蛋白A高效亲和膜色谱法测定人血浆中免疫球蛋白G的含量(精)
蛋白A高效亲和膜色谱法测定人血浆中免疫球蛋白G的含量(精)
蛋白A 高效亲和膜色谱法测定人血浆中免疫球蛋白G 的含量周冬梅邹汉法**杨利贾凌云张玉奎(中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心大连116011提要研究了蛋白A 高效亲和膜色谱对水溶液及人血浆中人免疫球蛋白G (HIgG 的特异性吸附和定量测定。
方法具有较高的精确度和较好的重复性:HIg G 标样5次重复进样的相对标准偏差为1. 5%, 人血浆样品3次重复进样的相对标准偏差为3. 6%; 所测得的定量标定曲线的线性相关系数达到0. 9993; 不含己二胺间隔臂的亲和介质的非特异性吸附极低, 基本检测不出来。
快速实验中, 一次分析可在0.5min 内完成。
实验表明, 利用所建立的方法对人血浆中的HIgG 进行定量测定可以得到较为满意的结果。
关键词高效亲和膜色谱法, 蛋白A , 人免疫球蛋白G 分类号O 658/Q 511前言人免疫球蛋白G (HI gG 是一种活性生物大分子, 是人血浆中的主要成分之一, 通常采用免疫学的方法来对它进行测定。
蛋白A (Pr ot ein A 是金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白, 分子量为42000。
在蛋白A 与免疫球蛋白G 分子的F c 区之间具有很强的特异性的亲和作用, 因而固载蛋白A 的亲和介质可用于分离、纯化和分析各种免疫球蛋白G [1～4]。
我们曾采用灌流亲和色谱分析分离单克隆抗体[5, 6]。
本文采用含己二胺间隔臂和不含己二胺间隔臂两种方法合成出了以甲基丙烯酸缩水甘油酯复合纤维素膜为基质的亲和膜及以蛋白A 为配基的亲和介质, 研制出可与高效液相色谱仪配套使用的高效亲和膜色谱柱[7], 建立了一种对人血浆中的HIg G 进行定量测定的方法, 并对两种介质进行了比较; 同时对HIg G 的快速分析进行了一定的尝试。
所建立的测定方法具有简便、快速、可靠等优点, 分析一次只需5min, 快速分析只需0. 5min , 而且血浆样品不需预处理, 这是通常的免疫学方法所无法比拟的。
高效液相色谱仪检测静注人免疫球蛋白(pH4)蛋白质含量的方法[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910904696.3(22)申请日 2019.09.24(71)申请人 华兰生物工程重庆有限公司地址 408000 重庆市涪陵区鹤凤大道66号申请人 华兰基因工程有限公司 华兰生物工程股份有限公司(72)发明人 杨柳 张穹 刘利 郭心怡 袁显棚 张宝献 周康森 李娅 (74)专利代理机构 重庆中之信知识产权代理事务所(普通合伙) 50213代理人 刘强(51)Int.Cl.G01N 30/88(2006.01)G01N 30/16(2006.01)G01N 30/74(2006.01)G01N 30/38(2006.01)(54)发明名称高效液相色谱仪检测静注人免疫球蛋白(pH4)蛋白质含量的方法(57)摘要本发明公布了一种高效液相色谱仪检测静注人免疫球蛋白(pH4)蛋白质含量的方法，采用凝胶色谱柱，以紫外吸收检测器在280nm波长处检测，采用磷酸盐缓冲液为流动相，该流动相的流速为0.6ml/min且进样量为20μl；按以下公式计算出静注人免疫球蛋白(pH4)所有组分峰面积与乙酰色氨酸峰面积之比：C x ＝(f X /f R )C R ，f X ＝A X /A S ，f R ＝A R /A S ；上式中，C x 为待测样品蛋白质含量；f X 为待测样品与内标物质峰面积比；f R 为对照品与内标物质峰面积比；C R 为待对照品蛋白质含量；A X 为待测样品所有组分峰面积；A R 为对照品所有组分峰面积，A S 为对内标物质峰面积。
其检测精度好，效率高。
权利要求书1页 说明书3页CN 110632229 A 2019.12.31C N 110632229A1.一种高效液相色谱仪检测静注人免疫球蛋白(pH4)蛋白质含量的方法，其特征在于：采用凝胶色谱柱，以紫外吸收检测器在280nm波长处检测，采用磷酸盐缓冲液为流动相，该流动相的流速为0.6ml/min且进样量为20μl；按以下公式计算出静注人免疫球蛋白(pH4)所有组分峰面积与内标物质乙酰色氨酸峰面积之比：C x ＝(f X /f R )C R ，f X ＝A X /A S ，f R ＝A R /A S ；上式中C x 为待测样品蛋白质含量；f X 为待测样品与内标物质峰面积比；f R 为对照品与内标物质峰面积比；C R 为对照品蛋白质含量；A X 为待测样品所有组分峰面积；A R 为对照品所有组分峰面积；A S 为内标物质峰面积。
