人胰腺核糖核酸酶的基因克隆、蛋白表达与活性测定
分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达
分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达第一节基因操作概述 (2)一、聚合酶链式反应(PCR) (2)二、质粒概述 (4)三、凝胶电泳 (5)四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 (6)五、重组质粒的连接 (6)六、限制性内切酶消化 (7)七、SDS-PAGE蛋白质电泳 (7)第二节材料、设备及试剂 (7)一、材料 (7)二、设备 (8)三、试剂： (8)第三节操作步骤 (9)一、目的基因的获得： (9)二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的获得： (11)三、pET-21b等与目的片段的连接作用 (12)四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定 (12)五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进行SDS-PAGE电泳。
(13)六、融合蛋白的毒力测定 (15)第四节本实验的实验报告 (15)第一节基因操作概述一、聚合酶链式反应(PCR)PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA 的方法。
它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2)退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。
由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106倍。
（一）、PCR反应中的主要成份1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。
引物的好坏往往是PCR 成败的关键。
引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16～30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。
生物素-蛋白连接酶(BirA酶)的基因克隆、原核表达和活性鉴定
Strep Tag 系统是通过筛选噬菌体随机肽库而得到的短肽(含 9 个氨基酸残基)， 将其进行目标蛋白的 C 端融合可以模拟生物素和链霉抗生物素蛋白特异性相互作 用，使用亚胺生物素洗脱。这一系统不能进行 N 端融合，而且变性剂会影响亲和相 互作用。后来发展的 8 氨基酸 Strep tag Ⅱ标签，与 Strep Tag 相似，本身并不能生 物素化，但却可以模拟生物素的功能和链霉抗生物素蛋白变体 Strep-Tactin 特异性的 相互作用，可加在蛋白的 N 端和 C 端，使用便宜的脱硫生物素进行洗脱，而且 Strep tag Ⅱ和 Strep-Tactin 相互作用不受变性剂的影响，可在变性条件下纯化。
GenBank 中登录的大肠杆菌 K－12 MG1655 的 BirA 基因 DNA 序列： /nuccore/49175990?report=genbank&from=4171105&to=41 72070
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人单酰基甘油脂肪酶基因的克隆表达、纯化及活性研究
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人脂联素基因的原核表达_纯化及活性检测
ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄＪ，Ｓｅｐ２００７，Ｖｏｌ３５Ｎｏ９人脂联素（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）基因全长１７ｋｂ，位于染色体３ｑ２７，包含３个外显子和２个内含子。
该基因编码的脂联素蛋白在血浆中分子质量为２８ｋｕ。
脂联素在血循环中含量较高，其血浆浓度约占总血浆蛋白的０．０１％［１］。
目前，脂联素在调节血糖稳态、抗动脉粥样硬化及抗炎等方面的作用已有较为肯定的认识［２］。
脂联素在治疗领域的尝试也已开始，为了能够更好地了解脂联素的结构及作用机制，本研究利用Ｇａｔｅｗａｙ表达系统快速构建了人脂联素原核表达载体，表达并纯化了重组脂联素蛋白。
１材料与方法１．１材料大肠杆菌ＤＨ５α及ＢＬ２１（ＤＥ３）均为本实验室保存，质粒ｐＭＤ１８－Ｔ，ｒＴａｑＤＮＡ聚合酶，ＤＮＡ凝胶回收试剂盒为大连宝生物公司产品。
质粒ｐＤＯＮＲ２０１，ｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２以及Ｇａｔｅｗａｙ表达体系均为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品（澳大利亚新南威尔士大学齐建成教授馈赠）。
Ｍ－ＭＬＶ逆转录酶为ｐｒｏｍｅｇａ产品。
兔抗人脂联素多克隆抗体购自Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ公司；辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的羊抗兔ＩｇＧ为北京中杉公司产品。
蛋白纯化试剂盒以及１６４０培养基为Ｎｏｖｏｇｅｎ公司产品。
蛋白复性用ＮＤＳＢ２０１由美国Ｓａｎｔａｃｒｕｚ公司ＴｏｍｍｉｅＬｅｅＳｔａｒｌｉｎｇ先生馈赠。
异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ），二硫苏糖醇（ＤＴＴ）等均为进口或国产分析纯试剂。
１．２方法１．２．１人脂肪组织总ＲＮＡ的提取和脂联素基因的克隆新鲜皮下脂肪组织标本取自一行子宫瘤切除术且无代谢性疾病者，提取总ＲＮＡ。
将１μｇ总ＲＮＡ，７２℃变性２ｍｉｎ后迅速冰浴降温，加入１５μＬ逆转录酶混合液（２ＵＲｎａｓｅ抑制剂，摘要目的：在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。
