16S 、区间、tRNA 、区间、23S 、区间和5S rDN A 序列[1]。
16SrRNA论文疾病诊断论文环境保护论文：16SrRNA基因应用研究进展
16S rRNA论文疾病诊断论文环境保护论文：16S rRNA基因应用研究进展【摘要】16s rrna分析的实验技术为微生物生态学的研究提供了新的研究方法，因此越来越多的学者利用16s rrna 进行各种实验的研究并取得了骄人的成绩。
本文对16s rrna 基因的获得做一简单介绍，重点介绍16s rrna基因的应用。
16s rrna在细菌菌种鉴定、环境保护、疾病诊断等方面都取得了很好的研究进展，不久的将来16s rrna基因将会为人类做出更大的贡献。
【关键词】16s rrna；菌种鉴定；疾病诊断；环境保护前言随着遗传学、分子生物学、细胞生物学等学科的迅速发展，越来越多的新方法和新技术被应用于分子水平研究领域。
在这样的背景下，16s rrna基因的研究无论在广度和深度上都取得了显著的成就，16s rrna基因技术的应用在微生物多样性、微生物种群分析、重要基因的发现、以及遗传物质在微生物之间或微生物与非生物环境之间相互关系等方面均做出了巨大的贡献，并开辟了微生物生态学研究新的领域。
关于16s rrna基因方面的综合性论述尚未见报道，本文将为该领域的进一步研究提供必要的综合信息。
1 16s rrna基因的简介:细菌rrna按沉降系数分为3种，分别为5s、16s和23s rrna。
其中位于原核细胞核糖体小亚基上的16s rrna长约1540bp，结构和碱基排列复杂度适中，较易于进行序列测定和分析比较。
16s rdna是细菌染色体上编码16s rrna相对应的dna序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成，因此可用pcr扩增其相应的rdna片断，来快速、灵敏地检测样品中是否存在某些细菌或致病菌，或进行细菌多样性分析。
2 16s rrna基因在细菌菌种鉴定中的应用:1977年c.woese通过对各种生物的rrna进行分析，认为16s rrna 基因及其类似的rrna基因序列作为生物系统发育指标最为合适，提出了可将自然界的生命分为细菌、古菌和真核生物三域（domain），揭示了各生物之间的系统发育关系，使微生物学进入到成熟时期，因此许多研究采用测16s rrna基因部分序列的方法进行多样性分析。
16SrRNA测序技术在肠道微生物中的应用研究进展_李东萍
・技术与方法・生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2015, 31(2):71-77近年来肠道微生物与饮食和健康的关系被越来越多的阐释，在很大程度上得益于肠道微生物研究技术的快速发展。
肠道微生物的研究大 体经历了培养依赖的方法，非培养依赖的传统分子生物学方法，基于测序的高通量组学方法3个阶段。
鉴于本课题组已针对前两个阶段的方法发表了专门的综述文章，对此做了详细全面的介绍和比较［1］，在本文中，将对第三阶段的方法，即近几年发展迅速并成为主流的16S rRNA 高通量测序法作详细介绍。
通过比较3个阶段研究方法的特点与应用，人们可以发现培养依赖的方法在鉴定菌种的同时即可获得相应菌株，方便后续研究，但培养法本身费时费力，肠道微生物以厌氧菌和兼性厌氧菌为主，培养起来更加困难，并且在培养的过程中菌种比例会发生改变，使得其应用存在瓶颈。
非培养依赖的传统分子生物学方法可以不经培养直接从样品中提取肠道微生物基因组，利用分子生物学手段进行分离、鉴定和定量，使其结果可以比较准确的反应肠收稿日期：2014-06-28基金项目：北京市科技新星计划（XX2014B069）作者简介：李东萍，女，研究方向：食品科学与工程；E -mail ：345908374@ 通讯作者：许文涛，男，副教授，博士生导师，研究方向：食品病原微生物的检测技术和致毒机制、转基因生物检测和食用安全性评价、食品源风险因子对肠道微生物健康的影响；E -mail ：xuwentao1111@16S rRNA 测序技术在肠道微生物中的应用研究进展李东萍1 郭明璋1，2 许文涛1，2（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2. 中国农业大学 食品科学与营养工程学院食品安全检测与风险评估实验室，北京 100083）摘 要： 16S rRNA 测序是高通量测序依赖的肠道微生物研究方法之一，该方法可以对肠道微生物中的所有菌种进行精确定量，因此正逐渐成为研究肠道微生物菌种丰度变化的主流。