人免疫球蛋白G含量检测方法的研究进展
人免疫球蛋白G含量检测方法的研究进展李虎;臧恒昌;张惠【摘要】人免疫球蛋白G(IgG)是人体的主要抗体,合适的含量检测方法对多种疾病的临床诊断及其制剂的质量控制均有重大意义.本文就目前常用的IgG检测方法进行了综述,并就其发展趋势进行了探讨.【期刊名称】《药学研究》【年(卷),期】2012(031)009【总页数】3页(P536-538)【关键词】人免疫球蛋白G;含量检测;免疫学【作者】李虎;臧恒昌;张惠【作者单位】山东大学药学院,山东,济南,250012;山东泰邦生物制品有限公司,山东,泰安,271000;山东大学药学院,山东,济南,250012;国家糖工程技术研究中心,山东,济南,250012;山东大学药学院,山东,济南,250012;国家糖工程技术研究中心,山东,济南,250012【正文语种】中文【中图分类】R927.2免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)是人体含量最多的免疫球蛋白，占总血清免疫球蛋白的70% ～80%左右，相对分子质量为150 kD，是再次抗体应答中所产生的主要免疫球蛋白。
成人血清中IgG含量约为7.0～16.6 g·L－1，人血清中的IgG主要为单体，包括四个亚类，其中IgG1占60% ～70%，IgG2占15～20%，IgG3占5% ～10%，IgG4占1～7%，不同亚类其重链的抗原性不同。
IgG是机体抗感染免疫的主力抗体，其在体液中含量的高低往往作为慢性感染、慢性肝病、免疫性疾病等疾病的参考值，因此测定人体血清中IgG含量可对许多疾病的早期诊断提供依据。
通过分离纯化健康人血浆可得到较纯的IgG制剂，如静注人免疫球蛋白等。
静注人免疫球蛋白在临床上用于治疗多种免疫球蛋白缺乏症和自身免疫性疾病，如X联锁低免疫球蛋白血症、川崎病、特发性血小板减少性紫癜等［1］，准确测定静注人免疫球蛋白中IgG的含量对其质量控制具有重要意义。
目前测定IgG含量的方法有多种，按照其基本原理的不同可大体分为:免疫学方法、色谱分析法、生物传感器技术及共振散射法。
人免疫球蛋白G(IgG) ELISA检测方法及步骤
人免疫球蛋白G(IgG) ELISA检测方法及步骤人(Human) 免疫球蛋白G (IgG) ELISA检测试剂盒本试剂仅供研究使用标本：血清或血浆试验原理：IgG试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA).已知IgG浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。
先将IgG和生物素标记的抗体同时温育。
洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。
再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。
产生颜色。
颜色的深浅和样品中IgG的浓度呈比例关系。
试剂盒内容及其配制试剂盒成份(2-8℃保存)96孔配置48孔配置配制96/48人份酶标板1块板(96T)半块板(48T)即用型塑料膜板盖1块半块即用型标准品：80g/L1瓶(0.6ml)1瓶(0.3ml)按说明书进行稀稀空白对照1瓶(1.0ml)1瓶(0.5ml)即用型标准品稀释缓冲液1瓶(5ml)1瓶(2.5ml)即用型生物素标记的抗IgG抗体1瓶(6ml)1瓶(3.0ml)即用型亲和链酶素-HRP1瓶(10ml)1瓶(5.0ml)即用型洗涤缓冲液1瓶(20ml)1瓶(10ml)按说明书进行稀释底物A1瓶(6.0ml)1瓶(3.0ml)即用型底物B1瓶(6.0ml)1瓶(3.0ml)即用型终止液1瓶(6.0ml)1瓶(3.0ml)即用型标本稀释液1瓶(12ml)1瓶(6.0ml)即用型自备材料1．蒸馏水。
2．加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3．振荡器及磁力搅拌器等。
安全性1．避免直接接触终止液和底物A、B。
一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
