常用抗原类型及制备方法
elisa检测抗原的方法和原理(一)
elisa检测抗原的方法和原理(一)ELISA检测抗原的方法和原理引言ELISA（酶联免疫吸附测定法）是一种常用的生物化学实验技术，用于检测抗原或抗体的存在和浓度。
本文将以浅入深的方式介绍ELISA 检测抗原的方法和原理。
ELISA的基本原理ELISA基于酶底物反应的颜色变化来判断样品中抗原的存在与否。
该方法主要分为四个步骤：涂层、孵育、洗涤和检测。
1. 涂层步骤在实验板的微孔中涂覆特异性抗体，形成抗原与抗体之间的结合。
2. 孵育步骤将待测样本加入实验板的微孔中，让待测抗原与涂层中的抗体结合。
3. 洗涤步骤通过多次洗涤，去除未结合的物质，以减少假阳性的可能性。
4. 检测步骤在洗涤后，加入与抗原结合的酶标记抗体。
酶标记抗体会结合到待测抗原-抗体复合物上。
在酶底物的作用下，酶催化底物发生变化，产生颜色。
颜色的强度与抗原的浓度成正比。
ELISA的类型ELISA方法在实验设计上有多种不同的变体，根据不同的目的和要求，可以选择以下几种常见的ELISA类型：1. 直接ELISA直接ELISA是最简单的ELISA类型，用于检测已知抗原的存在与否。
在涂层步骤中，直接将抗原直接固定在微孔表面。
接下来的步骤与基本原理相同。
2. 间接ELISA间接ELISA常用于检测抗体的存在。
在涂层步骤中，将抗原固定在微孔表面。
然后，加入待检测样品中含有的抗体。
接下来的步骤与基本原理相同。
3. 间接竞争ELISA间接竞争ELISA是一种常用于测定激素、药物等物质浓度的ELISA类型。
在涂层步骤中，将抗原固定在微孔表面。
然后，加入标记有相同抗原的酶标记抗体和待检测样品。
待检测样品中的抗原与酶标记抗体竞争结合。
颜色的强度与抗原浓度成反比。
4. 免疫层析ELISA免疫层析ELISA常用于快速检测样品中的病原体。
与传统ELISA 不同的是，免疫层析ELISA中使用了带有检测抗体的固定相（如纸片）。
待测样品通过纸片时，特定抗原与检测抗体结合形成一条线。
抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理抗体是一种能够识别和结合特定抗原的蛋白质，广泛应用于医学诊断、治疗和研究领域。
抗体的制备方法包括动物免疫和体外选择性放大两种主要途径。
以下将详细介绍这两种方法及其原理。
一、动物免疫法制备抗体动物免疫法是制备多种特异性抗体的主要方法，常用的动物包括小鼠、兔子、大鼠等。
制备抗体的主要步骤如下：1.抗原选择：首先需要选择目标抗原，可以是蛋白质、多肽、糖蛋白、核酸等。
抗原应具有免疫原性，能在动物体内引起免疫反应。
2.免疫原免疫：将抗原与适当的佐剂混合后注射到动物体内，佐剂可以增强抗原的免疫原性，如完全弗氏佐剂、佐科克佐剂等。
注射的剂量和时间间隔需根据具体实验目的和动物种类进行优化。
3.收集血清和分离抗体：免疫一定时间后，收集动物的全血或血清，离心分离血清，其中包含了目标抗体。
4.抗体纯化：通常使用亲和层析、凝胶过滤层析等方法将血清或血浆中的抗体纯化出来。
亲和层析是最常用的抗体纯化方法，利用特定配体或抗原结合柱将目标抗体捕获，再洗脱得到纯抗体。
二、体外选择性放大法制备抗体体外选择性放大法是指通过技术手段进行人工放大和筛选特定抗体，主要包括以下步骤：1.生成抗体文库：将来自多个个体免疫系统的B细胞或血浆细胞收集起来，提取RNA或DNA，然后利用逆转录酶合成cDNA或文库，得到抗体基因的cDNA文库。
2.构建抗体显示系统：将抗体基因文库插入适当的表达载体中，如噬菌体、酵母、哺乳动物细胞表达系统等。
3.筛选特异性抗体：利用高通量筛选技术，如细胞表面展示、比对深度测序等，可通过抗原结合的特异性来筛选出具有高亲和力的抗原结合片段或全长抗体。
4.抗体表达和纯化：通过选择后的抗体基因进行表达，再经过蛋白纯化和检验等步骤，最终得到目标抗体。
抗体制备的原理主要是基于免疫系统的免疫应答机制。
