蚜虫共生细菌多重PCR检测体系的建立
大肠埃希菌O157：H7新型多重PCR检测方法的建立及其初步应用
中图分类号 ：Ｒ ３ ７ பைடு நூலகம் ． ２＋ １ Ｑ ７ ８ 文献 标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ： １ ０ ０ ４ — ５ ５ ０ ３ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ９ — ０ ９ ５ ６ — ０ ５
Ｄｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｐ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｎ ｄ ｐ ｒ ｅ ｌ ｉ ｍｉ ｎ ａ ｒ ｙ ａ ｐ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｍｕ ｌ ｔ ｉ ｐ ｌ ｅ ＰＣＲ ｆ ｏ ｒ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ０ ｎ ０ ｆ Ｅ． ｃ ｏ ｌ ｉ ０１ ５ ７： Ｈ７
Ｃｏ ｒ ｒ ｅ ｓ ｐ ｏ ｎ ｄ ｉ ｎ ｇ ａ ｕ ｔ ｈ ｏ ｒ ：ＷＡ ＮＧ 憎 Ｚ ｏ ｎ Ｅ — ｍａ ｉ ｌ ： ｗ ａ ｎ ｇ ｘ ｌ 一 ２ ０ ０ ６ ＠１ ６ ３ ． ｃ ｏ ｎ ｒ
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｄ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｐ ａ ｍ ｕ ｌ ｔ ｉ ｐ ｌ ｅ Ｐ Ｃ Ｒ ｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｆ ｏ ｒ ｒ ａ ｐ ｉ ｄ ｏ ｎ — ｓ ｉ ｔ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｅ ． ｃ ｏ ｌ ｉ Ｏ １ ５ ７： Ｈ ７ ｉ ｎ ａ ｂ ｓ ｅ ｎ ｃ ｅ ｏ ｆ
样品。结论 建立 了大肠埃希菌 Ｏ１ ５ ７： Ｈ７ 微 量快速多重 Ｐ Ｃ Ｒ检测方法 ， 该方法特异性 、 灵 敏性 和重 复性 均 良好 ， 可 在现场约 ｌ ｈ报告结果 ， 对突发性传染病的防治具有重要意义 。
多重PCR鉴定布氏菌及标准方法研究的开题报告
多重PCR鉴定布氏菌及标准方法研究的开题报告
【摘要】：
布氏菌病是一种由布氏菌感染引起的严重人畜共患传染病，具有潜伏期长、病程长、易慢性化等特点，严重危害畜牧业发展和人民群众健康。
因此，对布氏菌的及时、准确鉴定是防控布氏菌病的关键。
现有的标准方法存在检测限低、耗时长等缺点，本
研究将利用多重PCR技术，建立一种快速、敏感、特异的布氏菌鉴定方法，以提高对布氏菌病的诊断水平。
同时，对该方法的可靠性、准确性、精密性和适用性进行验证。
【主要内容】：
1.布氏菌的生物学特性与检测方法研究概述
2.多重PCR的原理、优势及应用研究现状
3.建立多重PCR鉴定布氏菌的方法体系
①优选多个靶标基因，设计引物，建立多重PCR反应系统
②对反应条件进行优化，包括酶的浓度、模板DNA的用量、PCR扩增周期、反
应体积等
③建立标准曲线，检测PCR产物
4.对多重PCR方法进行验证
①验证该方法的特异性、敏感性及精度
②应用该方法对临床病例进行鉴定并与标准方法进行对比分析
5.结果分析及意义
【预期结果】：
本研究将建立一种快速、敏感、特异的布氏菌鉴定方法，相比传统标准方法，检测时间更短、检测限更低、具有更高的鉴定准确性和广泛的应用前景，可进一步提高
布氏菌病的诊断水平及防控能力。
猪五种繁殖障碍性疫病病原体多重PCR的建立及初步应用
猪五种繁殖障碍性疫病病原体多重PCR的建立及初步应用王苗苗;张凡庆;王曼;朱建国【摘要】To establish the multiple PCR for detecting classical swine fever virus(CSFV),porcine reproductive and respiratory syndromevirus(PRRSV),porcine pseudorabies virus(PRV), porcine circovirus type2(PCV2) and porcine parvovirus(PPV),five pairs of primers were designed to amplify CSFV E2,PRRSV Nsp2,PRV gB,PCV2 ORF2 and PPV VP2 according to the gene sequences in GenBank of these five viruses.Reaction conditions were optimized to establish the multiplex PCR on the basis of the single PCR.The multiplex PCR had good sensitivity and specificity.To evaluate the multiplex PCR,127 clinical samples were detected for detecting the five viruses,among which 38.6%(49/127) samples were detected for two or more viruses,which means the multiplex PCR can be used as rapid diagnosis for single or mixed clinical samples infected with CSFV,PRRSV,PRV,PCV2,PPV.%为了建立能够同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)的多重PCR,并用于猪场感染情况的动态监控以及临床诊断,根据GenBank中已发表的5种病毒的基因序列,针对CSFV的E2、PRRSV的Nsp2、PRV的gB、PCV2的ORF2和PPV的VP2基因,分别设计了特异性引物.在建立的单项PCR基础上,通过优化反应条件,建立了能同时检测5种病毒的多重PCR,并具有较高的灵敏性和良好的特异性.采用建立的多重PCR对127份疑似病猪的扁桃体活体组织进行检测,检出了5种病毒的存在,其中感染2种及以上病毒的样品比例为38.6%(49/127),表明该方法是一种快速、灵敏、高效的病原学检测手段.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2017(038)003【总页数】5页(P27-31)【关键词】猪瘟病毒;猪繁殖与呼吸综合征病毒;猪伪狂犬病病毒;猪圆环病毒2型;猪细小病毒;多重聚合酶链反应【作者】王苗苗;张凡庆;王曼;朱建国【作者单位】上海交通大学农业与生物学院/上海市兽医生物技术重点实验室,上海200240;上海交通大学农业与生物学院/上海市兽医生物技术重点实验室,上海200240;上海交通大学农业与生物学院/上海市兽医生物技术重点实验室,上海200240;上海交通大学农业与生物学院/上海市兽医生物技术重点实验室,上海200240【正文语种】中文【中图分类】SS854.44;S858.28在猪场常发生的各类疫病中，猪繁殖障碍性疾病给猪场的整体经济效益造成了严重影响[1-3]，这类疫病主要表现为感染母猪发生流产、死胎、木乃伊胎等，公猪发生一定的繁殖障碍，感染仔猪出现大量死亡，或发生混合感染和继发感染[4]。
