自体肿瘤抗原的简单制备方法1
抗原抗体制备流程
抗原抗体制备流程一、抗原的制备。
1. 抗原来源。
抗原的来源那可多了去了。
可以从天然的生物体里找，比如说从细菌或者病毒身上获取它们特有的那些小成分，像细菌的细胞壁成分啦，病毒的衣壳蛋白之类的。
还有就是人工合成的一些小分子物质，这些小分子经过特殊设计，也能成为很好的抗原呢。
有时候还能从一些基因工程的产物里找抗原，通过让微生物表达我们想要的蛋白质，然后把这个蛋白质提取出来当抗原。
2. 抗原的纯化。
当我们从各种来源拿到了可能含有抗原的东西之后呀，就得把抗原纯化出来。
这就像是从一堆沙子里把珍珠挑出来一样。
可以用各种方法呢，像盐析法，就是根据不同蛋白质在不同盐浓度下溶解度不一样的原理，把我们要的抗原从一堆杂蛋白里分离出来。
还有凝胶过滤层析，这个就更神奇啦，就像小珠子组成的迷宫，不同大小的蛋白质在这个迷宫里跑得快慢不一样，这样就能把抗原和其他东西分开了。
离子交换层析也很常用，根据蛋白质带的电荷不同来分离，正电的和负电的在离子交换柱里就各走各的路啦。
二、抗体的制备。
1. 免疫动物。
要得到抗体，就得先找个合适的动物来免疫。
常见的小动物像小鼠、兔子就经常被拉来做这个工作。
把我们前面制备好的抗原打到动物身体里，不过这个过程可不能太粗暴哦。
就像给小朋友打针一样，得小心翼翼的。
一般会选择合适的部位，比如皮下注射或者肌肉注射。
而且这个抗原的量也得控制好，太多了可能把小动物弄得太难受，太少了又可能刺激不出足够的抗体。
打完针之后呢，就等着小动物的身体对这个外来的抗原产生反应啦。
2. 抗体的检测。
在免疫了一段时间之后，就得看看小动物的身体有没有产生我们想要的抗体了。
这个检测方法也不少呢。
有个叫ELISA的方法就很常用，简单来说就是把抗原固定在一个板子上，然后加上从免疫动物身上取来的血清，如果血清里有抗体，就会和抗原结合，再通过一些显色反应就能看出来有没有抗体以及抗体的量大概有多少了。
还有个叫Western blot的方法，这个就像是给蛋白质做个身份鉴定。
抗原制备技术
合成肽抗原序列较短、免疫性不强
一般情况下在免疫动物制备抗体时需要与载体蛋白偶联形成
复合抗原
钥孔血蓝蛋白（KLH,keyhole limpet hemocyanin） 是具有高度免疫原性的蛋白大分子，作为载体蛋白用于免疫 原的制备，交联于半抗原和其他抗原，增强它们的免疫原性。
4
佐剂的制备
佐剂（adjuvant）是指预先或与抗原一起注射于机体，
用于制备抗绵羊红细胞抗体（溶血素） （二）细菌抗原
二、可溶性抗原的制备
蛋白质（包括糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒
素）、多糖和核酸等均为可溶性抗原。
主要来源于组织和细胞，因此需先将组织和细胞破碎，
再用适当的方法提取纯化目的蛋白。
（一）组织和细胞可溶性抗原的粗提
1、制备组织匀浆
2、细胞的破碎
（1）超声波破碎法
（2）反复冻融法
（3）酶处理法 （4）表面活性剂处理法
（二）可溶性抗原的提纯
1、超速离心法
2、选择性沉淀法
盐析法、聚合物沉淀法、 有机溶剂沉淀法、核酸沉淀法
3、凝胶过滤法
4、离子交换层析法 5、亲和层析法
（二）纯化抗原的鉴定
1、蛋白含量测定
紫外光吸收法
蛋白含量（mg/ml）=A280×1.45-A260×0.74
能够增强机体免疫应答或改变免疫应答类型的物质。
佐剂本身氏佐剂（Frennd adjuvant）
Complete Freund adjuvant
羊毛脂
石蜡油
卡介苗（BCG）