当机体受到抗原的刺激后，机体会产生一系列免疫应答，其中包括B细胞的活化和分化。
经过抗原的结合和识别，B细胞会分泌具有高亲和力的抗体。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAb）是指由单一B细胞克隆分离得到的抗体，其具有高特异性和高亲和力。
制备单克隆抗体的方法主要有杂交瘤技术和重组DNA技术。
以下是单克隆抗体制备的步骤及注意事项。
步骤一：抗原免疫1.选择合适的抗原：根据需要检测的分子或细胞表面标志物，选择合适的抗原。
2.免疫动物：常用的动物有小鼠、兔子等。
选择适合的动物后，根据抗原的种类和免疫动物对该抗原的敏感性，设计免疫方案。
3.免疫计划：免疫计划包括免疫剂量、免疫途径和免疫次数等。
通常先进行原位免疫，然后再以单体或混合抗原进行体内免疫。
步骤二：细胞融合1.收集脾细胞：在最佳时期，解剖免疫动物，取出脾脏。
2.细胞培养：将收集的脾细胞在无菌条件下分散成单个细胞，并在培养基中培养，以供细胞融合使用。
3.准备骨髓瘤细胞：选择合适的骨髓瘤细胞，例如NS0或SP2/0等。
将其培养至对数生长期。
4.细胞融合：在抗原刺激下，将脾细胞与骨髓瘤细胞以一定比例混合，用聚乙烯醇或其他化合物促进细胞融合。
步骤三：细胞筛选与扩展1. HT增重培养：用含有hprt缺陷的培养基筛选融合细胞，以选择杂交瘤细胞。
2. Limited Dilution扩展：以一细胞一孔的方式将杂交瘤细胞进行有限稀释，使其实现单克隆化。
3.细胞培养：将单克隆细胞株移植到培养瓶中，进行培养和扩增。
步骤四：单克隆抗体鉴定1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：用ELISA方法筛选单克隆细胞株，检测其抗原特异性。
2.免疫组织化学检测：将单克隆抗体应用于细胞和组织切片，检测其在特定细胞或组织中的反应。
3.流式细胞术：通过流式细胞仪检测单克隆抗体与特定细胞表面标志物的结合情况。
步骤五：单克隆抗体生产与纯化1.细胞培养：将单克隆细胞株培养扩增至一定程度。
2.抗体收集：将培养上清液进行抗体收集。
3.纯化与浓缩：利用亲和层析、离子交换、凝胶过滤等技术，对抗体进行纯化和浓缩。
抗原抗体杂交所需抗体制备流程
抗原抗体杂交所需抗体制备流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!抗原抗体杂交所需抗体制备流程抗原抗体杂交技术是一种广泛应用于生物学和医学领域的检测方法，其基本原理是将抗原与抗体结合形成复合物，然后再将其与标记有特定抗体的探针结合，从而实现对目标物质的检测。
ELISE(酶联免疫)
简介酶联免疫实验板酶联免疫吸附剂测定法，简称酶联免疫法，或者ELISA法。
它的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。
基本原理①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。
在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。
由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有3种必要的试剂:①固相的抗原或抗体②酶标记的抗原或抗体③酶作用的底物。
根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
注意事项⒈正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。
有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
⒉在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:⑴固相载体的选择:许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。