转基因耐除草剂大豆ZH10-6多重PCR检测方法的建立
转基因耐除草剂大豆 ZH10-6多重 PCR检测方法的建立摘要本研究通过利用多重PCR(multiplexPCR，MPCR)技术，检测ZH10-6的4个边界序列，建立其分子特征转化体特异性鉴定方法，为该转化体的生物安全评价研究以及知识产权保护和市场行政监管提供重要的基础技术支撑。
关键词：转基因耐除草剂大豆ZH10-6；多重PCR；检测方法1、材料与方法1.1材料转基因耐除草剂大豆(Glycinemax)ZH10-6，非转基因大豆受体ZH10，用于特异性测试的样品有：转基因玉米(Zeamays)混样(MON810，MON863，Bt11，Bt176，GA21，T25，NK603，TC1507，MON88017，3272，MON87427，MON87460，MIR162，MIR604，DAS40278-9，MON89034，4114，59122，5307，BVLA430101每种转化体含量分别为1%，以非转基因玉米作为填充物)；转基因大豆混样(MON87701，MON89788，GTS40-3-2，A2704-12，A5547-127，CV127，356043，305423，MON87769，MON87705，MON87708，FG72，DAS44406-6和SYHT0H2每种转化体含量分别为1%，以非转基因大豆作为填充物)；转基因油菜(Brassicanapus)混样(包括RT73，MS1，MS8，T45，RF1，RF2，Topas19/2，RF3，Oxy235，MON88302，每种转化体含量分别为1%，以非转基因油菜作为填充物)。
1.2仪器和主要试剂LEGENDMICRO21R高速冷冻离心机Ther‐mo；Nanodrop1000核酸定量仪NanoDrop；Veriti96WellPCR仪ABI；电泳仪BIO-RAD；C150凝胶成像系统AzureBiosys‐tems。
植物基因组DNA提取试剂盒DP305；PCR试剂2×GoTaqGreenMasterMix;DL1000DNAMarker;琼脂糖;SuperGelred10000×inwater；引物由GE‐NEWIZ合成。
光合细菌PCR检测技术的建立与应用
应用与环境生物学报 2008，14 ( 5 ): 699~704Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X2008-10-25DOI: 10.3724/SP.J.1145.2008.00699光合细菌PCR检测技术的建立与应用*关大伟** 李 俊 沈德龙 曹凤明 李 力 姜 昕(中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 北京 100081)Identification and Quantification of Photosynthetic Bacteria by PCR Method *GUAN Dawei **, LI Jun, SHEN Delong, CAO Fengming, LI Li & JIANG Xin(Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agriculture Sciences, Beijing 100081, China)Abstract The identification and quantification technique with species-specific PCR and real time PCR were developed for the most common photosynthetic bacterial (PSB) strains of Rhodopseudomonas palustris and Rhodobacter sphaeroides to solve the defects of conventional methods, including time-consuming, laborious and inaccurate. Using the strains of R. palustris and R. sphaeroides as targets, the species-specific primers were designed according to the particular sequence of 16S rDNA and gyrB , respectively. To ensure the identification accuracy, the MgCl 2 concentrations and annealing temperatures were optimized for the species-specific PCR method, and the test results for microbial fertilizers showed that the identification accuracy was 100%, and the minimal detection thresholds of the PCR assay were all 100 pg DNA for R. palustris and R. sphaeroide, indicating that the developed species-specific PCR method was accurate, reliable and sensitive, and more simple and rapid than the conventional methods. In the study of the real time PCR of quantitative determination for PSB inoculant , the universal primers were designed according to the 16S rDNA sequence differing the most common PSB strains from other bacteria and the real time PCR method was set up. Using the number of the known samples, the DNA was continuously diluted, the standard curve was made with the developed real time PCR method and the correlation factor reached 0.998. With the standard curve ，10 PSB samples