固定化酵母细胞 方法
酵母细胞的固定化课件课件
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1. （2009.江苏）下列关于固定化酶和固定化细胞的 叙述，正确的是（ ）A A. 固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明 显
B. 固定化酶的应降解水体中有机磷农药，需提供适宜的 营养条件
刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间， 以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格， 可以使用下列方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在 实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液 体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上 用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制 备的凝胶珠是成功的。
直至完全溶化，用蒸馏水定容至10ml。
②注意事项 加热时要用( 小火)，或者(
，直到海藻酸钠溶化为止
间断加)热，反复几次
海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸 钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝 胶珠所包埋的酵母细胞的数目少。
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4.海藻酸钠溶液和酵母细胞混合
一种酶只能催化一 种化学反应，而在 生产实践中，很多 产物的形成都通过 一系列的酶促反应 才能得到
固定化细 胞
成本v 低
v
操作更容易,对酶 固定后的细胞与反
活性影响小、可
应物不容易接近， 可能导致反映效果
以使酶再利用。 下降等
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固定化细胞技术
1.固定化酶和固定化细胞技术是利用物理或化学方法将 酶或细胞固定在一定的空间内的技术，包括____包___埋_、法 __化__学__结__合__法______ 、_____物__理__吸__附__法__三种方法。
酵母细胞的固定化及其酒精发酵试验
酵母细胞的固定化及其酒精发酵试验一、实验目的1.掌握微生物细胞的固定化方法；2.学习用固定化酵母进行酒精发酵；3.进一步理解淀粉质原料酒精发酵的原理和一般工艺过程。
二、实验原理（一）酵母菌酒精发酵在无氧条件下，酵母菌利用葡萄糖或淀粉水解糖发酵产生乙醇和CO2的作用，称为酒精发酵，总反应式为：C6H12O6→2C2H5OH+2CO2酒精发酵是生产酒精及各种酒类的基础。
本实验采用固定化酵母发酵，通过测定发酵过程中的酵母细胞数、生成的CO2量以及最终产物酒精的量，可以判断固定化酵母的发酵能力。
（二）细胞固定化技术固定化细胞就是被限制自由的细胞。
即采用物理或化学的方法将细胞固定在载体上或限度在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并能反复或连续使用。
微生物细胞的固定化方法有：（1）吸附法，（2）包埋法，（3）不用载体法。
本实验采用凝胶包埋的固定化方法，把酵母细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，再滴加入CaCl2溶液，形成海藻酸钙凝胶小球，细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。
三、实验器材（一）淀粉的液化与糖化（双酶法）1. 酵母菌细胞：酒精活性干酵母。
2. 2.5%海藻酸钠溶液40mL，2 % CaCl2溶液100mL。
3.培养基：①增殖培养基：浓度为130BX麦芽汁，以6N硫酸调节pH值至4.1~4.5。
（每组100mL 装于250mL三角瓶，1kg/cm2，灭菌30min后备用）②发酵培养基：淀粉水解液，具体制备见实验步骤。
4. 培养箱、显微镜、蒸馏装置及其他常规实验仪器四、实验方法①调浆:以1﹕3~3.5的比例，将玉米粉（或玉米淀粉）用60℃左右的温水调成粉浆500mL;②液化：加α-淀粉酶（用量约为10u/g淀粉）；加热至85~90℃，保持30~60 min，加热煮沸10 min，补充水分。
③糖化：将上述液化醪冷至60~62℃，加入糖化酶，用量为80~100u/g淀粉，维持30 min后分装于500mL三角瓶，每瓶装糖化醪250mL。
高中生物酵母细胞的固定化 (3)
↓ 冲洗：将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗 2～3 次
↓ 发酵：将 150 mL 质量分数为 10%的葡萄糖溶液转移至 200 mL 的锥形瓶中，加入固定好的酵母细胞，25 ℃下发酵 24 h
3．用包埋法固定化细胞是将微生物细胞均匀地包埋于 不溶于水的多孔性载体 中，常用的包埋载体有
