食品氨基酸总量的测定(精)

第八章 食品氨基酸总量的测定

【教学目标】：

1.掌握氨基酸、含氮量等的概念和相关知识；

2.掌握氨基酸液氮的测定方法和操作技能；

3.了解比色法的原理，基本方法及仪器使用和维护的知识。

一、甲醛滴定法

1原理

氨基酸具有酸性的一COOH 基和碱性的一N 2H 基。它们互相作用使氨基酸成为中性的内盐。加入甲醛溶液时，一N 2H 基与甲醛结合，其碱性消失。这样就可能用碱来滴定一COOH 基，并用间接的方法测定氨基酸的量。用碱完全中和一COOH 基时的pH 值为

8.4~9.2。

2试剂

（1）40%中性甲醛：用百里酚酞作指示剂，将甲醋用碱溶液中和至淡蓝色。

（2）0.1%百里酚酞乙醇溶液。

（3）0.1N 氢氧化钠标准溶液。

3操作方法

称取粉碎样品5.00~10.00g 或液体样品5~10mL,置于烧杯中，加入50mL 水和活性碳约5g ，加热煮沸，过滤，用30~40mL 热水洗涤活性碳，收集滤液于三角瓶中，加入3滴百里酚酞指示剂，用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。加入中性甲醛20mL ，摇匀，静置1min ，此时蓝色已经消失，再用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。记录第二次滴定时消耗的碱液毫升数。

4计算

氨基酸态氮（%）=100014.0⨯⨯⨯W

V N 式中：N----氢氧化钠标准溶液的当量浓度；

V----氢氧化钠钠标准溶液的消耗量（第二次）（g ）;

W----样品溶液相当于样品的量（g ）;

0．014----氮的毫克当量。

5说明

（1）用碱性溶液第一次滴定时，用pH 计控制滴定到溶液pH7.5后，然后加入中性甲醛继续用碱液滴定，又用pH 计控制用碱液滴定样液至pH9.2为终点较为正确。

（2）取相同2份样品溶液，其中1份加入中性红指示剂3滴，用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至琥珀色为终点，另1份加入百里酚酞指示剂3滴和中性甲醛20mL ，静置1min 后，用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。按下列、公式计算：

100014.0)((%)12⨯⨯-⨯==W

V V N X 氨基酸 式中： 2V ------用百里酚蓝作指示剂时消耗氢氧化钠量（mL ）；

1V ------用中性红作指示剂时消耗氢氧化钠量（mL ）；

N ------标准氢氧化钠溶液的当量浓度；

W------样品重量（g ）；

0.014----氮的毫克当量。

以上方法更为准确些。中性红指0.1%中性红、50%乙醇溶液。

（3）用pH 计控制滴定终点，可以解决样液色深问题。

二、茚三酮比色法

1原理

氨基酸在一定的pH 条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。最近的研究指示，这种颜色不是由于单一物质，而是由于好几种有色物质，有些要视所用氨基

酸的本性而定，但在一切事例中，都可观察到形成紫色的双一1，3——二酮茚； 2试剂

（1）茚三酮：分析纯。如包装不良变红色时，应按下法处理。将5g 茚三酮溶于20mL 热水中，加入0.5g 活性碳，轻轻摇动，30min 后过滤。滤液置冰箱中过夜，即出现蓝色结晶。过滤，用1mL 冷水洗涤结晶。然后置于干燥器中干燥，装瓶保存。

（2）2%茚三酮溶液：称取茚三酮 1.0g ，溶于25mL 热水中，加入40mg 氯化亚锡（O H SnCI 22⋅）拌匀（作防腐剂），过滤，滤液置冷暗处过液，定容至25mL 。

（3）磷酸盐缓冲液（pH8.04）:1/15moL/L 磷酸二氢钾5mL 与1/15moL/L 磷酸氢二钠 95mL 混匀[1/15moL/L 磷酸二氢钾液：取本品9.070g 溶于水成1000mL ；1/15moL/L 磷酸氢二钠液：取磷酸氢二钠（O H HPO Na 24212⋅）23.876g 溶于水成1000mL]。

（4）氨基酸标准液（ml g /20μ）：称取纯粹干燥的氨基酸（例如白氨酸）0.2000g,用水溶解并定容至100mL,摇匀。吸取此液10mL 于容量瓶中加水至100mL ，即得（ml g /20μ）标准液。

3操作方法

（1）标准曲线绘制

精确吸取氨基酸标准液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5……mL （相当于0、100、200、300、400、500……g μ氨基酸）分置于数个25mL 容量瓶中，加水补充至容积各为4.0mL,然后各加入茚三酮和缓冲液各1mL ，摇匀，置水浴中加热15min ，取出，迅速冷至室温，加水至刻度，摇匀。静置15min 后，在570nm 波长下测定光密度，绘制标准曲线。

（2）样品测定

移取澄清的样品溶液1~4mL （样液制备方法同单指示剂法），按标准曲线制作步骤操作，测定光密度，并扣除样液空白值后，从标准曲线上查得氨基酸微克数。按下式计算样品的氨基酸含量（以 某种氨基酸计）；

1001000

%)(⨯⨯=

W G mg 氨基酸总量 式中：G----从标准曲线上查得的氨基酸的量（g μ）； W----测定的样品溶液相当于样品的量（g ）。