InComplete Freund adjuvant
羊毛脂
石蜡油
使用原则：
颗粒性抗原一般情况下不需使用； 可溶性大分子量的蛋白质免疫原、人工抗原，初次免疫时 必须使用佐剂； 不连续两次使用完全福氏佐剂，以免导致动物严重反应；
抗原的制备的原理
抗原的制备的原理
抗原的制备基于以下原理：
1. 选择合适的生物样品：抗原可以来自细胞、组织或生物体等样品。
选择适当的样品是制备抗原的第一步。
2. 提取目标分子：根据需要，从样品中提取目标分子，例如蛋白质、糖类或核酸等。
提取方法通常基于特定的生化特性，例如蛋白质可通过破碎细胞壁、溶解样品或离心沉淀等步骤提取。
3. 纯化目标分子：利用化学或生物学方法对提取的目标分子进行纯化，以消除其他杂质。
这些方法可以通过差速离心、凝胶电泳、层析等技术来实现。
4. 可选的修饰步骤：有时需要修饰目标分子以改善其在制备抗原过程中的稳定性或识别性。
例如，可以对蛋白质进行戊糖化、His标签标记或荧光修饰等。
5. 质量控制：制备的抗原应通过质量控制步骤来确保其纯度和活性。
常用的方法包括质谱分析、SDS-PAGE凝胶电泳、免疫印迹等。
总之，抗原的制备主要包括样品选择、目标分子提取和纯化、可选的修饰步骤以及质量控制等步骤，以获得高质量的抗原用于后续的实验研究。
患者自体肿瘤组织来源抗原制备DC及CIK方案(唐正晓)
肿瘤患者自身肿瘤组织来源抗原制备DC及CIK细胞免疫治疗方案一、患者选择准入标准：1、疾病种类：实体肿瘤病人（能通过手术获得肿瘤组织）2、病人筛选：1)患者年龄大于18岁2)能够通过手术获得约1cm3肿瘤组织3)患者预期生存期大于6个月4)患者心肺肝肾功能基本正常5)患者无感染或感染已被控制6)患者无传染性疾病7)患者一周内血象在正常范围8)患者三个月内检查的凝血三项和肝肾功能基本正常9)患者无器官移植史10)患者细胞因子等过敏史11)无其他不适合做细胞治疗的临床症状及体征。
二、临床方案：1.手术切除肿瘤组织（由肿瘤生物治疗中心协调完成）。
时间：细胞治疗90天前。
2.切除后肿瘤组织制备DC抗原（冻融、研磨或超声破碎法），制备量满足约10次DC-CIK培养使用（由肿瘤生物治疗中心实验室试剂制备部完成）。
时间：-89天。
3.调整患者免疫状态（由肿瘤生物治疗中心完成）。
时间：-90天-0天。
4.GM-CSF100万单位，采血前4-5天用1-2次。
5.患者静脉外周血采集（由肿瘤生物治疗中心完成）。
时间：0天。
6.患者DC-CIK制备并进行相关检测，合格后提供给肿瘤生物治疗中心，（由肿瘤生物治疗中心实验室提供）。
时间：0天-14天。
7.患者细胞回输（由肿瘤生物治疗中心实验室提供，由肿瘤生物治疗中心完成细胞输注）时间：7天后依次回输DC，皮下或静脉；14天17天静脉回输CIK。
8.每次细胞治疗前3天至结束后2-3天注射白介素100-200万单位。
9.患者输注频率次数：1次/月;>4次/总疗程。
后期可3-6个月加强进行一次细胞治疗。
10.患者跟踪随访：三、随访：1.随访时间：1年、2年、5年2.随访人员：肿瘤生物治疗中心实验室完成。
3.随访要求：肿瘤生物治疗中心完善患者临床相关数据。
四、临床疗效判断：1、生活质量的提高，食欲增强，睡眠改善，体力增强，体重增加等，1个疗程后。
2、血肿瘤标记物监测下降等，2到3个疗程后。
抗原的提取与制备
氯甲酸异丁酯法
半抗原-COOH + Cl-COO-CH2 CH（CH3）2 OO
半抗原-C-O-C-O-CH2CH（CH3）2 + 蛋白质- NH2
半抗原-CO- NH -蛋白质 + HO-CH2CH（CH3）2