其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。
当前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。
不管何种载体，在使用前均可进行筛选:用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
⑵包被抗体(或抗原)的选择:将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好，吸附时一般要求PH在9.0~9.6之间。
吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响，一般多采用4℃18~24小时。
动物疫苗中常用抗原灭活剂
动物疫苗中常用抗原灭活剂灭活是进行微生物灭活生物制品生产中最关键、最基本的技术之一，不仅可防止病原体的扩散，还可提高生物制品的安全性。
使用灭活剂是对生物制品进行灭活的重要方法之一。
理想的灭活剂应具有以下特质：①彻底灭活病原并保持免疫原性；②机体接种疫苗后可产生免疫保护效果；③对机体安全不产生明显的毒副作用。
灭活剂具有特异性，针对不同类型病原，有效灭活剂的种类也不同，即使同一种灭活剂，也会因不同病原的结构差异而使灭活条件发生变化，导致灭活效果也不同。
因此，选择正确的灭活剂和采用正确的灭活方法，对于制备高效疫苗至关重要。
目前，在动物疫苗中常用的灭活剂有甲醛（for-maldehyde）、β－丙内酯（beta-propiolactone，BPL）、二乙烯亚胺（bromoethylamine hydrobromide，BEI）及脂溶性溶剂等。
一、甲醛甲醛是使用最早、最广泛的灭活剂。
甲醛是一种有强烈刺激性的致癌物质，室温下为无色气体，水溶液被称为福尔马林，浓度为 36％~40％。
甲醛的灭活作用主要体现为其具有强烈的还原作用，可分别与氨基、羧基、羟基、巯基作用生成甲基胺、亚甲基二醇单酯、羟基甲酚和亚甲基二醇，还可使核糖体的两个亚单位之间形成交联链。
蛋白质和核酸均含有这些基团，因此甲醛可使病毒表面蛋白使病毒抗原的免疫效力降低，并阻碍其对病毒内部核酸的破坏作用，最终导致病毒失去致病能力。
甲醛用于疫苗灭活的浓度为0.1%~0.8%。
一般需氧细菌用0.l%~0.2%的浓度，厌氧菌则多用0.4%~0.5%的甲醛杀菌或脱毒，37~39℃处理24 h以上，有的需要更长时间。
适当浓度的甲醛灭活病毒后，病毒抗原性、血凝性均不改变，故常用其灭活病毒制造疫苗，迄今应用的灭活病毒疫苗，约有50%以上是用甲醛作灭活剂。
用于病毒灭活其浓度可在0.05%~0.4%，大部分使用0.1%~0.3%。
其它病毒制品（如血凝抗原、补体结合抗原、琼扩抗原）也常以甲醛灭活病毒制备。
单抗和多抗的制备流程
单抗和多抗的制备流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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【CN109870442A】一种甲基苯丙胺包被抗原、其制备方法及利用其检测甲基苯丙胺的方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910250542.7(22)申请日 2019.03.29(71)申请人 铁道警察学院地址 450000 河南省郑州市金水区农业路31号(72)发明人 崔胜峰 万敬伟 马素娟 左健 (74)专利代理机构 郑州联科专利事务所(普通合伙) 41104代理人 时立新 张丽(51)Int.Cl.G01N 21/64(2006.01)G01N 33/533(2006.01)G01N 33/535(2006.01)G01N 