2．实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3．不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
操作注意事项1．试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。
稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
2．实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
3．不用的其它试剂应包装好或盖好。
Western-blotting 技术鉴定人血清免疫球蛋白lgG分子实验报告
Western-blotting 技术鉴定人血清免疫球蛋白lgG摘要：本实验利用Western-blotting 技术鉴定人血清免疫球蛋白lgG，主要包括利用SDS-PAGE进行蛋白质分离之后，将其转移至NC膜上进行蛋白免疫印迹并进行检测，实验中我们用了正常人血清蛋白，肺炎患者，白血病人患者三种血清，使用彩虹Marker，并用其作出标准曲线，以此求出其余IgG的分子质量，并根据不同样本条带颜色，面积等简要判断不同样本LgG含量的多少并给予解释。
关键词：免疫印迹技术；免疫球蛋白；SDS-PAGE引言：蛋白质免疫印迹技术,是1979年斯坦福大学乔治.斯塔克发明的蛋白质印迹法,继southern-blotting 之后起名 Western-blotting,是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究,抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面，是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术，其分析容量大，敏感度高，特异性强，是检测蛋白质性质、表达与分布的一种最常用的方法。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使其去折叠。
聚丙稀酰胺是由丙稀酰胺和N,N’-亚甲基双丙稀酰胺经共聚合而成。
此聚合过程是由四甲基乙二胺和过硫酸胺激发的。
被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。
人血清中含有人类免疫球蛋白，根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异性的不同，分为五类: lgG、lgA、lgM、lgD、lgE、lgG 是血清的主要抗体成分，占血清免疫球蛋白总量的70%~75%。
在电泳之后，利用抗原抗体结合的特异性，进行蛋白免疫印迹。
1.目的与要求a)掌握SDS-PAGE电源分离蛋白的实验技术和操作；并绘制蛋白质标准曲线,求目的蛋白分子量的方法；b)垂直板电泳装置的安装及灌胶；电泳所用试剂的配制；c)了解电泳过程中常见问题的原因及处理办法，不连续电泳系统分离蛋白质的原理以及垂直板电泳装置的安装和灌胶。
高效亲和色谱法测定牛初乳加钙咀嚼片中免疫球蛋白IgG的含量
高效亲和色谱法测定牛初乳加钙咀嚼片中免疫球蛋白IgG的含量邢俊波;曹红;陈玉敏;水彩红;单婷婷;胡丹;姜春来;靳守东【摘要】目的:建立高效亲和色谱法(HPAC)测定牛初乳加钙咀嚼片中免疫球蛋白IgG含量的方法.方法:采用HI-Trap Protein G HP亲和色谱柱(1 mL)色谱柱,以0.05 mol/L磷酸盐缓冲液和0.05 mol/L的甘氨酸-盐酸缓冲液为流动相,流速0.4 mL·min-,检测波长280 nm,柱温30 ℃.结果:IgG含量在0.1502 ～0.7512mg/mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系(r =0.999 9);平均回收率为98.5％,RSD为1.2％(n=6).结论:方法简便、快速,重现性好.可作为牛初乳加钙咀嚼片的质量控制方法.