基于高效液相色谱特征指纹图谱的黄芪_枸杞复合多糖的质量控制_肖凌云

［基金项目］国家自然科学基金面上项目（编号：８１２７４０４８）；中央 高 校 基 本 科 研 业 务 费 专 项 资 金 资 助 （编 号：２０１２３０６０２０２０５）；中 国 博 士 后 科 学 基金资助项目（编号：２０１４Ｍ５５２０８６） ［作者 简 介］肖 凌 云，女，博 士 研 究 生，研 究 方 向：生 物 活 性 多 糖 方 面 研 究，电 话：０２０－３９３５３６３１，Ｅ－ｍａｉｌ： ｘｉａｏｌｉｎｇｙｕｎ１２＠１２６．ｃｏｍ ［通讯作者］李海峰，男，博士后，研究方向：多糖结构和活性研究，电话：０２０－３９３５３６３１，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｈｆ＠ｗｈｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
公司研发中心，广东 广州 ５１０６６５）
［摘要］ 目的：多糖类产品的质量控制对产品的功效至关重要，本文探讨了黄芪－枸杞复合多糖 ＨＰＬＣ特征指纹图谱的构建。方 法 ：首 先 对 复 合 多 糖 的 降 解 方 法 进 行 了 比 较 ，然 后 对 三 氟 醋 酸 （ＴＦＡ）降 解 法 进 行 了 条 件 优 化 ，在 此 基 础 上 对 １０ 批 黄 芪 －枸 杞 复 合 多糖样品进行了比较分析。结果：ＴＦＡ 降解法可以获得较多的黄芪－枸杞复 合 多 糖 特 征 峰，而 且 当 ＴＦＡ 浓 度 为０．５ ｍｏｌ·Ｌ－１、温 度为１００ ℃、时间为４ ｈ及存在２００ｒ·ｍｉｎ－１搅拌时，黄芪－枸杞复合多糖降解组分的色谱特征显著，降解和衍生产物的稳定性以及 方法的重现性均达到中药指纹图谱标准。１０批复合 多 糖 样 品 的 指 纹 图 谱 均 具 有 较 强 的 特 征 性，整 体 相 似 度 大 于０．９。结 论：所 建 立 的 “降 解－ＰＭＰ 柱 前 衍 生 化 －ＨＰＬＣ 检 测 ”法 快 速 简 单 、灵 敏 度 高 、稳 定 可 靠 ，可 用 于 复 合 多 糖 产 品 的 质 量 控 制 。 ［关 键 词 ］ 复 合 多 糖 ；质 量 控 制 ；指 纹 图 谱 ；多 糖 降 解 ；高 效 液 相 色 谱 ［中 图 分 类 号 ］Ｒ９４３ ［文 献 标 识 码 ］Ａ ［文 章 编 号 ］１００１－５２１３（２０１４）２１－１７９５－０５ ＤＯＩ：１０．１３２８６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｈｉｎｈｏｓｐｐｈａｒｍａｃｙｊ．２０１４．２１．０３
· １７９６ ·
中国医院药学杂志２０１４年１１月第３４卷第２１期 Ｃｈｉｎ Ｈｏｓｐ Ｐｈａｒｍ Ｊ，Ｎｏｖ ２０１ 分，也 是 中 药 发 挥 药 效作用的重要物 质 基 础。 大 量 研 究 表 明，中 药 多 糖 具有多种生物学活性［１－３］，比如黄芪多糖不仅 能 够 抑 制多聚谷氨酰胺的 体 内 聚 集 及 神 经 毒 性，还 能 延 长 相应秀丽线虫模型 的 寿 命，具 有 良 好 的 神 经 保 护 和 抗 衰 老 活 性 ［４］；枸 杞 作 为 我 国 传 统 的 补 益 类 中 药 ，其 多糖具 有 增 强 免 疫、神 经 保 护 和 抗 氧 化 等 药 理 作 用 。 ［５］ 中药多糖在 生 物 医 药、保 健 品 和 化 妆 品 等 行 业具有巨大的开发 潜 力，因 此 加 强 多 糖 活 性 研 究 和 改良多糖 产 品 是 推 动 多 糖 产 业 深 入 发 展 的 重 要 措 施。其中，复合多糖 是 近 年 来 多 糖 研 发 和 生 产 领 域 出现的一种新动向，这 类 复 合 形 式 有 望 提 高 多 糖 产
２ 方 法 ２．１ 复合多糖样品 制 备 黄 芪 与 枸 杞 药 材 以 质 量 比３∶２混合，按照质 量 体 积 比 １∶１０ 加 入 水 并 煮 沸 ２ ｈ，双层纱布过滤 后，取 药 材 再 按 照 质 量 体 积 比 １∶８ 加水继续煮沸１ ｈ，合 并 ２ 次 滤 液，减 压 浓 缩 后 加 入 ４ 倍 体 积 的 ９５％ 乙 醇 沉 淀 ，过 滤 后 干 燥 即 为 黄 芪 －枸 杞复合多糖。称取１ ｇ 复 合 多 糖 粉 末，加 入 １００ ｍｌ 水在６０ ℃ 水 浴 中 充 分 搅 拌 溶 解，离 心 （５ ０００ ｒ· ｍｉｎ－１，５ ｍｉｎ）取 上 清 即 为 １０ ｍｇ·ｍｌ－１多 糖 溶 液 。 ２．２ 多糖降解方法探索 取１０ ｍｇ·ｍｌ－１多糖 溶 液 ７ ｍｌ，分别 采 用 以 下 化 学、物 理 以 及 生 物 等 不 同 方 法进行降解，同时以 未 降 解 多 糖 作 为 降 解 效 果 的 参
ＨＰＬＣ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ－Ｌｙｃｉｕｍ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ
ＸＩＡＯ Ｌｉｎｇ－ｙｕｎ １，ＬＩ Ｈａｉ－ｆｅｎｇ ２，ＬＩ Ｊｉａｏ １，ＬＩＵ Ｙｏｎｇ－ｍｅｉ １，ＨＵ Ｍｉｎｇ－ｈｕａ２，ＭＡ Ｆａｎｇ－ｌｉ ２ （１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒ－
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＨＰＬＣ ｗｉｔｈ ａｎ ａｔｔｅｍｐｔ ｆｏｒ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．ＭＥＴＨＯＤＳ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ－Ｌｙｃｉｕｍ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｗｅｒｅ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ａｎｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｐｒｉｏｒ ｔｏ ｆｉｎｇｅｒ－ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ＨＰＬＣ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ＴＦＡ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｆｕｒｔｈｅｒ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＴＦＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｔｉｍｅ ａｎｄ ａｇｉｔａｔｉｏｎ．Ｆｉｎａｌｌｙ，１０ ｂａｔｃｈｅｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ－Ｌｙｃｉｕｍ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｇｒａｄｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＴＦＡ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ ｗｉｔｈ ＨＰＬＣ．