植物抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的测定
茶鲜叶多酚氧化酶的活性测定解析
实验一茶鲜叶多酚氧化酶的活性测定（3学时）一、目的要求1、通过实验，掌握茶叶多酚氧化酶活性的测定方法。
2、理解酶活性测定常规方法及一般原理。
二、基本原理茶叶多酚氧化酶是茶树体内最重要的酶类之一，它不仅在茶树生理代谢过程中起着重要作用，而且在茶叶加工，尤其在红茶制造过程中，催化多酚类物质的氧化也起着主导作用。
多酚氧化酶的活性检测方法，包括检压法、分光光度法、氧电极法和滴定法等。
多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH 条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在460nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。
反应式如下：多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）+ 1 / 2 02 --------------------- > 邻醌 + H20三、仪器及试剂1、材料：茶树鲜叶。
2、仪器：72 1 型分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。
3、试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）; 0.1M磷酸缓冲液（pH6.5）;硫酸铵；1% 邻苯二酚溶液；0.1%脯氨酸溶液；6M 尿素溶液或20%三氯醋酸。
四、操作步骤1、粗酶液的制备：称取洗尽茶树鲜叶5.0g于研钵（或匀浆机）中，加入2g不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1M pH6.5 磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。
将所得沉淀溶于2~3ml 0.1M pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。
2、活性酶的测定：取酶液1ml于离心管中，加入3ml反应混合液（2.0ml 0.1M pH6.5 磷酸缓冲液，0.6ml 1%邻苯二酚溶液；0.4ml 0.1%脯氨酸溶液），在37C恒温水浴中保温10min,立即加入6M尿素溶液3ml或20%三氯醋酸1ml终止反应。
多酚氧化酶活性的测定-紫外分光光度法
多酚氧化酶活性的测定-紫外分光光度法1 范围本非标方法规定了番茄酱、土豆、香蕉等易褐变食品中多酚氧化酶紫外测定方法。
本非标方法适用于番茄酱、土豆、香蕉等易褐变食品中多酚氧化酶活性的测定。
2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。
用紫外分光光度法在408nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力，反应式如下：多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2→邻醌＋ H2O4 试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯。
水为 GB/T 6682 规定的二级水或去离子水。
4.1 磷酸盐缓冲液[PH7.0]：0.2mol/LNaH2PO4：0.2mol/LNa2HPO4=39：61；0.2mol/L的NaH2PO4：准确称取NaH2PO4·2H2O 3.12g加重蒸水至100ml溶解；0.2mol/L的 Na2HPO4：准确称取Na2HPO4·12H2O 7.16g加重蒸水至100ml溶解。
4.2 邻苯二酚溶液[c=0.04mol/L]:准确称取0.44g邻苯二酚加重蒸水至100ml溶解。
5 仪器5.1 紫外分光光度计。
5.2 高速冷冻离心机，50ml离心管。
5.3 分析天平：感量0.0001g。
5.4 超声波清洗仪（可调温）。
6 试样的制备和保存6.1 试样的制备：ppo粗酶提取液番茄酱：取适量样品搅拌均匀，称取2g样品放入离心管里，加入10mL（固液比为20%）磷酸盐缓冲液（pH7.0），涡旋直至固液混合均匀。
土豆：新鲜土豆先用自来水、再用蒸馏水洗净，擦干，削去1cm厚果皮后，切块，放入打浆机中打成匀浆状，称取5g样品放入离心管中，加入8.23mL（固液比为60.6%）磷酸盐缓冲液（pH7.0），涡旋直至固液混合均匀。
过氧化物酶活性的测定
植物生理学实验报告实验题目：过氧化物酶活性的测定姓名班级学号一、实验原理和目的原理：过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。
在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化生成醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其它分子缩合，生成茶褐色物质，该化合物在470nm处有最大的吸收值，可用分光度计测量生成物的含量。
