细胞重组慢病毒的步骤及应用

细胞转染慢病毒的合成步骤及应用

1、安全性

◆删除了全部HIV-1 的编码基因，在介导目的基因的表达时，没有任何

HIV-1 蛋白的表达；

◆对5’和3’ LTR 分别进行了删除改造，5’LTR 缺失U3，换上RSV enhancer/promoter，使载体的复制不再依赖Tat；3’LTR 删除U3，使其不再具有启动/ 增强活性，成为自灭活（self- inactivating, SIN）载体；

◆病毒包装必需的 3 个蛋白Gag/Pol、Rev、VSV-G（代替HIV-1 的Env）分别独立放置在3 个质粒上（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），且互相之间没有任何同源序列，大大降低了复制型慢病毒（RCL）的产生几率；

◆与MuLV 等逆转录病毒载体相比，慢病毒载体的整合更偏向于宿主细胞基因组的基因表达活跃区，激活沉默的原癌基因的几率可能比逆转录病毒载体低；

◆慢病毒载体未发现有致肿瘤活性，全世界有 4 千万人感染了HIV-1，发生的整合事件不计其数，但未出现一起致瘤事件，而MuLV 等逆转录病毒载体有致瘤活性；

◆慢病毒的LTR 的转录激活能力低于逆转录病毒，激活原癌基因能力也较低。

2、慢病毒制备具体步骤

制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其三种辅助包装原件载体质粒，分别进行高纯度无内毒素抽提，用转染试剂RNAi-Mate 共转染293T 细胞，转染

后6h 更换为完全培养基，培养72h 后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩，得到高滴度的慢病毒浓缩液，用于感染目的细胞。感染后的目的细胞可以通过慢病毒载体上的抗性基因和荧光融合蛋白进行筛选。

细胞培养活细胞计数用无血清培养基把细胞悬液稀释到200 ～2000 个/mL（一般稀释倍数为100 倍），在0.1 mL 的细胞悬液中加入0.1 mL 的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。

细胞株的冻存取培养2 ～3 天生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成

2×106～2×107/mL。2) 在1 mL 细胞冻存管中加入0.5 mL 细胞悬液，0.4 mL 小牛血清和0.1 mL 二甲基亚砜( 或甘油)，混匀后密封。置4°C 1h，-20°C 2h，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后浸入液氮中。

细胞复苏1) 从液氮罐中取出细胞冻存管，应带防护眼睛和手套。2) 迅速放入盛有37°C水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。3)2000 rpm，3min 离心。4) 用70% 酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出上清液，加3 mL 含10% FBS 的DMEM 培养基，吹打均匀，加入到6 cm 培养皿中，置温箱培养。5) 次日更换一次培养液后再继续培养。

细胞传代1) 弃去旧培养液，加入5 mL 灭菌PBS 溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS 溶液。2) 加入2 mL 胰酶消化液，消化1 ～2 min 直到细胞完全消化下来。3) 加入含10% 胎牛血清和100 U/mL 双抗的DMEM 培养基5mL，用刻度吸管吹打数次，将瓶壁上的细胞冲洗下来。4) 混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。

病毒包装1) 293T 细胞在10 cm 培养皿中培养至80~90% 融合时，接种15cm 培养皿；2) 倾去培养液，用1 mL D-Hank’s solution 洗涤细胞两次；3) 加入1 mL Trypsin-EDTA solution, 混匀后,37ºC 放置2~3min;4) 小心吸去胰酶溶液，加入2 mL 含10% FBS 的DMEM 培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液；5) 将细胞悬液接种15 cm 培养皿，加入18 mL 含10% FBS 的DMEM 培养液，混匀后37ºC 5% CO2培养过夜；6) 在一支无菌的5 mL 离心管中加入1.5 mL 无血清DMEM，按比例加入含客户目的序列的穿梭质粒和包装质粒（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），混匀，取另一支无菌的 5 mL 离心管，加入1.5mL 无血清DMEM，再加入300 μL RNAi-Mate，混匀，室温放置5min 后将两管混合，室

温放置20~25min；7) 除去15 cm 培养皿中的培养液，加入8 mL 无血清的DMEM 培养液；8) 将转染混合物逐滴加入15 cm 培养皿中，轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物，在37ºC 5% CO2培养箱中温育4~6h；9) 吸弃转染液，加入18 mL 含10% FBS 的DMEM 培养液。37ºC 5% CO2继续培养72h。

病毒收集1) 将培养皿中细胞上清液吸到50 mL 离心管中，4ºC，4000rpm，4 min；2) 低速离心后，将离心管上清液倒入50 mL 注射器内，用0.45μm 过滤器过滤；3) 滤液在离心机中进行超速离心，4ºC ，20000 rpm，2h；4) 将浓缩液收集分装至出货管中；5) 分装的病毒液贴上标签，-80 ºC 冰箱保存。

病毒滴度检测1) 293T 细胞在10 cm dish 中培养至80~90% 融合时，弃去培养液，用3 mL D-Hank’s solution 洗涤细胞两次；2) 加1 mL Trypsin-EDTA solution，混匀后，小心吸去胰酶溶液，37ºC 放置3~5min；3) 再加入2 mL 含10% FBS 的DMEM 培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液；4) 按3×104细胞/ 孔的浓度接种96 孔板，混匀后于37ºC 5% CO2培养24h；5) 将慢病毒原液10 μL，用10% FBS 的DMEM 培液十倍稀释3~5 个梯度（根据细胞状态，如有必要可加入终浓度为5 μg/mL 的Polybrene）；6) 吸去96 孔板中的培养液，每孔加入100 μL 稀释的病毒液，同时设立空白对照组，于37ºC 5% CO2培养24h；

7) 吸弃96 孔板中的稀释病毒液，每孔加入100 μL 10% FBS 的DMEM 培液，（根据细胞状态，如有必要可分出1/3~1/5）于37ºC 5% CO2继续培养72h；8) 通过荧光显微镜或FACS 计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度。（通过不同的检测方法，滴度会有差异，并请在试验过程中注意生物安全要求。）

细胞转染慢病毒具体方法及步骤