细胞重组慢病毒的步骤及应用
慢病毒使用操作指南
慢使用操作指南慢使用操作指南1.慢简介1.1 定义：慢是一种特殊的，能够在细胞中长期存活并进行复制。
1.2 用途：慢广泛应用于基因转导、基因敲除和基因表达等实验研究中。
2.慢使用前准备工作2.1 实验室准备工作2.1.1 实验室空间准备：确保实验室内有足够的操作空间和合适的消毒设备。
2.1.2 材料准备：准备好所需的培养基、细胞培养物、慢载体等。
2.1.3 设备准备：确保离心机、冰箱等设备正常工作，并准备好相关的仪器和器材。
2.2 人员准备工作2.2.1 人员培训：对参与慢操作的人员进行培训，了解操作步骤和安全风险。
2.2.2 个人防护：提供必要的防护装备，如实验服、手套、面罩等。
3.慢操作步骤3.1 细胞培养3.1.1 细胞培养物准备：根据实验需求选择合适的细胞培养物，并进行细胞的预处理和培养。
3.1.2 细胞密度调整：根据实验要求，调整细胞培养物的密度，以保证细胞的正常生长。
3.2 慢感染3.2.1 慢载体注射：将慢载体注射到培养好的细胞中。
3.2.2 感染条件控制：根据实验需求，控制慢感染的时间、浓度和温度等条件。
3.3 细胞培养和检测3.3.1 细胞培养：将感染好的细胞进行培养，并观察细胞的生长状态。
3.3.2 细胞检测：使用相关实验方法，对感染细胞进行检测和分析。
4.实验安全措施4.1 操作环境控制：确保实验室内通风良好，避免慢的扩散和污染。
4.2 废液处理：将产生的废液经过正确处理，避免对环境和人体造成污染和伤害。
4.3 事故应急处理：在发生事故或意外情况时，立即采取应急措施，并及时报告相关人员。
5.附件本文档所涉及的附件，包括但不限于实验记录表格、实验数据文件等。
6.法律名词及注释6.1 慢：指一种具有长周期和潜伏期的。
7.结束语感谢您阅读本文档，如有任何疑问或意见，请随时与我们联系。
慢病毒转染步骤
转染法步骤：
1分至适宜浓度的细胞到六孔板中，次日细胞应30%~50%融合
2.第二天，吸掉板中的生长培养基并加入新的含聚凝胺的培养基，加入适当数量的病毒于细胞中（见“决定慢病毒效价”部分），每孔溶液终体积为3ml
注意：考虑到细胞在自旋过程中不一定能完全被培养基覆盖，不推崇减少六孔板中的溶液终体积。
调整孔中聚凝胺的终浓度为8mg/ml.通过涡旋六孔板轻轻地混合培养基，病毒以及聚凝胺。
3.为减少自旋-转染过程中悬浮物质的形成以及孔与孔之间液体接触的情况发生，用无菌微孔密封膜封闭六孔板（直接盖在板上），封闭好后，再在密封膜上加上一层未经灭菌的密封箔，最后盖上六孔板盖。
4.在标准的组织培养离心机中，37°C，2250rpm（1200g）条件下自旋-转染细胞60min.