were measured by the real time PCR. The quantitative results showed the population by the real time PCR was higher than that by the MPN method, and the positive correlation between them was very high (r =0.98, P <0.01). These results indicated the quantitative method by the real time PCR was applicable for the quantification of PSB microbial fertilizers. Fig 5, Tab 4, Ref 14Keywords detection of microbial fertilizer; photosynthetic bacterium; specific PCR; real time PCR CLC S144 : Q78摘 要 针对光合细菌传统的菌种鉴定方法和MPN 定量方法存在费时、费力和准确性差的问题，本研究建立了光合细菌特异PCR 鉴定技术和实时荧光PCR 定量的检测技术. 以微生物肥料产品常用的光合细菌沼泽红假单胞菌和类球红细菌作为研究对象，分别依据16S rDNA 序列和gyrB 序列设计出具有种水平特异性的引物，优化并确定了PCR 反应条件，其灵敏度达到100 pg/µL ，对6个光合细菌产品鉴定的符合率为100%，结果表明建立的PCR 鉴定技术具有特异性、灵敏性和实用性. 再根据16S rDNA 的保守序列设计了常用光合细菌通用引物，用其对系列稀释的已知菌含量样品的DNA 模板进行荧光定量PCR ，制作标准曲线. 对10个光合细菌样品进行荧光定量PCR 法测定，根据与标准曲线比较得出样品中的光合细菌含量，其结果与MPN 法的相关系数为0.98，两者具有良好的相关性，结果表明建立的荧光定量PCR 法可用于光合细菌的定量检测，并具有高特异性和快速等优点. 表5 图4 参14关键词 微生物肥料检测；光合细菌；特异PCR ；荧光定量PCR CLC S144 : Q78收稿日期: 2007-08-13 接受日期: 2007-12-19*中央公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目(No. 2007-06) Supported by the Special Funds of Central-level Public Welfare Scientific Research Institutes for Basic Operations**通讯作者 Corresponding author (E-mail: dwguan@)光合细菌(Photosynthetic bacteria ，简称PSB)是地球上最早出现的一大类能以光作为能源，以CO 2和有机物作为光合作用碳源，以有机物、氢气或硫化物为供氢体而营养繁殖的原核生物的总称；广泛分布在海洋、河川、沼泽、水沟、活性污泥、土壤、极地、温泉和高盐水体等各种生境中. 光合细菌因具有复杂多样的代谢功能、丰富的营养和生理活性物质等特性，在种植业、养殖业以及环境废水处理等方面得到了广泛应用. 以光合细菌为菌种生产的微生物肥料产品在水稻、蔬菜、果树和烟草等作物上都取得了较好效果，研究表明，光合细菌具有改善土壤的结构和营养状况[1]、提高土壤肥力[2~4]、增强作物抗病防病能力、提高作物的光合作用能力[2]、提高作物品质[3]等功效.光合细菌的多功能性已引起了微生物肥料行业的重视，光合细菌的产品种类和数量近年来迅速增加. 产品质量是确保光合细菌产品使用效果的关键，而特异、快速和灵敏的质量检测技术是重要的保障环节. 目前使用的传统光合细菌菌种鉴定是以形态特征和各项生理生化方法为主，定量测定多采用MPN 法(最大或然数法). 这些方法操作烦琐，70014 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol7015 期关大伟等：光合细菌PCR检测技术的建立与应用酸钠、乙醇、甘露醇和酒石酸盐利用等实验[7]. 产品DNA 提取同1.4，PCR 方法同2.2.1，PCR 产物序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成.1.7 光合细菌定量测定研究1.7.1 PCR 对光合细菌通用引物通用性和特异性验证 以4种光合细菌(沼泽红假单胞菌、荚膜红细菌、类球红细菌和嗜酸红假单胞)、施氏假单胞菌、大肠杆菌和芽孢菌的基因组DNA 为模板，利用设计的通用引物进行普通PCR 扩增，验证引物的通用性和特异性. PCR 反应条件为：反应体系(20 μL)：10×buffer 2 μL ，dNTPS (10 mmol/L) 1.6 μL ，引物F (10 μmol/L) 1.0 μL ，引物R (10 μmol/L) 0.5 μL ，Taq E (2.5 U/μL) 0.2 μL ，模板DNA 1 μL ，补足ddH 2O 20 μL. 反应程序：95 ℃ 5 min ，95 ℃ 40 s ，60 ℃ 40 s ，72 ℃ 30 s ，30个循环，72℃ 10 min.1.7.2 荧光定量PCR 反应条件 反应体系(25 μL)：SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL ，引物F (10 μmol/L) 0.4 μL ，引物R (10 μmol/L) 0.2 μL ，ROX Reference Dye (50×) 0.5 μL ，DNA 模板2.5 μL ，补足ddH 2O 25 μL.反应程序：95 ℃ 5 min ，95 ℃ 10 s ，60 ℃ 2 s ， 72 ℃ 31 s ，40个循环.1.7.3 荧光定量PCR 标准曲线的制作 标准品DNA 提取：9 000 r/min 离心4 min 收集菌体，与l mL 灭菌的PBS 混合，9 000 r/min 离心3 min ，沉淀用PBS 洗涤2次，水洗1次，用100 μL 水重悬沉淀，加入TritonX-100 100 mL ，沸水浴5 min ，迅速在冰水中冷却，取2.5 μL 作模板.标准品菌含量的测定：菌液作10倍递增稀释，选取3个合适稀释度的光合细菌菌液0.1 mL 均匀涂布于光合细菌底层固体培养基平板上(配方见1.3，再加入琼脂20 g)，置45~50 ℃下烘去水分后，加入冷却至50 ℃的上层固体培养基15 mL ，置28~30 ℃，800~1 000 lx 光照下培养5~6 d ，测定菌含量.标准曲线制作：取标准品1 mL 用上面方法提取DNA 后，用1×TE buffer 分别稀释成5个梯度，每个梯度3个重复，然后分别进行实时荧光PCR ，反应条件同1.7.2. 根据菌含量与C t 值的线性关系建立标准曲线.1.7.4 荧光定量PCR 方法与MPN 法的测定结果比较 选取10个沼泽红假单胞菌样品用荧光定量PCR 反应进行定量. DNA 模板提取方法同1.7.3，荧光定量PCR 条件同1.7.2，同时使用MPN 法[8]对样品进行检测，对两种方法得出的数据进行比较.2 结果与分析2.1 引物的设计根据沼泽红假单胞菌16S rDNA 和类球红细菌gyrB 的特异序列分别设计出具有种水平的特异性引物，用于这两种菌的特异性鉴定. 