明胶 、 琼脂糖 、 海藻酸钠 、 醋酸纤维素 和 聚丙烯酰胺 等。 4．固定化酶的应用实例——高果糖浆的生产 固定化酶技术已经应用于高果糖浆的生产中，生产 高果糖浆所需要的酶是 葡萄糖异构酶 ，所使用的反 应柱上的孔应满足 酶颗粒 不能通过筛板上的小孔， 而 反应溶液却可以自由出入。
(3)影响实验成败的关键步骤是________________。 (4)海藻酸钠溶化过程的注意事项是______________。 (5)如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞 数目_____。如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形 ，说明 ______。 (6)该实验中CaCl2溶液的作用是__________。
解析 (1)酵母细胞在缺水的状态下休眠。活化是加入水使酵 母菌恢复到生活状态。酵母细胞活化后体积会增大。(2)固定 化酶常用化学结合法和物理吸附法固定化。(3)实验的关键是 配制海藻酸钠溶液，得到凝胶珠。(4)海藻酸钠溶化过程要小 火加热(小火间断加热)不断搅拌，使海藻酸钠完全溶化，又 不会焦糊。(5)海藻酸钠浓度过低，包埋的酵母菌就过少；海 藻酸钠浓度过高，不易与酵母菌混合均匀。(6)氯化钙能使海 藻酸钠形成聚沉。
反应物不易 与酶接近， 尤其是大分 子物质，反 应效率下降
酵母菌细胞的固定化技术
浓度太低：固定的酵母菌太少
第四步：将海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合
① 过程 将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵 母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中 ②注意事项 为什么要冷却至室温？
防止高温杀死酵母菌。恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加到配制好的 CaCl2溶液中，浸泡30min左右。 ②注意事项 为什么要浸泡30分钟？
③注意事项 溶解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防自来水中各种离 子影响实验结果
第三步：配制海藻酸钠溶液
① 过程 称取0.2g海藻酸钠，放入40ml蒸馏水，用酒精灯小火间 断加热至完全溶化。 ②注意事项 为什么要小火间断加热？
防止海藻酸钠焦糊。 为什么说该步骤是实验成败的关键步骤？
浓度太高：得不到规则的凝胶珠
酵母菌细胞的固定化技术
一、基本步骤：
酵母细胞的活化 配制CaCl2溶液 配制海藻酸钠溶液 将海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合 固定化酵母细胞
第一步：酵母细胞的活化
加水 活化
由于缺水，酵母处于 休眠状态
活化的干酵母
第二步：配制0.05mol/L的CaCl2
① 过程 称取无水CaCl2 0.83g，放入200ml的烧杯中，加入150ml 的蒸馏水，使其充分溶解，待用 ② 目的 使胶体聚沉
以便凝胶珠形成稳定的结构
球形或椭 球形，浅 黄色
二、用固定化酵母发酵
1.将固定好的酵母细胞（凝胶珠）用_蒸__馏__水__冲洗2~3次。
2.发酵时的温度就为__2_5_℃___，时间_2_4_h____（底物为葡 萄糖） 3.将凝胶珠加入用于发酵的葡萄糖溶液后会发现有_气__泡___ 产生，同时有_酒__精__味散发。
酵母细胞的固定化
酵母细胞的固定化一、固定化酶与固定化细胞及应用实例1、固定化酶（1）含义：将酶固定在不溶于水的载体上。
（2）实例：利用固定化酶技术生产“高果糖浆”。
（3）优点：酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。
（4）缺点：一种酶只能催化一种化学反应，而在实际生产中，很多产物的形成是通过一系列的酶促反应才能得到。
（5）应用实例：生产高果糖浆①原料：葡萄糖②原理：葡萄糖果糖③生产过程及示意图：a.反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本。
b.提高了果糖的产量和品质。
2、固定化细胞（1）含义：将细胞固定在一定空间内的技术。
（2）优点：成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收（3）缺点：固定后的细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降，由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制。
二、固定化酶或固定化细胞技术的常用方法1、固定化酶或固定化细胞：指利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。
2、方法：①物理吸附法 ：将酶（或细胞）吸附在载体表面上②包埋法：将酶（或细胞）包埋在细微网格里③化学结合法：将酶（或细胞）相互结合，或将其结合到载体上。
葡萄糖异构酶三、固定化酵母细胞的制备与发酵（一）制备固定化酵母细胞1、酵母细胞的活化：1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。