ＲＥＳＵＬＴＳ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｗｅａｋ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ （ＴＦＡ）ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｆｏｒ ｉｔｓ ｓｉｍｐｌｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｅｆ－ ｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ．Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｐｅａｋｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｗｅｒｅ ｅｖｉ－ ｄｅｎｔｌｙ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ ｆｒｏｍ１０ ｂａｔｃｈｅｓ ｏｆ ｃｏｍ－ ｐｌｅｘ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅ ≥０．９．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｈｅｒｅ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ， ｒａｐｉｄ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｆｏｒ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ－Ｌｙｃｉｕｍ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｕｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ；ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ；ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ；ＨＰＬＣ
［收 稿 日 期 ］２０１３－１２－２０
基 于 高 效 液 相 色 谱 特 征 指 纹 图 谱 的 黄 芪 －枸 杞 复 合 多 糖 的 质 量 控 制
肖凌云１，李海峰２，李姣１，刘永梅１，胡明华２，马方励２ （１．武汉大 学 药 学 院，湖 北 武 汉 ４３００７２；２．无 限 极（中 国）有 限
中国医院药学杂志２０１４年１１月第３４卷第２１期 Ｃｈｉｎ Ｈｏｓｐ Ｐｈａｒｍ Ｊ，Ｎｏｖ ２０１４，Ｖｏｌ ３４，Ｎｏ．２１
· １７９５ ·
［９］ Ｅｎｇ ＨＳ， Ｍｏｈａｒｍｅｄ Ｚ，Ｃａｌｎｅ Ｒ，ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ＣＹＰ３Ａ ｇｅｎｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｏｎ ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ ｄｏｓｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｒｅｎａｌ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ，２００６，６９（１０）： １８５８－１８６４．
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕｂｅｉ Ｗｕｈａｎ ４３００７２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｉｎｆｉｎｉｔｕｓ （Ｃｈｉｎａ） Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６６５，Ｃｈｉｎａ）
［１０］Ｈｅｓｓｅｌｉｎｋ ＤＡ，ｖａｎ Ｓｃｈａｉｋ ＲＨ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｉｄｅｎ ＩＰ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅ－ ｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＹＰ３Ａ４，ＣＹＰ３Ａ５，ａｎｄ ＭＤＲ－１ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｃｙｃｌｏｓ－ ｐｏｒｉｎｅ ａｎｄ ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ，２００３，７４（３）： ２４５－２５４．
［１２］Ｃｈｕ ＸＭ，Ｈａｏ ＨＰ，Ｗａｎｇ ＧＪ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ＣＹＰ３Ａ５ ｇｅ－ ｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｎ ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｅｌｉｍｉｎａ－
ｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｒｅｎａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ，２００６，２７（１１）：１５０４－１５０８． ［１３］Ｈｕ ＹＦ，Ｑｉｕ Ｗ，Ｌｉｕ ＺＱ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒ－ ｐｈｉｓｍｓ ｏｆ ＣＹＰ３Ａ４，ＣＹＰ３Ａ５ ａｎｄ ＭＤＲ１ ｏｎ ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ ｐｈａｒ－ ｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｆｔｅｒ ｒｅｎａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａ－ ｃｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００６，３３（１１）：１０９３－１０９８． ［１４］Ｑｉｕ Ｆ，Ｈｅ ＸＪ，Ｓｕｎ ＹＸ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ＡＢＣＢ１，ＣＹＰ３Ａ４ ＊１８Ｂ ａｎｄ ＣＹＰ３Ａ５ ＊ ３ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｏｎ ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｉｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ［Ｊ］． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１１，６３（３）：８１５－８２５． ［１５］ Ｗａｎｇ ＹＹ，Ｚｈａｎｇ Ｍ，Ｌｕ ＦＭ，ｅｔ ａｌ．ＣＹＰ３Ａ４ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙ－ ｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｐｒｅｄｉｃｔ ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ Ｃｈｉ－ ｎｅｓｅ ｒｅｎａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ Ｊ（Ｅｎｇｌ），２０１２， １２５（２３）：４２３３－４２３８．