应用16SrRNA基因序列分析快速鉴定临床标本中的革兰氏阳性杆菌
应用16SrRNA基因序列分析快速鉴定临床标本中的革兰氏阳性杆菌目的探索一种快速鉴定临床标本中革兰氏阳性杆菌的方法。
方法利用PCR技术扩增待检菌株的16 S rRNA基因序列，通过分析待检菌株的16 S rRNA基因序列对其进行鉴定。
结果5株待检菌株的16 S rRNA基因序列均成功扩增，其中4株的16 S rRNA基因序列与基因库中已注册的核酸序列相似率达99.9%以上，将其鉴定到种的水平，1株的16 S rRNA基因序列与基因库中雷弗森菌属的核酸序列相似率为97.09%，将其鉴定为雷弗森菌属。
结论应用16 S rRNA基因序列分析可快速、准确地鉴定临床标本中的革兰氏阳性杆菌。
标签：16 S rRNA基因；细菌鉴定；革兰氏阳性杆菌近年来，随着人口老龄化、免疫损害宿主增加等因素的影响，革兰氏阳性杆菌感染的发病率有升高趋势[1-3]。
常见的革兰氏阳性致病杆菌有单核细胞增生性李斯特菌、棒状杆菌、红斑丹毒丝菌、诺卡菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌以及炭疽杆菌等。
革兰氏阳性杆菌感染其表型特征的敏感性及特异性较差，通过常规检验手段对其进行快速、准确的鉴定比较困难。
2012年3～10月，本研究从临床标本中相继分离出5株革兰氏阳性无芽胞杆菌。
为了快速、准确地鉴定这些菌株，笔者利用PCR技术对其16 S rRNA基因进行扩增，然后通过16 S rRNA基因序列分析将其鉴定至属或种的水平。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株5株革兰氏阳性杆菌均分离自北京武警总医院各科临床标本，菌株编号分别为QC0411、QC0823、Y0720、Z0802、20983。
1.1.2 试剂Chelex-100树脂（伯乐公司，美国），琼脂糖G-10（Gene公司，美国），溴乙锭（Promega公司，美国），Ex Taq聚合酶试剂盒及DL2000 DNA Marker均购自宝生物工程大连有限公司。
16 S rRNA基因的扩增选用16 S rRNA 基因细菌通用引物（F：5′-AGAGTT-TGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）[4]，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
16s rdna序列 16s rrna基因序列 -回复
16s rdna序列16s rrna基因序列-回复16s rDNA序列，也称为16s rRNA基因序列，是细菌和古细菌中高度保守的基因序列，广泛应用于系统发育学、微生物多样性研究和环境监测等领域。
本文将一步一步回答有关16s rDNA序列的问题，从基础知识到应用领域进行讨论。
第一部分：16s rDNA序列的概述首先，我们需要了解什么是rDNA和rRNA。
rDNA是指能够编码特定类型的RNA的DNA区域，例如编码rRNA的基因。
rRNA则是核糖体的主要组成部分，负责蛋白质合成过程中的RNA酶活性和结构支持。
16s rDNA序列指的是编码16s rRNA的基因序列。
16s rRNA是细菌和古细菌中的一种rRNA，其具有高度保守性，不同物种之间的差异主要在其中嵌入的可变区域。
这种高度保守性使得16s rDNA序列成为一种常用的分子标记，用于研究生物分类和演化关系。
第二部分：16s rDNA序列的研究方法了解16s rDNA序列的研究方法对于理解其应用具有重要意义。
常用的16s rDNA序列的研究方法包括PCR扩增、测序和分析。
PCR扩增是首先要进行的步骤，它使用特定的引物将16s rDNA序列从样本中扩增出来，使其成为测序的载体。
随后，扩增的片段将被测序，通常采用Sanger测序或高通量测序技术。
得到16s rDNA序列数据后，接下来需要进行序列分析。