5.一自旋-转染后就移走密封膜和密封箔，将孔中原有的培养基换为新鲜的生长培养基（每孔2ml就足够）
6.转染24h后，吸掉孔中的培养基并每孔加入新鲜的含有嘌呤霉素的2ml生长培养基。
注意：嘌呤霉素的浓度应被每个细胞株充分利用，一般规定在1-5μg/mL
7.进一步的培养时间主要取决于细胞株的类型以及转染后的实验分析。
通常，嘌呤霉素筛选细胞需要大约48h。
下面推荐的是结合给定的细胞株和分析实验来得到的嘌呤霉素筛选
时间
>转染后实验分析嘌呤霉素筛选细胞时间> mRNA knockdown (qPCR) 2+ days
> Protein knockdown (Western) 3+ days
> Phenotypic assay 表型分析3+ days
8.检测目的感染细胞的表面分子。
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理
慢病毒（lentivirus）是一类病毒，属于反转录病毒的一种。
慢病毒可以作为基因转移的工具，被广泛应用于基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域。
慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，将外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。
慢病毒载体构建的原理主要包括以下几个步骤：
1. 选择适当的慢病毒载体，慢病毒载体通常由慢病毒的基因组和外源基因组成。
在构建慢病毒载体时，需要选择适当的慢病毒载体，通常选择已经经过改造的慢病毒载体作为基础，然后将需要表达的外源基因插入到载体中。
2. 插入外源基因，将需要表达的外源基因插入到慢病毒载体的适当位置。
通常采用限制性内切酶切割和连接酶连接的方法，将外源基因与慢病毒载体连接起来，形成重组的慢病毒载体。
3. 构建重组慢病毒载体，将插入了外源基因的慢病毒载体导入到适当的宿主细胞中，利用宿主细胞的复制和转录机制，使重组慢
病毒载体在宿主细胞中稳定复制和表达外源基因。
4. 验证慢病毒载体的稳定性和表达效果，对构建的重组慢病毒
载体进行验证，包括验证慢病毒载体在宿主细胞中的稳定性和外源
基因的表达效果。
通常采用PCR、Western blot等方法对慢病毒载
体进行验证。
总之，慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将
外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，
使外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。
这一技术在基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域具有重要的应用前景，对于疾病治疗
和生命科学研究具有重要意义。
慢病毒生产及使用操作技巧介绍材料
慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。
二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附录）2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、包装细胞293T细胞的培养（一）293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。
3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL 37 ℃预热的10％DMEM，用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10％DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。
计数板上共4 大格，每大格16 小格。
计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。
4、细胞离心，1000rpm，5min。
慢病毒感染细胞实验原理及步骤
慢病毒感染细胞实验原理及步骤1. 实验原理慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。
对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。
所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一，并且正在获得越来越广泛的应用。
2. 主要材料细胞培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、青霉素-链霉素溶液、慢病毒、Polybrene助转染试剂3. 主要试剂配制（1）PBS磷酸盐缓冲液：PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL，调pH7.2，121℃，30min，高压灭菌，4℃保存备用。