目的：学习测定植物组织中过氧化物酶活性的方法。
二、实验器具和步骤材料：女贞树叶器具：分光光度计、离心机、秒表、天平、研钵、磁力搅拌器试剂：0.1mo1/L过氧化氢；，0.1mo1/L磷酸缓冲液pH7.0；0.3%愈创木酚反应液：100 mmo1／L磷酸缓冲液（pH 7．0）100 ml于烧杯中，加入愈创木酚0.3ml ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解。
步骤：1．称取植物材料约0.2g，加入，0.1mo1/L磷酸缓冲液(pH7.0) 6ml(分次加入[2ml,2ml,2ml],最后用于洗研钵)，在研钵中研磨成匀浆，过滤或以8000r／min 离心15min，上清液为酶的提取液。
0.1mo1/L过氧化氢，最后加酶液200ul （视酶活性大小而定，如酶浓度高可稀释后再测定），摇匀，立即在分光光度计470nm下测吸光度，从加入酶液时立即开启秒表记录时间，1min读数一次（也可2min，视材料而定）。
3．以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活力单位。
过氧化物酶活性(U)=△A470 ×三、实验数据和作业过氧化物酶活性(U)=△A470 ×=(0.133-0.124)*20/（0.2*2*0.01）=45四、数据分析△A470的值太小可能是由于叶片放置过久导致过氧化物酶活性丧失。
五、思考题1）过氧化物酶在植物体内的主要作用是什么？答：它与光合作用、呼吸作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。
一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。
这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。
植物组织内过氧化物酶(POD)活性的测定
实验七植物组织内过氧化物酶(POD)活性的测定
一、实验目的
掌握植物组织内过氧化物酶活性测定的原理和方法。
二、实验原理
过氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器官中。
在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶可以使愈创木酚氧化，产生茶褐色物质，在470nm处有最大吸收峰，可根据单位时间内A470的变化值，计算POD活性大小。
三、实验材料与设备
1．实验设备与仪器
电子天平、冰冻高速离心机、可见光分光光度计、电动玻璃匀浆剂等。
2．实验材料与试剂
20mM KH2PO4，
100mM PBS：取0.2M Na2HPO4，87.7ml与0.2MNaH2PO4，12.3ml混合。
反应液：取100mM PBS 50ml，加入愈创木酚28μl，搅拌溶解，待溶液冷却后加入30%的H2O219μl，混合均匀保存于冰箱中备用。
四、实验步骤
1．酶液制备
取1.0g植物叶片剪碎，置入玻璃匀浆杯中，加入预冷的20mM KH2PO45ml进行冰浴研磨提取。
匀浆液低温离心8500rpm 15min，上清液为酶粗提液，定容到50ml供测定。
2．酶活性测定
取光程为1cm的玻璃比色杯2只，一只加入反应液3ml，20mMKH2PO41ml作为调零管。
另一只加入反应液3ml，提取的酶液1ml，立即开始计时，在470nm波长处进行比色，开始记录数据，然后每隔一分钟记录一次吸光度值，共测3min。
3．计算
以每分钟A470的化变值0.01为一个相对酶活单位，计算植物组织内过氧化物酶酶活力的大小（单位：U/g鲜重）。
不同单株大叶女贞对冬季低温的生理响应
不同单株大叶女贞对冬季低温的生理响应近年来，由于全球气候多变，极端天气频发，温带气候区的木本植物在自然周年生长过程中经常遭受环境低温胁迫的威胁［1-2］，甚至出现因冷害导致植物死亡的现象。
低温伤害每年都给全世界农林生产造成巨大损失。
研究表明，植物受低温冷害时，体内的细胞膜透性、渗透调节系统及代谢过程等一系列生理过程都会发生显著的变化［4- 5］。
5种酢浆草属植物经过自然低温处理，结合形态特征观测，测定相对电导率、丙二醛含量、可溶性蛋白含量等指标，评价其抗寒性，结果表明在自然低温处理下，5种植物的生理生化指标变化趋势基本一致，与自然低温处理下的观测结果一致。
王娜等研究八角金盘、夹竹桃、阔叶十大功劳、樟叶槭4种常绿植物的抗寒性表明，在低温下植物体的可溶性糖含量、游离脯氨酸含量、过氧化物酶活性和相对电导率整体呈上升趋势。
也有研究表明，低温可以诱导黄瓜幼苗叶片中苯丙氨酸解氨酶的基因表达。
叶片中相对电解质渗漏率和丙二醛含量显著升高，提高了胞内抗氧化酶（过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶）活性，可有效地清除活性氧分子，维持抗氧化物质抗坏血酸（AsA）氧化还原状态，缓解低温引起的光损伤和氧化损伤。
大叶女贞（Ligustrun lucidum）别称蜡树，又名女贞、高杆女贞、冬青等，为木樨科女贞属常绿阔叶乔木，原产亚热带地区。
中国栽培以长江以南及西南地区为主，甘肃南部与华北南部少有栽培;其叶片光洁亮绿，经冬不落，是南方园林绿化中的主要树种之一。