【期刊名称】《中国野生植物资源》【年(卷),期】2014(033)005【总页数】3页(P23-25)【关键词】牛初乳加钙咀嚼片;免疫球蛋白IgG;高效亲和色谱【作者】邢俊波;曹红;陈玉敏;水彩红;单婷婷;胡丹;姜春来;靳守东【作者单位】中国人民解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所,北京100071;中国人民解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所,北京100071;中国人民解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所,北京100071;中国人民解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所,北京100071;中国人民解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所,北京100071;中国人民解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所,北京100071;中国人民解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所,北京100071;中国人民解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所,北京100071【正文语种】中文【中图分类】TS252.1免疫球蛋白在人体特异性免疫及抗感染过程中起着重要作用，其抗感染能力与其在血清中的含量有直接关系。
各种免疫球蛋白中IgG含量最高，约占血清总免疫球蛋白的75%～80%。
蛋白A高效亲和膜色谱法测定人血浆中免疫球蛋白G的含量
标样 次重复进样的相对标准偏差为 人血浆样品
次重复进样的相对标准偏差为 所测得的定量标定曲线的线性相关系数达到
不含己二胺间隔臂
的亲和介质的非特异性吸附极低 基本检测不出来∀快速实验中 一次分析可在 内完成∀实验表明 利用
所建立的方法对人血浆中的
进行定量测定可以得到较为满意的结果∀
关键词 高效亲和膜色谱法 蛋白 人免疫球蛋白
Ù
标准曲线的制作
按上述方法在不含间隔臂的膜亲和柱上进行标
准曲线的测定∀将所得的
标准样的峰面积 Σ
对进样量 进行线性拟合 所得的定量标定曲线
见图 它的线性方程为 Σ ≅
≅
ρ
∀
表 方法的重复性
Ταβλε Ρ ε ροδυχιβιλιτψ οφ τηε ετηοδ
样 品 进样量
峰面积 Λ≅
第 卷第 期 年月
色
谱
蛋白 Α 高效亲和膜色谱法测定 人血浆中免疫球蛋白 Γ 的含量Ξ
周冬梅 邹汉法 杨 利 贾凌云 张玉奎
中国科学院大连化学物理研究所 国家色谱研究分析中心 大连
提 要 研究了蛋白 高效亲和膜色谱对水溶液及人血浆中人免疫球蛋白
的特异性吸附和定量测
定∀ 方法具有较高的精确度和较好的重复性
具有简便 快速 可靠等优点 分析一次只需
快速分析只需
而且血浆样品不需预处理
这是通常的免疫学方法所无法比拟的∀
膜色谱柱为
≅
流动相为
Ù 磷酸缓冲液含
Ù
上样液 和 Ù 甘氨酸盐酸缓冲液
洗脱液 检测波长
灵敏度
∀ 上样
后 先用上样液冲洗
再改用洗脱液冲洗 ∀
高效亲和色谱法测定2种中药成分与人血清白蛋白的结合率
2011年4月Vo.l 29No .4April 2011Chi n ese Journal of Chromatography358~361研究论文DOI :10.3724/SP .J .1123.2011.00358*通讯联系人:张秀莉,副研究员,主要研究天然小分子和多肽的分离分析.Te :l (0411)84379521,E m ai:l zhangx i uli @dicp .ac .cn .基金项目:重大新药创制专项(N o .2009ZX 09313 003)和国家自然科学基金面上项目(No .30801513).收稿日期:2010 12 08高效亲和色谱法测定2种中药成分与人血清白蛋白的结合率蔡晓明1, 张 岩2, 于 龙1, 郭志谋1, 张秀莉1*, 梁鑫淼1(1.中国科学院大连化学物理研究所,中国科学院分离分析重点实验室,辽宁大连116023;2.Un ivers ity of C alifon ia Irvi ne ,CA 92697 4625,USA )摘要:采用高效亲和色谱技术(HPAC )对中药成分与人血清白蛋白(HSA )的相互作用进行了研究。
首先采用点击化学的方法制备了表面键合有HSA 蛋白的硅胶固定相并装填成亲和色谱柱,根据药物在该色谱柱上与空白硅胶柱上的保留时间差计算得到药物与蛋白的结合率。
利用该方法测得模型化合物华法令与H SA 的结合率与文献中采用超滤法测得的结果基本一致,表明该方法可用于测定药物与HSA 的结合率。
在此基础上用该方法测定了葛根素和告依春两种中药成分与HSA 的相对结合率分别为10 26%和10 20%。
同时用超滤的方法测定了葛根素与H SA 的结合率为14 25%。