〖思考〗活化是指什么？在缺水状态下，微生物处于休眠状态。
活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。
2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液：0.83gCaCl2＋150mL蒸馏水→200mL烧杯→溶解备用3、配制海藻酸钠溶液0.7g海藻酸钠＋10mL水→50mL烧杯→酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化→蒸馏水定容到10mL。
注：加热时要用小火，或者间断加热，并搅拌，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中注：1、海藻酸钠溶液必须冷却至室温，搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。
例析酵母细胞的固定化技术
例 析 酵母 细 胞 的 固 定化 技 术
口 胡有 红
二 、制 备 固定 化 酵母 细 胞 的 步骤 求学生熟练掌握实验具体操作过程 ， 分析实验 及 注意 事项 注意事项 ， 还 要考查 实 验 的迁 移 ， 如 探究 固定 １ ． 酵母细胞的活化 ， 即让处于休 眠状态 化 酵母细胞 的强 度与海 藻酸 钠和Ｃ ａ Ｃ １ Ｓ ￣度 的 的微 生物重 新 恢复正 常 的生 活状 态 。 变化关系 、 固定化 酶 的酶活力 和海藻酸钠 的浓 酵母细胞活化时体积会变大，因此活化 度、 使用次数等的关系。下面将详细分析酵母 前应该选择体积足够大的容器 ，以避免酵母 细胞的固定化技 术的重难点及相关拓展 。 细胞 的活 化液溢 出容 器外 。 固定 化细胞 技 术 ２ ．配 置 物 质 的量 浓 度 为 ０ ． ０ ５ ｍｏ ｌ ／ Ｌ的 固定 化酶 和 固定 化细 胞技 术是 利用 物理 Ｃ ａ Ｃ １ ２ ￣液 。 或化 学方法 将 酶或细 胞 固定在 一定 空间 内 的 Ｃ ａ Ｃ １ ２ ￣液 作 用 ： 海藻 酸 钠溶 液 遇 到钙 离 技 术 ，包 括包埋 法 、化学 结合 法和 物理 吸附 子 ， 会 形 成凝胶 ， 从 而将酵母 细胞包埋 在凝 胶 法。 因为 酶分 子很小 容易从 包埋 材料 中漏 出 ， 中， 达到 固定化 效果 。 因此常采用化学结合法 和物理 吸附法 固定 ３ ．配制 海 藻酸钠溶 液 。 （ １ ）海 藻 酸钠 在水 中溶解 的速 度 较 慢 ， 化， 而细胞个大 ， 难 以被吸附或结合 ， 多采用 包埋 法 固定化 。 需 要 加热 促 进其 溶解 。 溶 解 海 藻酸 钠 最好 用 小 火 间断加 热 或 水浴 加 热 。如 果 加 热过 快 ， 例 １ 试 分析 下 图 ， 与 用海 藻酸 钠 海 藻 酸 钠会 发 生焦 糊 。 （ ２ ）海 藻酸 钠 的浓 度 作栽 体制备 的 固定化 酵母 细胞相 似 的是 涉及 到 固定化 细 胞 的质 量 ， 因为海 藻 酸 钠 的 （ ） 浓 度 可 以 改 变 凝 胶 珠 的 孔 径 ：如 果 浓 度 过 高， 形 成的凝胶珠 不成圆形或椭 圆形 ； 如果 浓度 过 低 ， 形 成 的凝 胶 珠所 包 埋 的 酵母 细胞 数 目少 ， 因为 海 藻 酸 钠 浓 度 低 ， 海 藻 酸 钠 凝 胶 结 构 中 的间 隙偏 大 ， 会 有 一部 分 细胞 从 间 Ａ． Ｂ． Ｃ 隙 中漏 出 ， 会 导 致 包 埋 的酵 母 细 胞 少 ， 影 响 实 验效 果 。 解 析 本 题 考 查 固定 化 细 胞 的方 ４ ． 海 藻酸钠 溶液 与酵母 细 胞混合 。 法， Ａ 选项是物理吸附法 ， Ｂ 选项是化学结合 将溶化好 的海藻酸钠溶液冷却至室温 ， 法， 以上两 种方 法 常用 于酶 的 固定化 。Ｃ 和Ｄ 加 入 已活化 的酵母 细胞 ， 温度 不 能太低 ， 因为 选项 是 包埋 法 ， ｃ 是 将 酶 包 埋 在 微 网格 里 ， Ｄ 海藻酸钠溶液容易凝固， 温度不能太高， 会杀 是包 埋 在凝 胶 中 ，所 以Ｄ 与用 海 藻 酸钠 作 载 死酵母细胞。然后要充分搅拌 ，使其混合均 体制 备 的 固定 化 酵母 细胞相 似 。 匀， 防止 出现气泡 而影 响实 验结 果 的观 察 。 最 答案 Ｄ 后转 移至注 射器 中 。
酵母细胞的固定化
一．解决酶应用中存在问题的方法是？
二．这种方法的优点是什么？ 三．什么是高果糖浆？使用它有何好处？
一、固定化 酶的应用实
例 四．生产高果糖浆需要什么酶？其作用是什么？
这种酶有何特点？
五．了解高果糖浆生产过程。
1、固定化酶技 术。即将酶固定 在一定空间内的 技术（如固定在 不溶于水的载体 上）。
使酶既能与反
酶或细胞
方法
原理
适用 对象
化学 酶蛋白的侧链基团和载休 结合 表面上的功能基团之间形 酶 法 成共价键而固定的方法
物理 吸附 法
通过氢键、疏水作用和π电 子亲和力等物理作用，将 酶固定于水不溶载体上。 从而制成固定化酶
酶
酶和细胞固定 方法的选择
原因
（1）方法
一．酶适合采用化学结合和物理吸 附法固定
1
概念：
利用物理或化学方法将细胞固 2
定在一定空间的技术。
2.将酶或细胞固定化的方法
1
将酶（或细胞）包 埋在细微网格里
3