常见的分析方法包括序列校正、比对和构建系统发育树。
比对可以将不同物种的16s rDNA 序列进行对比，找出其中的变异位点，进一步分析不同物种间的差异和相似性。
构建系统发育树则可以帮助我们了解不同物种的进化关系。
第三部分：16s rDNA序列在系统发育学中的应用16s rDNA序列在系统发育学中起着重要的作用。
通过比对和构建系统发育树，我们可以了解不同物种之间的进化关系，并揭示它们的分类位置。
在物种鉴定中，16s rDNA序列可以用于确定未知物种的分类位置。
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近10余年来分子生物学技术发展迅速,各种基因方法如DNA 杂交、质粒图谱和16S rRNA 序列分析等在临床上得到广泛应用。
该文就近年来国外16S rRNA 在细菌学研究及其应用的一些新进展作一综述。
【关键词】 RNA ,核糖体,16S; 基因【中图分类号】 Q522 【文献标识码】 A 【文章编号】100123512(2005)0420252204 16S rRNA 基因是细菌染色体上编码rRNA 的相对应的DNA 序列,存在于所有细菌及衣原体、立克次体、支原体、螺旋体、放线菌等原核生物的染色体基因中,不存在于病毒、真菌等非原核生物体内。
16S rRNA 具有以下特点:(1)多拷贝。
以多拷贝形式存在于细菌染色体基因组中;(2)多信息。
编码基因由可变区和保守区组成,保守区为所有细菌共有,细菌间无差别;可变区具有属或种的特异性,可据此设计引物、探针。
(3)长度适中。
其编码基因长度约1500bp 。
目前,几乎所有病原菌的16S rRNA 基因测序均已完成,因此被选为细菌病原体PCR 扩增部分或全部序列的目标[1]。
1 研究方法1.1 基因芯片技术 基因芯片技术也称DNA 微阵列(DNA arrays ),指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量DNA 探针以点涂的方式有序地固化于支持物表面,然后与标记的样品杂交,通过对杂交信号的检测分析,即可得出样品的信号(基因序列或表达信息)。
其突出特点在于高度的并行性、多样性、微型化和自动化。
有时胶体电泳会得出模糊的结果,非特异的PCR 产物使电泳解释显得困难,而芯片杂交却不会 作者简介:杨祖卿(19762),男,浙江苍南人,在读硕士研究生,主要从事儿童感染性疾病的分子生物学研究。
为这一问题所困扰;短的产物和阵列杂交更有效,PCR 效果更好,因为芯片杂交不会受限于产物的长度以至不能鉴别[2]。
1.2 单链构象多态性分析 单链构象多态性分析的基本原理是单链DNA 呈现复杂的构象,而这种立体构象主要是依靠单链内碱基配对等分子内相互作用维系的,当碱基发生改变时,必然会影响其构象改变。
一旦变性,单链DNA 片段采用一种基于其序列上的特定构象,通过非变性凝胶电泳保持这种构象。
这种情况导致了那些具有类似大小却有不同序列的PCR 产物在电泳移动度上有一个变化,这允许它们在检测点不需要完全测序就能区别开来[3]。
聚丙稀酸胺凝胶电泳可敏锐地检测单链DNA 序列改变所导致的构象变化。
小于400bp 的DNA 片段经变性、双链解链为单链条件下进行聚丙稀酸胺凝胶电泳,根据迁移率的改变可发现具有一个bp 变异的DNA 链。
细菌16S rRNA 的保守区是理想的引物目标识别区,而可变区对种类鉴别是有用的。
细菌的16S 核糖体基因证实种类特异的序列变异性导致一种DNA 片段构象很容易被单链构象多态性分析所证明。
1.3 荧光定量技术 T aq Man 技术的基本原理[4]是利用T aq 酶的5′23′外切酶核酸活性,在普通引物5′端和3′端中添加一条荧光双标记探针,分别标记上荧光报告基团(R)和淬灭基团(Q)。
当这条探针保持完整时, R基团的荧光信号被Q基团抑制,一旦探针被切断,抑制作用消失,R基团的荧光信号就可以被检测到。
该方法采用完全闭管检测,省去了对PCR产物的后处理,避免了交叉污染,结果判断由计算机完成,简化了操作步骤,并增加了结果的可靠性,检出拷贝数达103。
Y ang等[5]发现,T aq Man PCR测定的理论极限是由细菌DNA的扩增序列稀释度决定的。