同时又根据常用光合细菌16S rDNA 的序列设计了通用引物，用于光合细菌的菌含量定量测定. 设计得到的引物序列和目的产物预期大小列于表2.2.2 光合细菌PCR 鉴定技术研究2.2.1 特异PCR 反应条件的确立 分别在退火温度为55~65 ℃和Mg 2+为0.5~1.5 μL 的条件下，应用沼泽红假单胞菌和类球红细菌特异引物对各自模式菌株R. palustris 1.2180T 和R. sphaeroides 1.2182T 基因组DNA 进行PCR 扩增，结果在不同退火温度和Mg 2+浓度条件下，模式菌株都产生了目的产物，因此初步选择特异性高的退火温度65 ℃和Mg 2+浓度0.5 μL 为特异PCR 的反应条件. 在此条件下，分别对各自种内的菌株进行PCR 扩增，参试的3株类球红细菌均产生目的条带(图1-A)，而R. palustris 1.2349基因组DNA 没有扩增产物，因此又以R. palustris 1.2349基因组DNA 为模板，调整退火温度和镁离子浓度，使其出现目标产物，最后确定退火温度60 ℃、Mg 2+加入量0.6 μL 作为沼泽红假单胞菌PCR 方法的反应条件，在此条件下5株沼泽红假单胞菌都扩增出了目的条带(图2-B). 根据以上结果，确定的特异PCR 反应条件为：反应体系(20 μL)：10×buffer2 μL ；dNTPs (10 mmol/L) 1.6 μL ；引物10 μmol/L 0.5 μL ；Taq E (2.5 U/μL) 0.2 μL ；模板DNA 2 μL ；Mg 2+ (25 mmol/L) 0.6 μL (沼泽红假单胞菌)，0.5 μL (类球红细菌)；补足ddH 2O 20 μL.反应程序：95 ℃ 5 min ；95 ℃ 40 s ；沼泽红假单胞菌60 ℃ 40 s ，类球红细菌65 ℃ 40 s ； 72 ℃ 30 s ；30个循环；72 ℃ 10 min.2.2.2 特异PCR 鉴定方法的特异性验证 分别使用沼泽红假单胞菌和类球红细菌的特异引物，在2.2.1确定的PCR 反应条件下，对表1供试菌株PCR 扩增. 结果(图1)显示，目标菌株都产生了目的条带，而其他非目标菌株则没有目的条带产生. 这表明所设计的引物在本实验条件下，具有种水平上的特异性和通用性. PCR 产物经克隆测序，结果在BLAST 比对，与目的序列同源性都达到了100 %，进一步证实了PCR 的特异性.2.2.3 灵敏度测定 以起始浓度为1 µg/µL R. palustris 1.2180T 和R. sphaeroides 1.2182基因组DNA 的10倍系列稀释液为模板，进行PCR 扩增.结果(图略)显示，系列稀释101~104倍的表2 特异引物和通用引物信息Table 2 Information on primers引物种类Primer category引物序列Primer sequence引物来源Origin PCR 产物PCR product R. palustris F 5’-CTGGAAGTCTTGAGTATGGC 16S rDNA 203 bp R5’-AGTAAACCCACTAACGGCTG R. sphaeroidesF5’-GCCTCGGCCAAGACCAACC gyr B 250 bp R5’-GCTCGCCGGTGATGAAGATGGG Universal primer of PSBF5’-TGGTYTGAGAGGATGRYCA *16S rDNA384 bpR5’-CGAATTTCACCTCTACACTCG*Y 代表碱基C 和T, R 代表碱基A 和G Y represents C and T ; R represents A and G70214 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol模板浓度出现了目的产物. 因此，本研究条件下的最低模板浓度即灵敏度为100 pg/µL.2.2.4 PCR鉴定技术在光合细菌产品的应用应用PCR方法与传统方法检测了6个光合细菌样品，所得结果见表3. 在PCR方法鉴定的结果中，用沼泽红假单胞菌特异引物扩增样品DNA，6个样品都有扩增产物出现. 类球红细菌特异引物在3号和4号样品扩增到了条带. 传统分离培养方法测定结果为，1号样品未能分离到光合细菌，3号和4号样品分离到2种光合细菌，2号、5号和6号样品分离到1种光合细菌. 对分离到的菌种的菌落和菌体观察和生理生化实验结果表明，3号和4号样品所分离到的2个菌种分别符合沼泽红假单胞菌和类球红细菌特征；2号、5号和6号样品所分离的菌种符合沼泽红假单胞菌特征.对比两种方法的测定结果可知，除1号样品外，其余5个样品的菌种PCR鉴定结果与传统方法鉴定结果相吻合. 1号样品没有分离到光合细菌的原因可能是样品中另外一种菌(枯草芽孢杆菌)菌含量过多(6×109 CFU/mL)，干扰了光合细菌的分离. 这一结果说明PCR方法的灵敏度高于传统方法，具有很强的抗其他微生物干扰能力，可用来快速、准确地测定含有沼泽红细菌和类球红细菌的产品.2.3 荧光定量PCR研究结果2.3.1 通用引物特异性和通用性验证使用设计的通用引物对光合细菌4个种共10株和15株非光合细菌进行了PCR扩增，结果见图2-A，10株光合细菌都扩增出了目的产物，而对微生物肥料中经常使用的芽孢菌和常出现的大肠杆菌杂菌都则无条带产生(图2-B). 结果表明，该引物对光合细菌常图1 类球红细菌PCR方法(A)和沼泽红假单胞菌PCR方法(B)特异性检验结果Fig. 1 Specificity detection for R. sphaeroides and R. palustris by PCR1. P. polymyxa;2. B. brevis;3. B. japonicum;4. B. thuringiensis;5. B. mucilaginosus;6. B. laterosporus;7. E. coli;8. B. licheniformi s;9. B. pumilus; 10. B. megaterium; 11. P. azotofixans; 12. B. amyloliquefaciens; 13. P. stutzeri; 14. B. subtilis; 15. R.. acidophila; 16. R. capsulatus; 17. R. sphaeroides 1.2182; 18. R. sphaeroides 1.1737; 19. R. sphaeroides 1.2174; 20. R. palustris 1.2180; 21. R. palustris 1.2349; 22. R. palustris 1.2352; 23. R. palustris HN1; 24. R. palustris ACCC981; 25. 