方法：利用ＰＣＲ技术扩增人脂联素基因完全编码序列，选用Ｇａｔｅｗａｙ原核表达体系，经过ＢＰ反应、ＬＲ反应两步反应，将ＰＣＲ产物克隆入ｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２质粒，构建融合表达载体ｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ－ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），以异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达脂联素融合蛋白，经镍柱亲和层析纯化，ＮＤＳＢ２０１高效复性后，使重组蛋白作用于体外培养的肝细胞，ＲＴ－ＰＣＲ法检测重组脂联素对肝细胞葡萄糖－６－磷酸酶转录水平的影响。
人分泌磷蛋白2基因的克隆、原核表达与活性检测
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人 分 泌 磷 蛋 白 ２基 因 的 克 隆 、 核 表 达 与 活 性 检 测 原
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泳及 Ｗｅｔ ｎｂｏ 检测并证 实目的蛋 白的表达 ， ｓ ｒ ｌｔ ｅ 通过重组蛋白对木瓜 蛋白酶 的抑制作 用验证其 生物学活性。重组质 粒测序和酶切结果显示 Ｓ Ｐ 熟蛋 白基 因已成功克隆到 ｐ Ｔ２ ｂ ＋） Ｐ Ｇ诱导 重组 菌后有 ２ ｋ ａ大小的 目的 Ｐ ２成 Ｅ 一 （ 。ＩＴ ２ ５Ｄ 蛋 白表达。优化诱 导表达 条件 ， 获得 可溶性表 达的 目的蛋 白， 纯化后 纯度达 ９ ％ ， ｅｔ ｌ 表 明其 具有 Ｈ ｓ ０ ｗ ｓ ｒ ｂｏ ｅ ｎ ｔ ｉ 标签
人颗粒蛋白A的表达、优化及抗肿瘤活性研究
第34卷第6期高校化学工程学报No.6 V ol.34 2020 年12月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities Dec. 2020文章编号：1003-9015(2020)06-1444-08人颗粒蛋白A的表达、优化及抗肿瘤活性研究张雪健, 韩玉峰, 王繁业(青岛科技大学化工学院, 山东青岛 266042)摘要：为了探究人颗粒蛋白A(HGRNA)的抗肿瘤活性，克隆HGRNA并转入毕赤酵母发酵表达，蛋白用Ni2+构成的金属螯合亲和层析柱(MCAC)纯化。
根据培养毕赤酵母菌落的条件，利用响应面分析法优化并确定出毕赤酵母的最优发酵条件：通气量0.13 mL⋅min-1、豆粉质量分数1.6%、发酵温度24.5 ℃、发酵初始pH 6.6。
利用MTT法分析HGRNA的抗肿瘤作用，结果表明对人肾细胞293T无细胞毒性，对人结肠癌细胞SW480、人胰腺癌细胞SW1990、人非小细胞肺癌细胞A549有明显的抑制作用，IC50值分别约为89.7、106.2、100.8 μg⋅mL-1，且抑制效果呈剂量依赖型。
结果表明HGRNA具有作为新型抗癌药的潜力。
关键词：人颗粒蛋白A；克隆；纯化；响应面方法；发酵；抗肿瘤中图分类号：TQ464.7 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-9015.2020.06.015Expression, optimization and antitumor activity of human granulin AZHANG Xue-jian, HAN Yu-feng, WANG Fan-ye(School of Chemical Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, China)Abstract: In order to explore antitumor activity of human granulin A (HGRNA), GRNA was cloned and transferred to Pichia pastoris for fermentation expression, and the peptide was purified by metal chelate affinity chromatography column (MCAC) composed Ni2+. According to the conditions of Pichia pastoris colony, the optimal fermentation conditions of Pichia pastoris were optimized and determined by response surface analysis: aeration rate 0.13 mL⋅min-1, soybean powder 1.6%, fermentation temperature 24.5 ℃ and pH 6.6. The antitumor activity of HGRNA was analyzed by MTT. The results show that it has no cytotoxicity to human kidney cells 293T, and has significant inhibitory effects on human colon cancer cell SW480, human pancreatic cancer cell SW1990 and human non-small cell lung cancer cell A549. The IC50 value was 89.7, 106.2 and 100.8 μg⋅mL-1, respectively, and the inhibitory effect was dose-dependent. These results indicate that HGRNA are promising as novel anticancer drugs.Key words: HGRNA; clone; purification; fractional factorial design; fermentation; antitumor1前言颗粒蛋白(GRN)，也称为上皮蛋白，通过颗粒体蛋白前体(pGRN)产生，分子量在6 kD左右，由多种功能富含半胱氨酸的多肽家族组成。