（2）细胞生长培养液：临用前根据需要在培养基中加入10%胎牛血清，再按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 ug/mL，置于4℃冰箱保存。
4. 实验步骤（1）胰酶消化细胞，无血清培养基重悬，调整细胞密度为0.5~1×105/ml（根据情况酌情调整），每孔200ul细胞悬液接种至24孔板，培养箱培养过夜。
次日进行慢病毒感染，此时细胞的融合度约为70%左右。
（2）准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用瞬时离心机离心20秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。
根据实验按照MOI准确计算慢病毒用量，将其稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。
悬浮细胞慢病毒转染步骤及方法
悬浮细胞慢病毒转染步骤及方法
实验材料与方法
一、细胞培养人红白血病细胞Kasumi-1，常规培养使用含10% FBS(GIBCO)的RPMI 1640 培养基（Hyclone）（含1.5 mg/L-Glutamine，100 U/mL Penicillin，100 μg/mL Streptomycin) 中，37ºC 5% CO2饱和湿度培养箱中培养。
二、病毒侵染实验材料及试剂
DMEM培养基+ 10% FBSRPMI 1640培养基+10% FBSD-Hank’s Solution96孔板（Corning）24孔板（Corning）Lentivirus-病毒液（GenePharma，1×108 TU/mL）步骤1. 稀释病毒：稀释液（靶细胞维持液培养基）400 μL + 终浓度5 μg/mL Polybrene，将慢病毒原液按1:20、1:10、1:5 加入到稀释液中；
2. 24-well，按4×105 cells/well（根据细胞种类调整），1000 RPM 3min，取细胞沉淀。
将Step 1 中各份病毒稀释液分别与每份细胞沉淀重悬，同时建立对照（blank、negative），37°C 5% CO2中培养；
3. 12~24h 后离心移去细胞侵染后的病毒液，加入0.5 mL 完全培液，37°C 5% CO2过夜
4. 根据细胞状态和类型，如果必要分出1/3~1/5，加入0.5 mL完全培养，继续培养24~48h；荧光倒置显微镜下观察结果。
慢病毒转染原理
慢病毒转染原理慢病毒转染是一种常用的基因转染方法，适用于长期表达外源基因的研究。
慢病毒转染原理主要是利用慢病毒载体将外源基因导入宿主细胞，并将其整合入宿主细胞基因组中，从而实现外源基因的稳定表达。
本文将从慢病毒转染的原理、步骤和应用等方面进行介绍。
慢病毒转染原理。
慢病毒转染的原理主要包括以下几个步骤，首先，将外源基因插入慢病毒载体中，构建成慢病毒表达载体；然后，将慢病毒表达载体转染至包装细胞中，利用包装细胞的辅助病毒蛋白包装慢病毒颗粒；最后，将包装好的慢病毒颗粒用于感染目标细胞，外源基因被整合入宿主细胞基因组中，实现稳定表达。
慢病毒转染步骤。
慢病毒转染的步骤包括慢病毒载体构建、包装细胞培养、病毒颗粒包装和目标细胞感染等。
首先，构建慢病毒表达载体时，需要选择合适的慢病毒载体和适当的启动子，将外源基因插入载体中，并经过序列分析和酶切验证。
其次，包装细胞的培养和病毒颗粒包装是慢病毒转染的关键步骤，需要选择合适的包装细胞系，转染慢病毒表达载体并培养包装细胞，最终收集包装好的慢病毒颗粒。
最后，利用包装好的慢病毒颗粒感染目标细胞，实现外源基因的稳定表达。
慢病毒转染应用。
慢病毒转染在基因功能研究、基因治疗和细胞工程等领域具有广泛的应用。
在基因功能研究中，可以利用慢病毒转染实现基因敲除、过表达和靶向修饰等，进而研究基因在生理和病理过程中的功能。
在基因治疗中，慢病毒转染可以用于治疗遗传性疾病、肿瘤和传染病等，为基因治疗提供了重要的技术支持。
在细胞工程中，慢病毒转染可以用于改良细胞系，提高细胞的表达稳定性和产量，满足生物制药和工业生产的需要。
总结。
慢病毒转染是一种重要的基因转染方法，具有稳定、高效、广泛应用等特点。
通过慢病毒转染，可以实现外源基因在宿主细胞中的稳定表达，为基因功能研究、基因治疗和细胞工程等领域提供了重要的技术支持。
因此，深入理解慢病毒转染的原理和步骤，对于开展相关研究具有重要的意义。
慢病毒转染操作
一、慢病毒转染贴壁细胞实验方法
1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×10^5/孔铺到24孔板中。
使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10^5/孔左右。
2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。
37℃孵育。
3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene。
4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
5、继续培养。
如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。