50 bp ladder表3 光合细菌产品PCR方法与传统方法检测结果Table 3 Comparison of the detection results between PCR and traditional methods for PSB products样品 SamplePCR法鉴定结果 Results of PCR传统方法鉴定 Results of traditional method R. palustris R. sphaeroides R. palustris R. sphaeroides1+－//2+－+－3++++4++++5+－+－6+－+－“＋”表示检测到该菌; “－”表示没有检测到该菌; “/”表示没有分离到光合细菌“＋” denotes the species determined; “－” denotes the species not determined; “/” denotes photosynthetic bacteria not isolated图2 通用引物在供试菌株中的PCR扩增结果Fig. 2 PCR detection for the bacteria in Table 1 by universal primerA: 1, 50 bp ladder; 2, CK-; 3, R. palustris 1.2180; 4, R. palustris1.2349; 5, R. palustris 1.2352; 6, R. palustris 981; 7, R. palustris HN1; 8, R. sphaeroides 1.2182; 9, R. sphaeroides 1.1737; 10, R. sphaeroides 1.2174; 11, R. acidophila HN2; 12, R. capsulatus 1.2359B: 1, 50 bp ladder; 2,CK+; 3, B. subtilis; 4, B. amyloliquefaciens; 5, B. licheniformis; 6, B. pumilus; 7, B. megaterium; 8, B. thuringiensis; 9, B. mucilaginosus; 10, B. edaphicus; 11, B. laterosporus; 12, P. azotofixans; 13, P. polymyxa; 14, P. cirulans; 15, B. brevis; 16, P. stutzeri; 17, E. coli7035 期关大伟等：光合细菌PCR检测技术的建立与应用用菌种有良好的通用性，又可避免常见的其他非光合细菌的干扰，可用于光合细菌的特异性检测.2.3.2 标准曲线的建立 以已知沼泽红假单胞菌菌含量4.9×108/mL 的样品基因组DNA 系列稀释液为模板，进行real time PCR 扩增，根据各稀释度的C t 值建立标准曲线. 扩增结果(图3)显示，不同浓度的模板均检测到荧光信号的增加，而且扩增产物的融解曲线具有唯一峰值(图略)，表明无二聚体产生，PCR 产物是唯一和特异的. 由表4可见，菌含量在4.9×104~4.9×107/mL 时，同一模板数的3个重复所对应的C t 值极为接近，重现性较好. 菌含量为4.9×103/mL 时，C t 值重复性较差；当菌含量为4.9×108/mL 时，扩增曲线C t 值大于4.9×107/mL (图略)，可能是由于模板浓度过高抑制了PCR 反应的进行.因此去掉4.9×108/mL 和4.9×103/mL 这两个点，以菌含量在4.9×104~4.9×107/mL 的模板制作标准曲线.以C t 值为纵坐标，每毫升菌含量的对数值为横坐标做标准曲线，得到菌含量的对数值与荧光PCR 反应C t 值的线性关系(图4)，二者的回归方程为：y ＝-4.12x +51.52，相关系数为0.998 3，具有较高的相关性，可用于光合细菌含量测定.2.3.3 实时荧光定量PCR 方法与MPN 法的测定结果比较 应用实时荧光定量PCR 方法对10个沼泽红假单胞菌光合细菌的基因组DNA 进行了扩增，结果显示10个产品都产生了扩增曲线，使用2.3.2中的标准曲线方程计算菌含量. 同时，又采用了最大或然数法(MPN)对这些样品进行了计数. 从两种测定方法的结果(表5)可以看出，采用实时荧光定量PCR 法所测得的光合细菌菌含量均高于MPN 所测的菌含量，两种方法所测样品菌含量具有一定相关性，通过计算得其相关系数为0.98 (P ＜0.01)，表明荧光定量PCR 方法能反映出不同光合细菌产品数量的差异.3 讨 论PCR 方法是近年发展起来的快速、灵敏的诊断技术，已在微生物检测方面广泛应用，但PCR 方法在光合细菌的检测鉴定方面尚未见报道. 本文通过GenBank 查找光合细菌的基因序列，经过比较筛选，选择16S rDNA 和gyrB 序列作为靶基因设计特异引物. 16S rDNA 编码基因内部结构由可变区和保守区组成，可根据保守区设计各种细菌的通用引物，也可根据可变区设计特定细菌的特异引物或探针，是较理想的细菌基因分类的靶序列，目前成为细菌鉴别和系统发育分析的金标准[9, 10]. gyrB 基因编码DNA 解旋酶(Gyrase)的B 亚单位，其显著特点是基因进化率快于核糖体基因，其平均碱基替换率是每100万年0.7%~0.8%，而16S rDNA 更是每5000万年1%[11]. 因此，gyrB 基因也非常适合亲缘关系相近细菌的鉴别和分类[12, 13]. 光合细菌在农业方面特别在种植业方面，使用的菌种多为紫色非硫细菌，其中沼泽红假单胞菌和类球红细菌应用最为广泛，本研究以它们为重点，通过设计和验证得到了种水平的特异性引物. 但对少数企业使用的深红红螺菌和嗜酸红假单胞等其他光合细菌菌种，由于未能收集到，或是菌株数量仅为1株(嗜酸红假单胞图3 光合细菌荧光定量PCR 标准曲线扩增图Fig. 3 Amplification of serial dilutions of the PSB 16S rDNA by real time PCR 曲线由左至右代表菌含量分别为4.9×107/mL 、4.9×106/mL 4.9×105/mL 、4.9×104/mL 、4.9×103/mLThe curves represent 4.9×107~4.9×103/mL from left to right, respectively表4 光合细菌标准曲线各菌含量所对应的C t 值Table 4 The Ct of the given PSB population菌含量 Bacterial population [n (cfu)/mL -1]4.9×107 4.9×106 4.9×105 4.9×104 4.9×103重复1 C t 值 C t of repeat 119.9423.6427.9832.1935.19重复2 C t 值 C t of repeat 220.0923.7427.7432.2934.75重复3 C t 值 C t of repeat 319.8523.9327.7432.4435.98平均值 Mean C t19.9623.7727.8232.3135.31图4 光合细菌荧光定量PCR 标准曲线Fig. 