结果表明,HPAC 可以作为研究药物与蛋白相互作用的一种简便可行的方法,其测定结果与超滤方法一致。
关键词:高效亲和色谱法;人血清白蛋白;葛根素;告依春;结合率;超滤中图分类号:O 658 文献标识码:A 文章编号:1000 8713(2011)04 0358 04Detection of drug hu m an seru m albu m in b ind i ng ratios of t woCh i nese m edici nal ingred ients by h igh perfor m anceaffinity chro matographyCAI Xiao m i n g 1,Z HANG Yan 2,YU Long 1,GUO Zhi m ou 1,ZHANG X iuli 1*,LI ANG X in m iao1(1.CAS K ey L abora tory of Sepa ra tion Sc ien ce for An a ly tica l Che m istry ,D a lian In stitu te o fChe m ica l Phy sics,Chin ese Acade m y o f Scie n ces,Da lian 116023,Ch i n a;2.Un iver sity o f Ca lifon ia Ir vin e,CA 92697 4625,U SA )A bstract :The i n teraction of t wo Chinese m edici n al i n gredi e nts and hum an seru m al b u m in (HSA )has been investigat ed by high perf or m ance affi n it y chro m atography (HPAC ).HSA bounded silica based stati o nary phase w as prepared based on t he click chem istry strategy ,and packed in a colu m n (nam ed as HSA col u m n).The drug HSA binding rati o was calculated fro m t he diff erence of t he drug s ret enti o n ti m es on the H SA colu m n and silica col u m n (blank col u m n).T he warfari n HSA bindi n g rati o det er m ined by t his m ethod was s i m ilar to t he refer ence reported value by ultrafiltration m et hod .The results i n dicat ed that the new HSA colu m n and t he HPAC m et hod can be used for t he detection of binding ratio of drug and HSA .T he bi n di n g ratios of puerari n and goitri n deter m i n ed by the HPAC m ethod were 10 26%and 10 20%,respecti v e l y .And the binding rati o of puerarin deter m i n ed by ultrafiltrati o n was 14 25%.A ll t hese results showed t hat HPAC is a usef ul m et hod t o i n vestigate the interacti o n bet ween drugs and protein .K ey words :high perf or m ance affinity chro m atography (HPAC);hu m an seru m albu m i n ;puer ari n ;goitrin ;binding ratio ;ultrafiltration 人血清白蛋白(hu m an seru m albu m in ,HSA)是由585个氨基酸残基组成的一条单肽链,相对分子质量约为66500,是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白[1]。