半抗原与载体直接联接
琥珀酸酐法
OO 半抗原-CH2 –OH + C-O-C
载体的选择 结构复杂的大分子
蛋白质载体：
BSA、HSA、OVA（卵清蛋白 ）、KLH（钥孔嘁血蓝蛋白 ）
聚合多肽载体：多聚赖氨酸 高分子聚合物载体：羧甲基纤维素
半抗原与载体的联接
1、连接方式：物理法（吸附）
化学法
2、化学连接方法：
直接联接法：适用于带游离氨基或游离羧基的半抗原 间接联接法：适用于没有游离氨基或游离羧基的半抗原
离心技术：差速离心
密度梯度离心
电泳技术：电泳洗脱
等电聚焦
密度梯度离心法
控制溶液的比重，将不同比重的分子或细胞通过离心方法加 以分离
分为： *不连续密度梯度离心法（单次密度梯度离心法）
*连续密度梯度离心法
不连续密度梯度离心法（单次密度梯度离心法）
分离液仅形成单一的密度层，可在该层中获取与其比重一致 的细胞或分子。
CH3 CH3
O 半抗原-CH2 –O-C-(CH2 ) 2-COOH
半抗原与载体间接联接
O-（羟甲基）羟胺法
半抗原-C=O +H2 N-O- CH2 - COOH
半抗原-C=N-O- CH2 - COOH
半抗原与载体间接联接
一氯醋酸钠法
半抗原-
- OH + Cl- CH2 - COONa
一种肿瘤抗原的制备方法及其制备的肿瘤抗原[发明专利]
![一种肿瘤抗原的制备方法及其制备的肿瘤抗原[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/81318bd2eefdc8d376ee32fe.png)
专利名称：一种肿瘤抗原的制备方法及其制备的肿瘤抗原专利类型：发明专利
发明人：顾宇春
申请号：CN201610860271.3
申请日：20160928
公开号：CN106366175A
公开日：
20170201
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及细胞免疫技术领域，尤其涉及一种肿瘤抗原的制备方法及其制备的肿瘤抗原。
该方法将分离培养的肿瘤细胞与腺病毒共同培养后，弃除沉淀，截留分子量小于30kDa的蛋白。
本发明提供方法制得的肿瘤抗原纯度较高，浓度较大，经检测，其中肿瘤抗原的浓度大于0.5mg/ml。
经试验证实，本发明提供方法制备的肿瘤抗原具有更好的免疫原性，与传统方法制备的抗原相比，其能够使肝癌大鼠的肿瘤体积缩小至原体积的约1/3，使乳腺癌大鼠的肿瘤体积缩小至原体积的1/3，该效果显著优于(p<0.05)现有技术制备的抗原。
申请人：诺莱生物医学研究院(北京)有限公司
地址：100083 北京市海淀区花园北路35号9号楼4层405
国籍：CN
代理机构：北京集佳知识产权代理有限公司
代理人：赵青朵
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抗原的制备方法
抗原的制备方法抗原的制备方法有很多种，下面列举了其中的50种，并对其中一些方法进行详细描述。
1. 细胞抗原的制备：通过细胞培养、离心、酶解等方法获得细胞抗原。
2. 细菌抗原的制备：通过培养、离心、酶解等方法获得细菌抗原。
3. 病毒抗原的制备：通过感染细胞、裂解、纯化等方法获得病毒抗原。
4. 真菌抗原的制备：通过培养、离心、酶解等方法获得真菌抗原。
5. 动物抗原的制备：通过组织切片、裂解、纯化等方法获得动物抗原。
6. 植物抗原的制备：通过组织切片、裂解、纯化等方法获得植物抗原。
7. 天然抗原的提取：从天然产物如血清、组织中提取抗原。