4 Standard curve for PSB by real time PCR表5 光合细菌样品MPN 法和荧光定量PCR 扩增定量结果Table 5 Quantitative detection by real time PCR and MPNmethod for PSB products样品Sample PCR 法所测菌含量Population of PSB quantifiedby PCR [n (cfu)/mL]MPN 法所测菌含量Population of PSB quantified by MPN [n (cfu)/mL]1 1.21×109 1.23×1082 1.9×109 3.4×10839.49×108 1.3×1084 1.31×1077.9×1065 2.92×107 2.0×1066 1.75×107 5.4×1067 6.06×1069.21×1058 4.29×105 2.3×1049 1.45×106 2.4×105101.48×1062.4×10570414 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol菌)，无法进行引物的特异性验证，因此没有把它们选为目标菌株.根据特异序列设计的引物从理论上讲与其他属、种、菌株的序列同源性达到100%的概率较低，但是在亲缘关系非常近的菌种之间有的仅存在一两个碱基的差异，此时PCR反应可能会产生假阳性的现象，需要通过优化反应条件提高PCR反应的特异性. 在PCR反应中，退火温度和Mg2+浓度是影响PCR特异性的重要因素，高退火温度和低Mg2+浓度可以提高PCR反应的特异性[14]，因此本实验使用模式菌株对这两个条件进行了优化，确定了高退火温度和低Mg2+浓度的反应条件，从而提高了PCR的特异性. 在此条件下，使用特异引物对7个属18个种共24株微生物肥料中常见光合细菌及其常用的复合菌种的PCR结果表明，本研究建立的PCR鉴定技术，对目的菌株具有较高的特异性和通用性.样品实际测试的结果表明，建立的PCR鉴定技术不仅快速，而且具有较强的特异性和较高的灵敏度，结果准确可靠，具有良好的应用价值.在光合细菌定量研究中，设计了紫色非硫光合细菌的通用引物，用来制作标准曲线和产品检测，这样就不需要对每一种紫色非硫光合细菌都制作光合曲线，使用一条标准曲线就可对不同菌种的样品进行测定，减少了工作量. 但由于该引物是根据16S rDNA设计的，16S rDNA是多拷贝基因，不同种细菌的16S rDNA拷贝数不同，因此使用通用引物所做的标准曲线只能够对使用单一光合细菌菌种的样品进行测定，而不能测定复合菌种的样品.从10个样品的实时荧光定量PCR法和MPN法的测定结果比对可知，实时荧光定量PCR法所测结果要高于MPN 法，其主要的两个原因是：一是MPN法本身的测定结果本身就偏低；二是实时荧光定量PCR法不能区分菌体的死活，造成了所测菌含量偏高.但两种方法所测样品菌含量具有较高的相关性，说明荧光定量 PCR方法能够反映出不同光合细菌产品数量的差异，表明利用荧光定量PCR对光合细菌定量是可行的.荧光定量 PCR技术简便、快捷，劳动量小，不受培养条件的限制，弥补了传统方法的不足，在光合细菌含量测定中具有良好的应用前景.References1 Li JF (李俊峰), Wang ML (王梦亮). The effect of photosynthetic bacteriaon agricultural ecosystem. J Shanxi Agric Sci (山西农业科学), 2002, 30(1): 52~562 Xiong Q (熊琦), Feng JA (冯安吉), Liu JB (刘继彪). Mechanism of PSB’senhancement on growth of spinach. Chin J Appl Environ Biol (应用与环境生物学报), 1995, 5 (Suppl): 194~1963 Wu XP (吴小平), Zheng YT (郑耀通), Cao RB (曹榕彬). Application ofphotosynthetic bacteria as organic fertilizer to soybean field. J Fujian Agric & For Univ Nat Sci Ed (福建农林大学学报自然科学版), 2003, 32 (1): 117~1194 Wang QJ (王秋菊), Cui ZHL (崔站利), Zhang SHL (张少良). Study ofapplying methods and mechanism of photosynthetic bacteria on paddy rice.Chin Agric Sci Bull (中国农学通报), 2006, 22 (1): 176~1785 Chen Q (陈强), Zhang XP (张小平), Li DY (李登煜). Isolation of DNAfrom the root nodule of legume plant. Microbiology (微生物学通报), 2002, 29 (6): 65~686 Sambrook J, Russell DW. Translated by Huang PT (黄培堂). MolecularCloning: A Laboratory Manual. 3rd ed.. Beijing (北京): Science Press (科学出版社), 20027 东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册. 北京: 科学出版社, 2001.25, 29, 364~3698 Jiang X (姜昕), Cao FM (曹凤明), Fan H (樊蕙), Li L (李力), Han YF(韩永峰), Rao HD (饶汉东). NY 527-2002, Inoculant of Photosynthetic Bacterium. Beijing(北京): Standards Press of China (中国标准出版社), 20029 Christensen H, Nordentoft S, Olsen JE. Phylogenetic relationships ofSalmonella based on rRNA sequences. Int J Syst Bacteriol, 1998, 48 (2): 605~61010 Wang RF, Cao WW, Cerniglia CE. Phylogenetic analysis and identificationof Shigella spp. by molecular probes. Mol Cell Probes, 1997, 11 (6): 427~43211 Zhou J, Thompson DK. Challenges in applying microarrays toenvironmental studies. Curr Opin Biotechnol, 2002, 13 (3): 204~20712 Fukushima M, Kakinuma k, Kawaguchi R. Phylogenetic analysis ofSalmonella, Shigella and Escherchia coli strains on the basis of the gyrB gene sequence. Clin Microb, 2002, 40 (8): 2779~278513 Wang ZG (王振国), Liu HP (刘和平), Liu JH (刘金华). Identification ofBacillus cereus by GyraseB gene with PCR method. J Jilin Agric Univ (吉林农业大学学报), 2006, 28 (6): 671~67314 Dieffenbach CW, Dveksle GS. Translated by Huang PT (黄培堂). PCRPrimer: A Laboratory Manual. Beijing (北京): Science Press (科学出版社), 1998. 37。
犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须毛癣菌多重PCR检测方法的建立及初步应用
犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须毛癣菌多重PCR检测方法的建立及初步应用钱晶;刘军;刘国芳;王永山;欧阳伟;王晶宇;姚凌云;吴世妍;王晓丽;潘群兴;夏兴霞;诸玉梅【摘要】宠物浅表皮肤真菌病主要由犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须毛癣菌感染引起.本研究根据3种真菌基因内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)区域的序列差异设计4条引物,通过优化多重PCR反应条件,建立了一种可同时快速检测这3种真菌的多重PCR,同时对其特异性、灵敏性、重复性进行分析.结果显示,建立的多重PCR方法对犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须毛癣菌基因组DNA均可扩增出特异性预期片段,条带大小分别为286、596、188 bp;最低检测限(灵敏性)分别为12.6、8.8、13.6 pg/μL;被检测的6份人工模拟样品扩增结果准确.应用该多重PCR方法检测27份人临床皮屑样品和43份宠物犬、猫毛发样品,结果显示阳性检出率分别为74.07％(20/27)和83.72％(36/43);采用常规真菌分离培养法从阳性样品中获得10株致病性真菌,分离率为17.86％ (10/56);两神检测方法的种属鉴定结果表明多重PCR法优于常规方法.本研究建立的多重PCR检测方法简便、特异、灵敏,可同时对宠物浅表真菌病原作出快速诊断与鉴别.【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2019(027)001【总页数】7页(P42-48)【关键词】真菌病;犬小孢子菌;石膏样小孢子菌;须毛癣菌;多重PCR【作者】钱晶;刘军;刘国芳;王永山;欧阳伟;王晶宇;姚凌云;吴世妍;王晓丽;潘群兴;夏兴霞;诸玉梅【作者单位】江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程重点实验室,南京210014;南京大学医学院附属鼓楼医院,南京210008;江苏农林职业技术学院畜牧兽医学院,镇江212400;江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程重点实验室,南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程重点实验室,南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程重点实验室,南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程重点实验室,南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程重点实验室,南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程重点实验室,南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程重点实验室,南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程重点实验室,南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程重点实验室,南京210014【正文语种】中文【中图分类】S852.661随着社会的进步、经济发展和人们生活水平的提高，宠物饲养量在全国快速增加，目前我国宠物犬约有1.5亿只，宠物猫约有3000万只[1]。
松江湿地沉积物细菌T—RFLP分析中PCR体系的建立与优化
松江湿地沉积物细菌T—RFLP分析中PCR体系的建立与优化松江湿地为松花江河漫滩地，地势平缓，依托松花江呈东西向带状分布，包括松花江滩涂湿地和支流河口湿地在内的广阔湿地资源，是全国面积最大的原生态城市湿地。
湿地内植物区系组成多样，生物多样性丰富，是黑龙江省哈尔滨市重点保护、开发、建设的生态文明区，也是近年来较重视的生态研究区。
微生物是湿地生态系统的重要组成部分，在湿地养分的生物地球化学循环中往往起着核心作用，湿地沉积物中的微生物以细菌为主，细菌能参与湿地污染物和有毒物质的降解过程，有助于保持湿地生态系统的平衡和提高湿地自净能力。
松江湿地的内部环境和结构较复杂，沉积物中蕴含着丰富的微生物资源，其细菌组成结构能良好地反应湿地环境因子的变化，深层次理解松江湿地生态系统结构和功能，而建立优化PCR体系是利用T-RFLP技术分析微生物资源的前提条件。
末端限制性片段长度多态性（terminal restric-tion fragment length polymorphism，T-RFLP），又称为16S rRNA基因的末端限制性片段（terminal re-striction fragment，TRF）分析技术，是建立在PCR基础之上研究微生物多样性的一种新兴分子生物学研究方法，不依赖于培养即可对微生物进行群落结构分析，具有非常广阔的应用前景。
T-RFLP技术具有快速、高度的可重复性、良好的可操作性和产生大量的可操作单元（OTUs），能够与数据库建立直接联系，用于微生物菌种鉴定、群落的对比和多样性分析。
本研究对在松江湿地沉积物细菌T-RFLP分析过程中，PCR扩增体系的相关影响因素进行优化和筛选，建立适于湿地沉积物的简单、高效和稳定的PCR反应体系，为进一步开展沉积物细菌群落结构研究奠定基础。
1材料与方法1.1材料与试剂沉积物于2012年8月采自松江湿地哈尔滨段，采集深度为0～20cm，将沉积物用无菌塑料袋密封带回实验室，-20℃冷藏。
多重荧光定量PCR测定疟原虫方法建立
多重荧光定量PCR测定疟原虫方法建立目的建立可同时检测四种疟原虫的多重荧光定量PCR方法。
方法PCR 扩增四种疟原虫目的片段，克隆并构建标准质粒，进行梯度稀释。
体系按浓度加入五重引物探针，对临床四种疟原虫阳性血样及单一腺病毒和肺炎支原体阳性血样、人基因组进行特异性检测。
将本地区优势虫种恶性疟及间日疟阳性血样混合并检测。
每个反应做一式三份验证重复性。
检测标准品梯度浓度，获得体系最低检测限。
结果成功构建四种疟原虫标准质粒。
对20份样本进行检测，其中15份恶性疟，3份间日疟，1份三日疟，1份卵形疟，与原有确证结果一致。