随着中国北方城市园林绿化的发展，大叶女贞已引种到北京、上海、青岛等地。
然而我国绝大部分北方地区冬季寒冷，大叶女贞常表现较严重的冻害，影响其观赏价值和经济价值。
选育出适合北方发展优良抗寒品种，安全越冬已成为推广大叶女贞在北方地区生产栽培发展中的重要制约因素。
本试验通过对青岛农业大学校园内栽植的大叶女贞冬季受冻情况进行全面调查并分级，初选出部分优良抗寒单株。
而表型选择通常会受到环境因子的影响，为确定初选的耐寒植株、正常植株及受冻严重的植株之间在生理水平上是否有差异，笔者通过不同抗寒性植株枝条水分含量以及防御性酶活性的变化，进一步在生理水平上对筛选出的耐寒植株进行评定，以期为培育大叶女贞优良抗寒品系提供科学依据。
实验五过氧化物酶酶活性的测定
三、实验材料
菠菜、油菜、树叶、草、
四、仪器用品与试剂
分光光度计，研钵，移液管，吸管 愈创木酚，30％过氧化氢，磷酸缓冲液
五、实验步骤
1、称取植物材料 0.5g ，剪碎，放入研钵中，加入 1 ml 磷酸缓冲液 （ 0.05mol/L）研磨成匀浆，以 12000 rpm 离心 15 min ，上清液即为粗 酶液。 对照管 测定管 试剂 0.01mol/L磷酸缓冲液，ml 0.02mol/L 愈创木酚，ml
此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重 要作用也正在受到重视。
二、实验原理
RH2+ H2O2→2H2O + R 在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能 使邻甲氧基苯酚（愈创木酚）氧化，生成茶 褐色物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收， 可用分光光度计测量 470 nm 处的吸光度变 化速率来测定过氧化物酶活性。
植物组织中过氧化物Biblioteka 活性的测定——愈创木酚比色法
一、实验目的
熟悉测定过氧化物酶活性的常用方法及其测 定原理。
过氧化物酶（POD)
过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活 性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及 生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过 程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中 活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过 氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转 化成木质素，增加木质化程度。
酶液，ml
0 2.92 0.05 0
1 2.9 0.05 0.02
2 2.9 0.05 0.02
3 2.9 0.05 0.02
加好反应物，摇匀，立即加新配制的H2O2 (0.01 ml)，即刻摇 匀并计时，每隔 30s 读数1次，共计6个数值。
某农业大学《植物生理学》考试试卷(1213)
某农业大学《植物生理学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（10分，每题5分）1. 蛋白质的可逆磷酸化是生物体内一种普遍的翻译后修饰方式。
（）[扬州大学2019研]答案：正确解析：蛋白质磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸）上的过程，或者在信号作用下结合GTP，是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。
蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的机制。
2. 高等植物如果较长时间进行无氧呼吸，由于底物的过度消耗，能量供应不足，加上有毒物质的积累，因而对植物是不利的。
（）[扬州大学2019研]答案：正确解析：高等植物如果较长时间进行无氧呼吸，产生的能量不足且可能会造成酒精中毒。
2、名词解释（55分，每题5分）1. 临界日长答案：临界日长是指昼夜周期中，引起长日植物成花的最短日照长度或引起短日植物成花的最长日照长度。
解析：空2. 长日植物[沈阳农业大学2019研]答案：长日照植物是指在一定的发育时期内，每天的光照时间只有大于某一时数（临界日长），并经过一定的天数才能开花的植物。
例如大麦、小麦、菠菜、向日葵等。
这类植物生长在小于临界日长的光照下，就会保持营养生长状态。
用人工方法延长光照时间，可提早开花。
解析：空3. enzymelinked receptor答案：enzymelinked receptor的中文名称是酶联受体，是指与酶连接的细胞表面受体，又称催化性受体，目前已知的酶联受体都是跨膜蛋白，当胞外信号（配体）与受体结合即激活受体胞内段的酶活性。
其类型主要包括：①受体酪氨酸激酶；②受体酪氨酸磷酸酯酶；③受体丝氨酸苏氨酸激酶；④酪氨酸蛋白激酶偶联的受体；⑤受体鸟苷酸环化酶。
植物体内过氧化物酶活性的测定
三、实验步骤
1. 提取酶液： 叶片2片（w gFW）+pH7.0磷酸缓冲液5mL 研磨，离心（4000rpm*10min），上清液 即为粗酶液。