如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。
如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。
二、慢病毒转染悬浮细胞实验方法
1、在2×10^5/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。
37℃孵育。
或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。
2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。
3、继续培养3-4天。
中间视细胞生长情况可传代或换液。
慢病毒纯化
慢病毒纯化
慢病毒纯化是指从慢病毒病毒培养物中分离和纯化出慢病毒颗粒的过程。
这个过程通常包括以下步骤：
1.细胞培养：首先，需要将慢病毒所感染的细胞系培养到适
当的细胞密度和病毒扩增时间，以确保足够的病毒产量。
2.细胞裂解：将培养的细胞收集并经过离心等方法分离，然
后使用裂解缓冲液裂解细胞，释放出细胞内的慢病毒。
3.离心和过滤：经过细胞裂解后，样品需要进行离心，以去
除细胞碎片和核酸残余物。
然后，可以使用过滤器对澄清
的上清液进行过滤以去除大颗粒物质。
4.病毒浓缩：慢病毒通常是低浓度的，因此需要进行浓缩。
可以使用超滤、离心和沉淀等方法，将病毒颗粒从大量液
体中浓缩到较小的容量中。
5.梯度离心：为了进一步纯化病毒，可以使用梯度离心技术，
如葡聚糖梯度离心或离心浓缩。
这个过程可将纯化的病毒
与细胞碎片、蛋白质和其他污染物分离开来。
6.病毒沉淀：经过梯度离心后，可以进行病毒的最终沉淀。
使用离心来将病毒沉淀到盘底或在离心管底端形成浓缩的
沉淀。
7.再悬浮：将病毒沉淀用缓冲液再悬浮，以便进行后续实验
应用。
在整个慢病毒纯化的过程中，必须遵守基本的生物安全措施，
并使用无菌操作、合适的缓冲液和处理设备。
每一步之间的温度、离心速度和离心时间等参数也需要根据具体的实验条件和病毒类型进行优化和调整。
慢病毒使用操作指南
慢病毒使用操作指南慢病毒是一种常用的实验工具，广泛应用于细胞和分子生物学研究。
本文档旨在提供慢病毒使用的操作指南，帮助研究人员更好地利用慢病毒进行实验研究。
第一部分：慢病毒基本知识1. 什么是慢病毒？慢病毒是一种具有RNA基因组的病毒，属于反转录病毒。
它能够将自身的RNA基因组逆转录成DNA，再与宿主细胞的基因组融合，长期稳定地存在于宿主细胞中。
2. 利用慢病毒进行基因转染的优势相比其他常用的基因转染方法，慢病毒具有以下优势：- 高效性：慢病毒能够高效地转染多种类型的细胞，包括非分裂细胞。
- 长期稳定性：慢病毒转染的基因能够长期稳定地存在于宿主细胞中。
- 遗传稳定性：慢病毒转染的基因可以遗传给后代细胞，因此适用于长期实验研究。
第二部分：慢病毒使用的关键步骤1. 选择合适的慢病毒载体慢病毒载体是慢病毒的基础构建单元，其中包含转录启动子、报告基因等必要的元件。
根据实验需要选择合适的载体。
2. 包装慢病毒慢病毒的包装是将慢病毒载体与包装载体共转染至特定细胞株，通过包装载体中的包装酶，将慢病毒的RNA基因组逆转录成DNA，形成可复制的慢病毒。
3. 提取慢病毒经包装后的细胞培养基中含有包装好的慢病毒。
可通过超速离心等方法，将细胞培养物离心，提取慢病毒。
4. 病毒滴定病毒滴定是用来确定病毒滴度的重要步骤。
通过适当稀释提取的慢病毒，将其感染指定细胞株，计算出感染单位的浓度。
5. 慢病毒感染及筛选将提取的慢病毒添加至目标细胞中，通过细胞培养和筛选，筛选出具有所需基因的细胞株。
第三部分：慢病毒使用的注意事项1. 安全操作慢病毒具有一定的传染性，进行实验时需要遵守生物安全操作规范，佩戴一次性手套、口罩等个人防护装备，避免直接接触慢病毒。
2. 避免交叉感染实验室中使用慢病毒时，应尽可能避免交叉感染。
定期对实验室环境进行消毒，使用一次性材料，避免共享器械等措施可以减少交叉感染的风险。
3. 合理控制病毒滴度对于不同类型的细胞，需要确定合适的病毒滴度，以避免过度感染或感染不足的情况。
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细胞转染慢病毒的合成步骤及应用1、安全性◆删除了全部HIV-1 的编码基因，在介导目的基因的表达时，没有任何HIV-1 蛋白的表达；◆对5’和3’ LTR 分别进行了删除改造，5’LTR 缺失U3，换上RSV enhancer/promoter，使载体的复制不再依赖Tat；3’LTR 删除U3，使其不再具有启动/ 增强活性，成为自灭活（self- inactivating, SIN）载体；◆病毒包装必需的 3 个蛋白Gag/Pol、Rev、VSV-G（代替HIV-1 的Env）分别独立放置在3 个质粒上（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），且互相之间没有任何同源序列，大大降低了复制型慢病毒（RCL）的产生几率；◆与MuLV 等逆转录病毒载体相比，慢病毒载体的整合更偏向于宿主细胞基因组的基因表达活跃区，激活沉默的原癌基因的几率可能比逆转录病毒载体低；◆慢病毒载体未发现有致肿瘤活性，全世界有 4 千万人感染了HIV-1，发生的整合事件不计其数，但未出现一起致瘤事件，而MuLV 等逆转录病毒载体有致瘤活性；◆慢病毒的LTR 的转录激活能力低于逆转录病毒，激活原癌基因能力也较低。