对单一腺病毒及肺炎支原体阳性血样、人基因组检测结果均为阴性。
恶性疟及间日疟阳性血样混合检测显示3条特异性扩增曲线。
三个复孔的变异系数在0.17～4.96之间。
恶性疟可检测到102 copies/mL，间日疟、三日疟、卵形疟可检测到103 copies/mL。
结论建立五重荧光定量PCR检测四种疟原虫特异性及重复性均较好，灵敏度高，可用于疟原虫快速筛选及分型鉴定。
[Abstract] Objective To establish the multiple fluorescence quantitative PCR measure to detect four types of plasmodium at the same time. Methods Target fragments of four types of plasmodium were extended by PCR，the standard plasmid was cloned，constructed and diluted by gradient. Five primers and probes were added into the system according to the concentration and the clinical four plasmodium positive blood sample，single adenovirus and mycoplasma pneumonia positive blood sample as well as human gene was detected specifically. The falciparum malaria and tertian malaria positive blood sample caused by the local superior plasmodium were mixed and detected. Each experiment was performed for three times to validate the repetitiveness. The gradient concentration of the sample was detected and the lowest detection limitation was achieved. Results The standard plasmids of four plasmodiums were successfully constructed and 20 samples were detected. 15 samples were falciparum malaria and 3 samples were tertian malaria，1 sample was quartan malaria and 1 sample was ovale malaria，which was in accordance with the original validated results. The results of detection of single adnovirus and mycoplasma pneumonia positive blood sample and human gene were negative. 3 specifically extended curves were presented by the mixed detection of falciparum malaria and tertian malaria positive blood sample. The variable coefficients of the three duplication holes were within 0.17-4.96. Falciparum malaria was detected to be 102 copies/mL and tertian malaria，quartan malaria as well as ovale malaria was detected to be 103 copies/mL. Conclusion The established five fluorescence quantitative-PCR in the detection of four types of plasmodium has good specificity and repetitiveness as well as high sensitivity，which can be used in the quick screening and type identification of plasmodium.[Key words] Multiple fluorescence quantitative-PCR；Plasmodium；Mosquito-borne diseases；Malaria疟疾是由蚊子传播的一种寄生虫病，由带有疟原虫的雌性按蚊叮咬人体而传染，其已经成为全球热带、亚热带最严重的公共卫生问题之一[1]。
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蚜虫共生细菌多重PCR检测体系的建立
蚜虫是一种世界广泛分布的昆虫，在作物产量和农业经济损失中起着重要的作用。
蚜
虫也是一种重要的害虫，常常对作物进行掠食和传播病原体，导致作物减产和病害的传播。
虽然传统的化学农药可以控制蚜虫的数量，但由于其潜在的危害和环境污染问题，越来越
多的农民和科学家正在寻找替代方法来控制蚜虫。
共生细菌是一种与蚜虫共生共存的微生物，通过提供营养和抵制病原体的侵袭来帮助
蚜虫生存。
这些共生细菌可以通过PCR检测来快速鉴定和定量，以评估其对蚜虫的影响。
本研究旨在建立一种多重PCR检测体系，用于检测蚜虫共生细菌。
我们收集了不同种类蚜虫的标本，并从中提取了DNA样品。
接下来，我们设计了一对
引物来扩增共生细菌的16S rRNA基因。
这些引物能够特异性地扩增共生细菌的DNA片段，而不会扩增蚜虫的DNA片段。
然后，我们确定了PCR反应的最佳条件。
我们尝试了不同的反应温度、引物浓度和循
环数，并通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物的大小和纯度。
最终，我们确定了最佳的PCR反应条件，以获得清晰、特异的扩增产物。
接着，我们验证了该PCR体系的特异性。
我们收集了不同种类蚜虫的标本，并使用PCR方法进行检测。
结果显示，只有带有共生细菌的蚜虫样本才产生了特定的PCR扩增产物，而不含共生细菌的蚜虫样本没有扩增产物。
我们比较了这种多重PCR体系和传统的细菌培养方法。
我们从蚜虫体内分离出了共生
细菌，并使用细菌培养和PCR检测方法进行比较。
结果显示，PCR方法能够快速、准确地
检测共生细菌的存在，而细菌培养方法需要较长的时间和复杂的实验操作。
本研究成功地建立了一种多重PCR检测体系，用于检测蚜虫共生细菌。
这种方法具有
快速、准确、特异性强的优点，并有望成为控制蚜虫的有效手段。
未来的研究可以进一步
优化该PCR体系，并将其应用于实际的农业生产中。