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蛋白A 高效亲和膜色谱法测定人血浆中免疫球蛋白G 的含量周冬梅邹汉法**杨利贾凌云张玉奎(中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心大连116011提要研究了蛋白A 高效亲和膜色谱对水溶液及人血浆中人免疫球蛋白G (HIgG 的特异性吸附和定量测定。
方法具有较高的精确度和较好的重复性:HIg G 标样5次重复进样的相对标准偏差为1. 5%, 人血浆样品3次重复进样的相对标准偏差为3. 6%; 所测得的定量标定曲线的线性相关系数达到0. 9993; 不含己二胺间隔臂的亲和介质的非特异性吸附极低, 基本检测不出来。
快速实验中, 一次分析可在0.5min 内完成。
实验表明, 利用所建立的方法对人血浆中的HIgG 进行定量测定可以得到较为满意的结果。
关键词高效亲和膜色谱法, 蛋白A , 人免疫球蛋白G 分类号O 658/Q 511前言人免疫球蛋白G (HI gG 是一种活性生物大分子, 是人血浆中的主要成分之一, 通常采用免疫学的方法来对它进行测定。
蛋白A (Pr ot ein A 是金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白, 分子量为42000。
在蛋白A 与免疫球蛋白G 分子的F c 区之间具有很强的特异性的亲和作用, 因而固载蛋白A 的亲和介质可用于分离、纯化和分析各种免疫球蛋白G [1～4]。
我们曾采用灌流亲和色谱分析分离单克隆抗体[5, 6]。
本文采用含己二胺间隔臂和不含己二胺间隔臂两种方法合成出了以甲基丙烯酸缩水甘油酯复合纤维素膜为基质的亲和膜及以蛋白A 为配基的亲和介质, 研制出可与高效液相色谱仪配套使用的高效亲和膜色谱柱[7], 建立了一种对人血浆中的HIg G 进行定量测定的方法, 并对两种介质进行了比较; 同时对HIg G 的快速分析进行了一定的尝试。
所建立的测定方法具有简便、快速、可靠等优点, 分析一次只需5min, 快速分析只需0. 5min , 而且血浆样品不需预处理, 这是通常的免疫学方法所无法比拟的。
2实验部分2. 1仪器和试剂Wa ters 510高压液相色谱泵2台, SP 200紫外检测器1台, W DL -97色谱工作站(国家色谱研究分析中心。
蛋白A 样品由美国CU N O 公司惠赠, HIgG 标样购自军事医学科学院, 人血浆购自大连妇产医院。
其它化学试剂均为分析纯。
2. 2色谱条件膜色谱柱为20mm ×4mm i. d. ; 流动相为50mmo l /L 磷酸缓冲液含0. 15mol /L N aCl (pH 7. 0 (上样液和0. 2mo l/L 甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2. 3 (洗脱液 ; 检测波长280nm, 灵敏度0. 5A ufs 。
上样后, 先用上样液冲洗3min, 再改用洗脱液冲洗2min 。
2. 3实验方法非特异性吸附的测量:准确称量牛血清白蛋白(BSA 冻干标准品, 用上样液配制成5g/L 的溶液, 准确吸取20 L 进样, 通过色谱工作站采集谱图。
标准曲线制作:于实验前准确称量HIgG 冻干标准品, 用上样液配制成1. 25, 2. 50, 5. 00, 10. 00g /L 的标样溶液, 准确吸取每种溶液各20 L 进样, 通过色谱工作站采集谱图并对谱图积分得出峰面积。
以峰面积对进样量作线性拟合, 得出定量标定曲线。
重复性的考察:将HI gG 标样溶液连续5次重复进样20 L , 将稀释10倍的血浆样品连续3次进样, 考察峰面积的重复性。
血浆样品测定:血浆样品不需特别的预处理, 于实验前将冷冻保存的血浆样品于37℃的水浴中解冻, 再用上样液将其稀释10倍。
准确吸取20 L 进样, 通过色谱工作站采集谱图, 在标准曲线的线性范围内用峰面积外标法定量。
3结果与讨论3. 1两种亲和介质的非特异性吸附的比较两种亲和介质分别为含己二胺间隔臂和不含己第16卷第3期色谱V o l. 16N o. 3本课题获国家自然科学基金资助**::二胺间隔臂的高效亲和膜介质, 它们的非特异性吸附的谱图如图1所示。