将酶（或细胞）吸 附在载体表面上
5 化学结合法
2
将酶（或细胞）相 互连接起来
4 包埋法
6 吸附法
方法
包埋 法
原理
适用对象
将聚合物的单体 与酶溶液混合， 再借助于聚合助 进剂(包括交联剂) 的作用进行聚合， 酶被包埋在聚合 物中以达到固定 化
固定化细胞在 多种酶促反应 中连续发挥作 用
促化反应结束 后，能被吸收 和重复利用
细胞结构保证 了各种酶在细 胞内化学反应 中有效的发挥 作用
三、实验操作
制备固定化酵母细胞
制备过程包括哪几个步骤？ 你认为哪个步骤的操作是最重要的一环？
阅读P50~51思考下列问 题：
课题3 酵母细胞的固定化
课题3酵母细胞的固定化课题背景如今，酶已经大规模地应用于食品、化工、轻纺、医药等各个领域。
在应用酶的过程中，人们发现了一些实际问题：酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本：反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量。
于是，有人设想，将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时固定在载体上的酶还可以被反复利用。
现代的固定化酶技术已完全实现了这一设想。
高果糖浆的生产就是固定化酶技术成功地应用于工业生产的实例。
酶是由细胞合成的，于是，又有人设想，能否将合成酶的细胞直接固定？自世纪年代，在固定化酶技术的基础上，又发展出了细胞固定化技术。
与固定化酶技术相比，固定化细胞制备的成本更低操作更容易。
在本课题中，我们将动手制备固定化酵母细胞，体会固定化酶的作用。
一）固定化酶的应用实例我们以高果糖浆的生产为例来了解固定化酶技术在生产实践中的应用。
高果糖浆的生产需要使用葡萄糖异构酶，它能将葡萄糖转化成果糖。
这种酶的稳定性好，可以持续发挥作用。
但是，酶溶解于葡萄糖溶液后，就无法从糖浆中回收，造成很大的浪费。
使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内（图4-5），柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。
酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由出入。
生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。
反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。
目前，用固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆的规模已经超过了每年1000万吨。
❖DDDDDDDDDDD42%DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDB —幷布帝小孔的筛扳果樋1.11^4-5固定化酶的反应柱示盘團葡硼反应拄曲定化酚（二）固定化细胞技术固定化酶和固定化细胞技术是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、化学结合法（将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上）和物理吸附法（图4-6）。
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固定化酵母细胞方法
固定化酵母细胞是一种将酵母细胞固定在载体上的方法，以便在工业生产过程中持续地产生酵母发酵产物。
这种方法的应用广泛，包括啤酒酿造、酒精生产、酮症饮食等。
固定化酵母细胞的方法有很多种，其中常见的有凝胶固定化、包埋固定化和交联固定化等。
凝胶固定化是将酵母细胞悬浮在凝胶质地的载体上，固定化后的酵母细胞能够在凝胶中发酵产生所需的产物。
这种方法的优点是载体与酵母细胞之间有相对大的接触面积，便于营养物质的供给和废物的排出，并且能够较好地保护酵母细胞免受外界环境的影响。
然而，凝胶固定化的缺点是酵母细胞在固定化过程中会被限制在凝胶中生长，导致细胞增殖相对较慢。
包埋固定化是将酵母细胞包裹在聚合物材料中，形成固定化的“小包裹”，在这种包埋固定化的载体中，酵母细胞可以自由生长和繁殖，并发挥酵母的发酵功能。
这种方法的优点是酵母细胞可以保持较自由的生长状态，增加了细胞的活性和稳定性。
同时，包埋固定化的载体也可以利用其自身的特性来调控发酵过程。
然而，包埋固定化的方法在实际应用过程中需要考虑到包埋材料的选择和酵母细胞的适应性等因素。
交联固定化是利用交联剂将酵母细胞固定在载体上，使其形成一定的空间结构。
这种方法的优点是可以使用多种交联剂来调整载体的特性，如孔隙度、孔径大小等，从而控制酵母细胞在载体中的分布和发酵反应。
交联固定化的缺点是交联剂可能对酵母细胞产生毒性影响，需要合理选择和使用交联剂。
除了以上提到的方法，还有其他一些固定化酵母细胞的方法，如电化学固定化、微胶囊化等。
这些方法在实际应用中都有各自的优缺点，需要根据具体的应用需求来选择合适的固定化方法。
总的来说，固定化酵母细胞是一种利用载体将酵母细胞固定化的方法，具有增强酵母细胞活性、稳定性和生产效率等优点。
在工业生产和生物技术应用中有广泛的应用前景。