2、慢病毒制备具体步骤制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其三种辅助包装原件载体质粒，分别进行高纯度无内毒素抽提，用转染试剂RNAi-Mate 共转染293T 细胞，转染后6h 更换为完全培养基，培养72h 后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩，得到高滴度的慢病毒浓缩液，用于感染目的细胞。
感染后的目的细胞可以通过慢病毒载体上的抗性基因和荧光融合蛋白进行筛选。
细胞培养活细胞计数用无血清培养基把细胞悬液稀释到200 ～2000 个/mL（一般稀释倍数为100 倍），在0.1 mL 的细胞悬液中加入0.1 mL 的0.4%的台盼兰溶液。
轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。
活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。
细胞株的冻存取培养2 ～3 天生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×106～2×107/mL。
2) 在1 mL 细胞冻存管中加入0.5 mL 细胞悬液，0.4 mL 小牛血清和0.1 mL 二甲基亚砜( 或甘油)，混匀后密封。
置4°C 1h，-20°C 2h，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后浸入液氮中。
细胞复苏1) 从液氮罐中取出细胞冻存管，应带防护眼睛和手套。
2) 迅速放入盛有37°C水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。
3)2000 rpm，3min 离心。
4) 用70% 酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出上清液，加3 mL 含10% FBS 的DMEM 培养基，吹打均匀，加入到6 cm 培养皿中，置温箱培养。
5) 次日更换一次培养液后再继续培养。
细胞传代1) 弃去旧培养液，加入5 mL 灭菌PBS 溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS 溶液。
2) 加入2 mL 胰酶消化液，消化1 ～2 min 直到细胞完全消化下来。
3) 加入含10% 胎牛血清和100 U/mL 双抗的DMEM 培养基5mL，用刻度吸管吹打数次，将瓶壁上的细胞冲洗下来。
4) 混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。
病毒包装1) 293T 细胞在10 cm 培养皿中培养至80~90% 融合时，接种15cm 培养皿；2) 倾去培养液，用1 mL D-Hank’s solution 洗涤细胞两次；3) 加入1 mL Trypsin-EDTA solution, 混匀后,37ºC 放置2~3min;4) 小心吸去胰酶溶液，加入2 mL 含10% FBS 的DMEM 培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液；5) 将细胞悬液接种15 cm 培养皿，加入18 mL 含10% FBS 的DMEM 培养液，混匀后37ºC 5% CO2培养过夜；6) 在一支无菌的5 mL 离心管中加入1.5 mL 无血清DMEM，按比例加入含客户目的序列的穿梭质粒和包装质粒（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），混匀，取另一支无菌的 5 mL 离心管，加入1.5mL 无血清DMEM，再加入300 μL RNAi-Mate，混匀，室温放置5min 后将两管混合，室温放置20~25min；7) 除去15 cm 培养皿中的培养液，加入8 mL 无血清的DMEM 培养液；8) 将转染混合物逐滴加入15 cm 培养皿中，轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物，在37ºC 5% CO2培养箱中温育4~6h；9) 吸弃转染液，加入18 mL 含10% FBS 的DMEM 培养液。
37ºC 5% CO2继续培养72h。
病毒收集1) 将培养皿中细胞上清液吸到50 mL 离心管中，4ºC，4000rpm，4 min；2) 低速离心后，将离心管上清液倒入50 mL 注射器内，用0.45μm 过滤器过滤；3) 滤液在离心机中进行超速离心，4ºC ，20000 rpm，2h；4) 将浓缩液收集分装至出货管中；5) 分装的病毒液贴上标签，-80 ºC 冰箱保存。