由图1可见, 含间隔臂的亲和介质对BSA 有一定的非特异性吸附, 经色谱工作站积分可得, 当BSA 上样量为100 g 时, 含间隔臂的亲和柱对BSA 的非特异性吸附约为2 g ; 而不含间隔臂的亲和柱对BSA 非特异性吸附很低, 基本检测不出来。
我们所用的基质材料是甲基丙烯酸缩水甘油酯复合纤维素膜, 本身也具有一定的疏水性, 但由实验的结果可见, 其疏水作用是较低的; 而所用的间隔臂己二胺是亲和色谱介质合成中较为常用的间隔臂, 通常可以显著提高亲和色谱介质对目标物质的亲和容量; 但它同时也是一种疏水色谱的配基, 分子中含有6个碳原子的碳链, 分子中的氮原子与配体间又具有一定的非特异性的电荷作用, 因而含有间隔臂己二胺的介质的非特异性吸附较大。
图1含间隔臂(a 及不含间隔臂(b 的亲和膜分析柱对牛血清白蛋白的非特异性吸附Fig . 1Non -specific adsorption of BS A with arm of hexyldiamine (a and without the arm (b 1. 牛血清白蛋白上样谱图, 2. 空白谱图, 3. 前两个谱图相减所得的谱图。
流速:1. 0mL/min 。
1. chromatogram of BSA,2. ch romatogram of eluen t,3. ch romatogram of (1 -(2 .flow rate :1. 0mL /min .3. 2标准曲线的制作按上述方法在不含间隔臂的膜亲和柱上进行标准曲线的测定。
将所得的HIg G 标准样的峰面积(S 对进样量(W 进行线性拟合, 所得的定量标定曲线见图2, 它的线性方程为S =4. 9×105+2. 5×104W , r =0. 9993。
图2HIgG 的定量标定曲线Fig . 2Calibration curve of HIgG3. 3重复性的考察同一根高效膜亲和色谱柱上HI gG 标样和血浆的重复性数据见表1。
由表1可见, 它们重复进样的表1方法的重复性Table 1Reproducibility of the method 样品Sample 进样量Added 峰面积Area ( V ・s ×10-6 RS D (% HIg G 66 g 2. 148, 2. 078, 2. 0982. 124, 2. 1541. 5人血浆Human plas ma2 L0. 8346, 0. 9058, 0. 86743. 63. 4人血浆中HIgG 的定量测定HIg G 标样溶液和稀释10倍的人血浆上样后所得的谱图见图3-a 、图3-b, 其中第1个峰为样品中不与蛋白A 发生特异性作用的部分, 第2个峰是样品中活性HI gG 组分。
由血浆上样谱图中HIgG 谱峰的峰面积和定量标准曲线可得所取血浆样品中活性HIg G 的含量为7. 9g /L 。
由于冲洗液对紫外吸收的影响, 使得所做的定量标准曲线没有过零点; 若采用单点定量, 待测物的峰面积与标准品的峰面积必须相近才可以, 所以最好是采用标准曲线定量。
3. 5人血浆中HIgG 的快速测定将流速提高到3. 0mL /min 并相应改变冲洗梯度, 可使1次分析的时间缩短到0. 5m in , 使得在线・196・色谱16卷HIgG 标样和稀释10倍的人血浆样品所得的谱图。
利用所做的快速定量标准曲线, 可以进行快速的定量。
图3以蛋白A 为配基的亲和膜分析柱上HIgG (a , c及稀释10倍的人血浆(b , d 样品的分离谱图Fig . 3Chromatograms of HIgG (a , c anddiluted human plas ma (b , d 峰(Peak :1. 不纯物(impurity , 2. HIgG 。
流速(flow rate :a, b. 1. 0mL/min; c, d. 3. 0mL/m in 。
4结论亲和膜色谱法具有特异性高、速度快等优点, 多应用于复杂的生物活性大分子的纯化分离, 在分析中的应用尚少。
本文建立的蛋白A 高效亲和膜色谱法可以方便快速的定量测定组成复杂的人血浆样品中的HIg G , 重复性好, 准确度高, 并且血浆样品不需特殊的处理, 是一种较为实用的方法。
利用蛋白A 高效亲和膜色谱法还可以对其它各种免疫球蛋白G 及各种单克隆、多克隆抗体进行定量测定。
同时还可在膜基质上固载抗原抗体等其它的配基, 并对相应的活性生物大分子进行定量测定。
理论上任何一种活性生物大分子物质均可通过亲和色谱法得到分离, 因而这种定量测定的方法具有广阔的发展前景。
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