植物体内过氧化物酶活性的测定
2、配制反应液
1mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0） 50ml +28uL愈创木酚+19uLH2O2(30%)
活力单位(U) 酶活力= w(g FW)
W=W总（g FW)* V(mL)过氧化物酶 过氧化物酶[perox idase, POD] 广泛存
在于各种动物、植物和微生物体内。催 化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化 反应:
RH2+ H2O2→2H2O + R
植物体内过氧化物酶活性的测定
•2 POD 分子结构特点
POD 是一种由单一肽链与卟啉构成的血 红素蛋白, 脱辅基蛋白分子须与血红素结 合才构成全酶。
植物体内过氧化物酶活性的测定
3、POD的主要生理功能
参与活性氧代谢过程； 参与木质素和木栓质的合成； 参与生长素的降解。
注：除了与植物正常代谢和生长发育相关的 结构型POD 外, 很大部分POD的合成属于诱导 表达型。
植物体内过氧化物酶活性的测定
二、实验材料与试剂
实验材料： 不同浓度Cd处理7d的菱叶片； 试剂 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0） 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0） 愈创木酚； H2O2。
一般临用前配制，冰箱内短期保存。
植物体内过氧化物酶活性的测定
2、酶反应
3mL反应液+0.2mL粗酶液，震荡混匀后 立刻记时，以3mL反应液+ 0.2mL磷酸缓 冲液调零，测OD470，30’’内读第一次数， 之后每10S读数一次，至OD值>1.000。
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植物抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的测定
作者:《果蔬贮藏加工学实
验指导》
来源:华南农大 浏览数:2949 录入:2007-6-16 14:53:40
植物抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的测定
一、原理
抗坏血酸氧化酶能利用空气中的氧氧化抗坏血酸成为脱氢抗坏血酸； 多酚
氧化酶可催化
空气中的氧氧化多酚，成为相应的醌，形成的醌能被抗坏血酸还原。
因此， 在酶提取液中加入抗坏血酸，可测定抗坏血酸氧化酶的活性，加入
抗坏血酸及焦
儿茶酚， 可测定抗坏血酸及多酚氧化酶两者的活性，相减即可求出多酚氧化酶
的活性。抗坏
血酸的消耗量， 可用碘液滴定剩余的抗坏血酸。碘酸钾在酸性条件下与碘化钾
反应放出碘，
放出的碘与抗坏血酸作用，将之氧化成脱氢抗坏血酸，多余的碘能使淀粉变为蓝
色。
二、材料与设备
材料：马铃薯块茎
设备：水浴锅、台秤、离心机
试剂：pH6.0 1/15mol/L磷酸缓冲液、0.1％抗坏血酸、0.02mol/L焦儿茶酚、
10％三氯乙
酸、1％淀粉。
0.05mol/L碘液： 碘化钾2.5g溶于200ml蒸馏水， 加冰醋酸1ml， 再加
0.1mol/L碘酸钾
12.5ml，定容至250ml。
三、试验步骤
（一） 酶液制备：
称取马铃薯块茎10.0g， 用预冷pH6.0 1/15mol/L磷酸缓冲液，研磨匀浆，
定容至50ml，
在18-20℃水浴浸提30分钟，中间摇动数次，再于3000×g离心10分钟，取上
清液，4℃保存备
用。
（二） 酶活性测定：
１. 取6个三角瓶(50-100ml)，标上号码，分别加入下列试剂(ml)：
┌──┬────┬───────┬─────────┬──┬────
─┐
│瓶号│ 蒸馏水 │0.1％抗坏血酸 │0.02mol/L焦儿茶酚 │ 酶 │煮5分
钟酶 │
├──┼────┼───────┼─────────┼──┼────
─┤
│ 1 │ 4 │ 2 │ │ 2 │
│
│ 1' │ 4 │ 2 │ │ 2 │
│
│ 2 │ 4 │ 2 │ │ │ 2
│
│ 3 │ 3 │ 2 │ 1 │ 2 │
│
│ 3' │ 3 │ 2 │ 1 │ 2 │
│
│ 4 │ 3 │ 2 │ 1 │ │ 2
│
└──┴────┴───────┴─────────┴──┴────
─┘
1、3瓶各作一次重复，2、4瓶作空白
将6个三角瓶放入18-20℃水浴反应5分钟,立即分别加入10％三氯乙酸
1ml，摇匀，终止酶
反应。
２. 滴定
冷却后， 分别加入3滴1％淀粉（马铃薯可不加，因其本身含的淀粉已足
够），用碘液滴
定至蓝色。
３. 计算
A. 抗坏血酸氧化酶活性＝[2号瓶滴定毫升数－1号瓶滴定毫升数]×Ｋ
B. 多酚氧化酶活性＝[(4号瓶滴定毫升数－3号瓶滴定毫升数)×Ｋ]－A
酶提取液总量(ml)×0.44
Ｋ＝ ---------------------------------------------
测定时酶液用量(ml)×样品重(g)×测定时间(min)
0.44为每毫升0.005mol/L碘液氧化抗坏血酸的毫克数， 两种酶的活性单
位均用每克干重
每分钟氧化抗坏血酸的毫克数来表示。