异质性胞核核糖核蛋白A2基因的克隆、表达、纯化及其临床应用
异质性胞核核糖核蛋白A2基因的克隆、表达、纯化及其临床应用
杨玲;于孟学;尹宏恩;林嘉友;高杨;何夏秀 【期刊名称】《中华微生物学和免疫学杂志》 【年(卷),期】2002(022)002 【摘 要】目的构建含异质性胞核核糖核蛋白A2 (hnRNP A2) cDNA片段的基因克隆,制备并纯化重组蛋白hnRNP A2,用以检测抗hnRNP A2/RA33的抗体.方法从人外周血单个核细胞提取细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增hnRNP A2 cDNA,将其克隆于pUC-T1质粒中,测定其序列.构建高效表达载体pET28a-hnRNP A2,转化大肠杆菌BL21(DE3)plys S并进行诱导表达,将含目的蛋白的组分经金属螯合树脂亲和层析柱进行蛋白纯化.以该纯化蛋白为包被抗原,ELISA方法检测类风湿关节炎(RA) 97例、系统性红斑狼疮(SLE)50例、混合性结缔组织病(MCTD)8例、其他关节炎29例、其他弥漫性结缔组织病(CTD)99例.结果构建hnRNP A2重组表达载体并在大肠杆菌中获得hnRNP A2高效表达;在RA、SLE、MCTD、其他关节炎、其他CTD患者中抗hnRNP A2/RA33抗体阳性率分别为36.8%、24%、75%、3.75%、10.10%;在RA中特异性为86.67%.结论以纯化的基因重组蛋白hnRNP A2为抗原检测hnRNP A2/RA33抗体是早期诊断RA的可靠方法.
【总页数】4页(P156-159) 【作 者】杨玲;于孟学;尹宏恩;林嘉友;高杨;何夏秀 【作者单位】中国医学科学院北京协和医院风湿科;中国医学科学院北京协和医院风湿科;中国医学科学院北京协和医院风湿科;中国医学科学院基础医学研究所免疫室;中国医学科学院基础医学研究所免疫室;北京佑安门中医院
【正文语种】中 文 【中图分类】R593 【相关文献】 1.异质性胞核核糖核蛋白与肺癌发生发展的关系2.痰液异质性核核糖核蛋白A2/B1与端粒酶逆转录酶检测在肺癌诊断中的探讨3.异质性胞核核糖核蛋白A2/B1(hnRNP A2/B1)基因克隆及其在滑膜组织中的表达4.异质性胞核核糖核蛋白K与肿瘤研究的最新进展5.异质性胞核核糖核蛋白K在肝癌组织及不同密度肝癌细胞中的表达
核酸与蛋白质的研究方法
RNA基本操作技术
在DNA水平上分离真核生物的靶基因难度大： 基因组DNA庞大；大量重复序列；有内含子。 而分离mRNAcDNA目的基因工作简单， 速度快。 但是，RNA分子：敏感，稳定性差，某些基因 的mRNA具有时相和转录的特殊性。
美、英批准使用第一例基因工程药物——胰岛素，Sanger等人完成 了入噬菌体48,502bp全序列测定。
1983 1984 1986 1988 1989 1992
1994 1996 1997 2000 2001
获得第一例转基因植物。
斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。
GMO首次在环境中释放。
Watson出任“人类基因组计划”首席科学家。
（3）分子克隆的载体
仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA 连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基 因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复 制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行 繁殖。
具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆 的载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等小 分子量复制子都可以作为基因导入的载体。
转基因植物包含一个或者更多由人工手段引入的基因。甚至不 相关物种的基因也可以通过这样的方式被传递给其它物种。这 样一来，某种期望的特性，如对除草剂的忍耐力或者对昆虫的 抵抗力就可以被准确地赋予农作物。
（1）限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定 碱基序列并从这个位点切开DNA分子。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性 质，相同数量的双链DNA几乎具有等量 的净电荷，因此它们能以同样的速度向 正电极方向迁移。
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为 0.2~50kb之间。
聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到 1000个碱基对之间。
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人胰 腺核 糖核 酸酶的基 因克 隆 、 白表达 与活性测 定 蛋
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７ ２．
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现 代肿 瘤 医 学
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１ ３・ ２６
胞还有优越之 处在 于其对人 体正 常细胞 和组 织无 毒性 ， 而
Ｌ Ｋ细 胞 对 正 常细 胞 有 一定 的细 胞 毒性 。 Ａ
瘤 作 用 机 制 的 研 究 ． 西 医科 大 学 学 报 ，０ １ １ （ ） ３３— 广 ２０ ，８ ３ ：ｌ
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