病毒滴度检测1) 293T 细胞在10 cm dish 中培养至80~90% 融合时，弃去培养液，用3 mL D-Hank’s solution 洗涤细胞两次；2) 加1 mL Trypsin-EDTA solution，混匀后，小心吸去胰酶溶液，37ºC 放置3~5min；3) 再加入2 mL 含10% FBS 的DMEM 培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液；4) 按3×104细胞/ 孔的浓度接种96 孔板，混匀后于37ºC 5% CO2培养24h；5) 将慢病毒原液10 μL，用10% FBS 的DMEM 培液十倍稀释3~5 个梯度（根据细胞状态，如有必要可加入终浓度为5 μg/mL 的Polybrene）；6) 吸去96 孔板中的培养液，每孔加入100 μL 稀释的病毒液，同时设立空白对照组，于37ºC 5% CO2培养24h；7) 吸弃96 孔板中的稀释病毒液，每孔加入100 μL 10% FBS 的DMEM 培液，（根据细胞状态，如有必要可分出1/3~1/5）于37ºC 5% CO2继续培养72h；8) 通过荧光显微镜或FACS 计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度。
（通过不同的检测方法，滴度会有差异，并请在试验过程中注意生物安全要求。
）细胞转染慢病毒具体方法及步骤Lentivirus 在细胞水平使用GenePharma 提供的重组Lentivirus 颗粒是以VSV-G 膜蛋白包裹，从而大大增加了病毒感染谱，但对不同组织细胞亲嗜性仍有差别，因此，有必要在使用Lentivirus 颗粒之前请查阅有关文献，了解Lentivirus 对靶细胞的亲嗜性、感染复数（MOI 值，MOI 是multiplicity of infection 的缩写，含义是感染时病毒与细胞数量的比值，没有单位，其隐含的单位是pfu number/cell。
）及体内（in vivo）注射所需的病毒量，若无相应文献支持，则需要检测病毒对靶细胞的亲嗜性。
* MOI 的测定: 其原理是基于病毒感染细胞是一种随机事件，遵循Poisson 分布规律，可计算出感染一定比例的培养细胞所需的感染复数（MOI）。
其公式为：P = 1- P(0) ,P(0) = e-m 或m = -InP（0）。
P = 被感染细胞的百分率P(0)= 未被感染细胞的百分率m = MOI 值例如，如果要感染培养皿中99% 的培养细胞，则：P(0) = 1% = 0.01 m = -In(0.01)= 4.6 pfu/cell。
病毒滴度复核（有限稀释法测定）1) 滴度检测前一天，对293T 细胞传代，96 孔板每个孔加入约0.5~10×103个细胞，体积100 μL；2) 第二天，准备7~10 个无菌EP 管，在每个管中加入90 μL 的新鲜完全培养基（高糖DMEM+10% FBS）；3) 取待测定的病毒原液10 μL 加入到第一个管中，轻轻混匀后，取10 μL 加入到第二个管中，然后依次操作直到最后一管；4) 选取所需的细胞孔，吸弃90 μL 培养液，然后将稀释好的病毒液，从低浓度到高浓度依次加入，放入37°C 5% CO2培养箱中培养；5) 48h 后，每孔加入100 μL 新鲜培养液，小心操作，不要吹起细胞；6) 3~4 天后，观察荧光表达情况，正常情况下，荧光细胞数随稀释倍数增加而相应减少，计数最后两个含有荧光细胞的孔中的荧光细胞个数，将得到的数值除以各自相应的稀释倍数，即可计算出病毒原液的滴度值（通常以倒数第二个孔中的读数值更为准确）。
7) 注释：①病毒滴度测定结果还依赖于本身实验系统，如293T 细胞代数、细胞状态、荧光显微镜品质、相关实验试剂及实验人员操作技能，因此不同实验室测得滴度数值会有所差异（1~5 倍），但基本不会影响正常实验流程；②病毒滴度（BT = TU/mL，transducing units) 计算公式：TU/μL= (P × N / 100 × V) ×1/DF，P = % GFP+ cells N = 转染时的细胞数，V = 每孔加入病毒稀释液体积（μL）DF = 稀释因子（dilution factor）= 1 (undiluted)、10-1 (diluted 1/10)、10-2 (diluted 1/100)。
靶细胞感染预实验1) 实验前一天分别接种3~5×103个靶细胞于96 孔培养板每孔中,所加培养基体积为100 μL, 不同种类的细胞生长速度有所异, 为保证有较好的实验结果，进行病毒感染时细胞的融合率40%~60%,因为Lentivirus 表达时间较长，故在进行感染时细胞接种不宜过密；2) 干扰预试验共分为二组，每组均有不同梯度的MOI 值。
第一组为正常情况下感染，也就是在完全培养基中直接加入病毒。
第二组为感染时添加5 μg/mL 的Polybrene，Polybrene 在大部分细胞中可以有效的提高感染效率;3) 感染前为细胞换液，吸去细胞上清，按不同的分组情况加入所需的培养基90 μL，每组三个孔;4) 准备2 个无菌的EP 管，吸取10 μL 的1×108 TU/mL 的病毒（预先从-80°C中取出，冰浴溶解）加入到第一个管子中，轻柔混匀，勿产生泡沫。
同样从第一管中吸取10 μL 的病毒到第二管中，混匀。
这样就得到了三个不同梯度的病毒：原液,10 倍稀释，100 倍稀释;5) 将三个不同梯度的病毒液，各取10 μL 加到每组的三个孔中，计算可知，三个孔的MOI 分别为100，10，1。