8. 重组蛋白抗原的制备：通过表达载体、细胞培养、裂解、纯化等方法获得重组蛋白抗原。
9. 合成肽抗原的制备：通过化学合成方法合成肽抗原。
10. 核苷酸抗原的制备：通过合成核苷酸序列或从基因组中提取核苷酸获得抗原。
11. 脂多糖抗原的制备：通过提取细菌外膜、酶解、纯化等方法获得脂多糖抗原。
12. 糖蛋白抗原的制备：通过表达载体、细胞培养、裂解、纯化等方法获得糖蛋白抗原。
13. 灭活抗原的制备：通过化学处理、辐射等方法使活性抗原失活。
14. 改性抗原的制备：通过化学修饰、结构改变等方法获得改性抗原。
15. 冻干抗原的制备：通过冻干法将抗原冻结干燥得到制备。
16. 超声波处理抗原的制备：利用超声波对细胞或组织进行处理得到抗原。
17. 低温冷冻抗原的制备：通过低温冻存和冷冻保存得到抗原。
18. 酸碱处理抗原的制备：通过酸碱处理使抗原发生结构改变得到制备。
19. 超滤抗原的制备：通过超滤膜对抗原进行分离得到制备。
20. 溶菌素处理抗原的制备：通过溶菌素对细胞壁进行处理使抗原释放。
21. 质粒抗原的制备：通过质粒转化、大规模培养、纯化等方法获得质粒抗原。
22. 染色体抗原的制备：通过染色体提取、裂解、纯化等方法获得染色体抗原。
23. 大肠杆菌表达抗原的制备：通过大肠杆菌表达载体、大规模发酵、纯化等方法获得抗原。
自体肿瘤抗原的简单制备方法1
自体肿瘤抗原的简单制备方法
一、取材：肿瘤组织或胸、腹水中的癌细胞，然后生理盐水洗2-3次，去除血块、杂物等。
离心转速2000/分，5′钟每次。
对肿瘤组织要剪去脂肪，非肿瘤组织和坏死部分。
二、将组织置于研钵中碾碎，然后加入纯水，一般＜2g加入5ml，≥2-5克加入10ml，6-10g加入20ml, 然后用纱布过滤，过滤前先将纱布用纯水洗去表面的线头和杂物，洗2次，然后拧去水分，盖在试管口上对组织液进行过滤，纱布用2层；如果过滤后残留组织较多，可继续研磨，再次过滤，过滤后的液体置入-20℃或-80℃冻存，每隔1天取出，置温下完全融解后再冷存，反复5次。
胸腹水中获得的癌细胞洗净后按上述比例加入纯水，吹打、反复冻融。
三、应用：将冻存液在室温下融解，达到室温时，离心：5000-6000转/分，45′，然后将上清用一次无菌过滤品过滤，置入另一试管中，然后取1ml加1mlDC 培养基加入第二次转化后的DC瓶中[72hr后第二次加入GM/IL-4的DC中]，促成熟后再加入多肽抗原。
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自体肿瘤抗原的简单制备方法
一、取材：肿瘤组织或胸、腹水中的癌细胞，然后生理盐水洗2-3次，去除血块、杂物等。
离心转速2000/分，5′钟每次。
对肿瘤组织要剪去脂肪，非肿瘤组织和坏死部分。
二、将组织置于研钵中碾碎，然后加入纯水，一般＜2g加入5ml，≥2-5克加入10ml，6-10g加入20ml, 然后用纱布过滤，过滤前先将纱布用纯水洗去表面的线头和杂物，洗2次，然后拧去水分，盖在试管口上对组织液进行过滤，纱布用2层；如果过滤后残留组织较多，可继续研磨，再次过滤，过滤后的液体置入-20℃或-80℃冻存，每隔1天取出，置温下完全融解后再冷存，反复5次。
胸腹水中获得的癌细胞洗净后按上述比例加入纯水，吹打、反复冻融。
三、应用：将冻存液在室温下融解，达到室温时，离心：5000-6000转/分，45′，然后将上清用一次无菌过滤品过滤，置入另一试管中，然后取1ml加1mlDC 培养基加入第二次转化后的DC瓶中[72hr后第二次加入GM/IL-4的DC中]，促成熟后再加入多肽抗原。