33/544(2006.01)(54)发明名称一种甲基苯丙胺包被抗原、其制备方法及利用其检测甲基苯丙胺的方法(57)摘要一种甲基苯丙胺包被抗原、其制备方法及利用其检测甲基苯丙胺的方法，所述制备过程包括如下步骤：(1)甲基苯丙胺半抗原的制备：称取琥珀酸酐与甲基苯丙胺溶于有机溶剂中，在碳酸钾的催化作用下，55~65℃加热搅拌至反应完全，薄层色谱分离，所得琥珀酰甲基苯丙胺即为甲基苯丙胺半抗原；(2)甲基苯丙胺包被抗原的制备：以EDC、NHS为催化剂，将甲基苯丙胺半抗原和卵清蛋白进行反应得到甲基苯丙胺包被抗原；(3)量子点标记的甲基苯丙胺抗体的制备：将CdSe/ZnS QDs溶解于硼酸缓冲液中，在EDC、NHS作用下，将甲基苯丙胺抗体滴加至CdSe/ZnS QDs的硼酸缓冲液中，搅拌反应，反应结束后，PBS缓冲液透析。
权利要求书2页 说明书8页 附图2页CN 109870442 A 2019.06.11C N 109870442A1.一种甲基苯丙胺包被抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1) 甲基苯丙胺半抗原的制备：以二氯甲烷或丙酮为溶剂，称取琥珀酸酐与甲基苯丙胺，在碳酸钾的催化作用下，55~65℃加热搅拌至反应完全，薄层色谱分离，所得琥珀酰甲基苯丙胺即为甲基苯丙胺半抗原；(2) 甲基苯丙胺包被抗原的制备：以EDC和NHS为催化剂，将甲基苯丙胺半抗原和卵清蛋白进行反应得到甲基苯丙胺包被抗原。
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常用抗原类型及制备方法
1.天然提纯抗原
天然蛋白是一种非常好的抗原，主要从机体提取纯化得到,的天然
抗原（主要是蛋白质）保持了抗原本身结构（自身修饰，正确构象）
特点；但是天然蛋白抗原的纯化难度比较大，并且只有表达丰度较高、
性质稳定的天然蛋白才具备可纯化条件，其做抗原制备的抗体，一般
适合于ELISA、免疫层析和免疫比浊等类诊断开发类抗体的制备。
2.重组蛋白抗原
重组蛋白抗原制备常用的有原核表达系统、酵母表达系统、真核
表达系统，真核表达系统主要有昆虫细胞-杆状病毒表达和哺乳动物细
胞表达系统等。重组表达制备抗原一般会在蛋白序列加上一段用于纯
化的标签,除了便于纯化还可以增加蛋白的可溶性和分子量更利于抗体
制备，常用的标签主要有GST、6*His、Myc、MBP、Flag、Fc等。
根据下游实验对蛋白质的使用需求，如有需要可以切除标签；如不切
除，后期抗体在使用时如遇标签抗体干扰，可先用标签蛋白免疫吸附
去除高免血清中针对标签的抗体。重组蛋白与天然蛋白相比，在构象、
修饰和蛋白活性上还是有差距的，真核与原核相比，更接近于天然蛋
白；这类抗原制备一般适合于Western Blot、IHC、ELISA以及免疫
层析、胶体金和免疫比浊等诊断类抗体的制备，只不过制备的过程需
要用含内源性蛋白标本进一步筛选验证。
科研用途的抗体，对其品质要求要远远低于诊断用途的抗体，在
抗原全长表达遇到瓶颈的时候，可以考虑选取抗原表位性和特异性较
强区段进行分段表达尝试，分段选取的技术方案需要专业人员根据方
方面面情况综合考虑，初学者往往不得门而入；福因德技术团队在整
合大量案例数据和项目经验的基础上，将会不定期与科研工作者分享
这方面的经验。
抗原制备最为重要的环节就是抗原的纯化，通过重组蛋白制备抗
原当然也不例外，在项目开始之前这个难度往往被忽视，科研人员往
往认为既然在抗原设计的时候融合了纯化标签，纯化过程按照标准流
程操作，得到高纯度抗原就是水到渠成，然而结果往往不如人意；诸
如，明明带了标签的蛋白挂不上纯化柱子、洗脱下来的蛋白杂带比目
的带还多、目的蛋白结合在柱子上洗脱不下来等等。蛋白纯化在业界
都是一大难题，一个蛋白的纯化往往会用到几种方案和策略。根据福
因德生物技术团队的经验，纯化出一个符合抗体制备要求的重组抗原
蛋白至少要用2-3种手段，常用的手段有离子交换层析、标签亲和层
析、凝胶过滤分离层析等等。