其最低的检测限度定义为:当Ct(threshold cycle,每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数)与起始模板DNA关系成非线性时的模板DNA的数量。
他们研究金黄色葡萄球菌DNA的系列稀释度,发现表示Ct与起始模板DNA关系之间的标准曲线在50ng～5pg之间时成线性关系,当DNA水平低于5pg时,这种关系就变成非线性关系。
1.4 末端限制性片段长度性多态分析 该法对标本中核酸的核糖体序列进行扩增,由于特异的限制性核酸内切酶作用在扩增的核糖体序列上位置的改变,末端限制性片段长度性多态分析(TRF LP)产生具有不同长度的片段,这些带有各种信息的片段被经典的荧光所标记,因此,在自动DNA测序仪上可以被检测出[6]。
R ogers等[6]采用14个经支气管镜提取或痰的标本,对其细菌16S rRNA基因PCR产物扩增,然后用TRF LP 分析,发现12个不同的具有3～32个TRF LP条带的图形被鉴定出来,与培养结果相对应。
在5名患者的103份16S rRNA基因克隆中,铜绿假单胞菌占首位(59%)。
Christensen等[7]创建了末端限制性片段(TRF)图像数据库,内含从2860种不同细菌种类的序列信息所得的5899种已知的TRF图像,每个微生物的TRF图像通过比较片段大小就能确定。
Marcello 等[8]在比较生化和气液色谱法的基础上对口腔消化链球菌属进行TRF LP,7种主要消化链球菌属产生不同的指纹图谱可以有效地区分开来。
1.5 16S rRNA直接测序法 细菌16S rRNA序列的轻微差异能用来分类[9]。
Drancourt等[10]对临床上用常规标准方法花5年时间不能鉴别的微生物菌落采用16S rRNA基因序列分析,每种菌株产生1个大于1400 bp的序列,包括相对于基因库来说存在少于5个的模糊区;1404份菌株被检测,120份被认为是独特的(27份)或稀有的(文献报道少于10例的),11份被确认为新的菌株。
因为所有的细菌种类至少有1个16S rRNA 基因拷贝,而且不受观察者的主观看法所影响,如果2个16S rRNA基因序列不同,那么就是不同的菌种。
由此得出结论:16S rRNA序列分析为基础的细菌检测法在目前识别异常细菌引起的疾病上扮演着重要的角色。
T eng等[1]用引物RW01和DG74扩增部分多形拟杆菌16S rRNA的片段,发现除了预期的362bp产物外还有意外的扩增子(547bp),此扩增子的存在可用来区分多形拟杆菌与相邻的种属;同时在这个547bp基因片段序列的基础上开发特异引物。
这2种以PCR 为基础的测定方法显示具有相同的敏感性(88%)和特异性(100%)。
2 临床应用2.1 新生儿败血症 1994年G reren等报道了分子技术如PCR已经成功地鉴定了大范围的微生物,包括细菌、酿母菌、病毒和原核生物。
Jordan等[11]比较PCR 和BACTEC9240培养法,PCR的敏感性、特异性、阳性和阴性预期值分别为9610%,9914%,8819%和9918%。
与传统的细菌培养法比较,采用PCR扩增细菌16S rRNA来检测细菌的方法不仅灵敏度高、检测耗时少,而且不受存在抗菌药物或其他抑菌物质的干扰,可在抗菌药物治疗开始后及治疗过程中检测出患者体内或病灶内是否存在细菌。
Jansen等[12]采用一种简单、直接、用特异荧光标记的寡核苷酸探针进行全细胞杂交化验方法,结果显示,所有的探针除了金黄色葡萄球菌特异探针外都能取得1.000敏感度。
Shang等[13]在16S rRNA基因保守区内设计引物,分别采用通用、革兰阳性和阴性探针,敏感度达到1×10-12g,PCR最小DNA检出量为1pg(约3个细菌),所检测细菌均获371bp的阳性DNA条带,不与人基因组DNA及病毒交叉反应,且进一步建立了PCR的反相杂交方法。
30份健康血标本未见扩增产物,26份怀疑脓毒症或脑膜炎的临床标本(22份血液和4份脑脊液标本)扩增产物大小均为371bp,其中7种革兰阳性菌阳性标本的DNA只能与革兰阳性探针杂交;13种革兰阴性菌标本的DNA只能与革兰阴性探针杂交。
2.2 新生儿脑膜炎 新生儿脑膜炎临床特征通常不特异,脑脊液的分析既不敏感也不特异,细菌培养费时且敏感度低。
其他实验室技术包括血清学和抗原检测等缺少足够的敏感性和特异性。