酶的抑制试验
酶的竞争性抑制
不可逆性抑制 (irreversible inhibition)
可逆性抑制 (reversible inhibition)
反竞争性抑制 (competitive inhibition) (non-competitive inhibition) (uncompetitive inhibition)
应用：
抗菌药物、抗代谢药物、抗肿瘤药物 等通过竞争性抑 磺胺类药物的抑菌机制
制发挥作用。例如 磺胺类抗菌药（新诺明、百炎净）。 二氢蝶呤啶 ＋ 对氨基苯甲酸 ＋ 谷氨酸
二氢叶酸 合成酶
H 2N
H2N
COOH
二氢叶酸
SO2NHR
磺胺类药物
四氢叶酸 参与核酸的合成
应用：
药物 （抑制剂） 甲氨喋呤（MTX）
酶的竞争性抑制及其应用
蒋汉明
基础医学院生物化学教研室
酶促反应的“中间产物”学说 E+S ES E+P
中间产物 （酶-底物复合物） + +
p
E，Enzyme（酶）
S，Substrate（底物）
P，Product（产物）
底物浓度（[S]）对酶促反应速度的影响
V= Vmax[S] Km+[S]
1/V
Km 1/V= 1/Vmax + 1/[S] Vmax （林－贝氏方程）
Vmax，最大反应速度。所有酶都与底物底物结合，形成 Km，米氏常数。 1/ Km可近似表示酶与底物的亲和力。 两边同取倒数 ES,并催化生成产物时的反应速度。 1/Vmax
-1/Km
1/[S]
抑制剂（Inhibitor, I）对酶促反应速度的影响
EI复合物
酶的抑制作用分析
酶的抑制作用分析酶是生物体内极其重要的生物大分子，它们在细胞代谢、物质转化、能量传递等过程中发挥着关键作用。
然而，酶的活性并非总是不受限制的，存在着多种因素可以对酶的活性产生抑制作用。
这种抑制作用对于维持细胞内的代谢平衡、调节生理过程以及应对外界环境变化都具有重要意义。
酶的抑制作用可以分为不可逆抑制和可逆抑制两大类。
不可逆抑制是指抑制剂与酶活性中心的必需基团以共价键结合，导致酶的活性丧失，且这种抑制作用无法通过简单的物理方法如透析、超滤等去除。
常见的不可逆抑制剂包括有机磷化合物、重金属离子等。
有机磷化合物能与乙酰胆碱酯酶活性中心的丝氨酸羟基结合，使其失去分解乙酰胆碱的能力，导致乙酰胆碱在体内积累，引起中毒症状。
重金属离子如汞、铅等能与酶分子中的巯基结合，从而使酶失活。
可逆抑制则相对较为温和，抑制剂与酶非共价结合，通过物理方法可以将抑制剂除去，使酶的活性得以恢复。
可逆抑制又可进一步分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种类型。
竞争性抑制是指抑制剂和底物竞争酶的活性中心。
当抑制剂与酶结合后，底物就无法再与酶结合，从而降低了反应速度。
这种抑制作用的特点是，增加底物浓度可以减弱抑制剂的抑制作用。
例如，丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制就属于竞争性抑制。
丙二酸与琥珀酸结构相似，都能与琥珀酸脱氢酶结合，但丙二酸不能被酶催化反应。
当增加琥珀酸的浓度时，它与酶结合的机会增加，就能在一定程度上克服丙二酸的抑制作用。
非竞争性抑制中，抑制剂结合在酶活性中心以外的部位，形成的酶抑制剂复合物（EI）不能进一步释放出产物。
抑制剂的存在不会影响底物与酶的结合，但会降低酶的催化活性。
磺胺类药物就是通过非竞争性抑制细菌体内的二氢叶酸合成酶来发挥抗菌作用的。
反竞争性抑制则是抑制剂仅与酶底物复合物（ES）结合，降低形成产物的量。
这种抑制作用在实际中相对较少见。
酶的抑制作用在医学、农业和工业等领域都有着广泛的应用。
在医学领域，许多药物就是通过抑制特定酶的活性来发挥治疗作用的。
实验三抑制剂和激动剂对酶活性的影响
六、思考题：(Questions)
什么叫酶的竞争性抑制作用？举例说明在医 学上的应用。
七.注意事项：(Notices)
1．注意密切观察颜色变化。 2．加入各种试剂要注意看清标签，不能 混用滴管
• 反应模式
竞争性抑制作用
+
I
EI [S]>>[I]：高浓度的底物可解除抑制
竞争性抑制作用特点 1、I结构常与S结构类似 2、I/S与酶的结合部位相同:酶的活性中心 3、[S]↑可以降低甚至消除抑制作用 4、(表观）Km值增大，Vm值不变
1/V
抑制剂↑
1/[S]
• 丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶
二、实验原理(Experimental Principles)：
影响酶活性的因素：
温度 pH值 激活剂 抑制剂
对酶活性的抑制作用分类
不可逆性抑制作用
竞争性抑制作用 可逆性抑制作用 非竞争行抑制作用 反竞争性抑制作用
抑制剂(I)与底物(S)的结构相似，能与底 物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复 合物的形成，使酶的活性降低。这种抑制 作用称为竞争性抑制作用。 E+S ES E+P
四、操作步骤（Operating Procedure）
1 酶的提取液的制备：将兔子处死，取出肝 脏，切成碎片后，放入乳钵中，每组取8g 左右，加入1/15mol/L的Na2 HPO4溶液 5ml研成糊状后，再加入10 ml1/15mol/L 的Na2 HPO4溶液，混匀后，倒入离心管中， 2000转/分钟离心4分钟，取上清液转入其 它试管备用。
COOH CH2 CH2
琥珀酸脱氢酶
琥珀酸
FAD
COOH CH2 COOH
丙二酸
酶的抑制作用分析
酶的抑制作用分析酶是生物体内的一种高效催化剂，能够显著加速化学反应的进行。
然而，酶的活性并非总是处于不受约束的状态，其可能会受到多种因素的抑制。
酶的抑制作用在生物化学、药理学、毒理学等领域都具有重要意义。
酶的抑制作用可以分为不可逆抑制和可逆抑制两大类。
不可逆抑制是指抑制剂与酶活性中心的必需基团以共价键结合，导致酶的活性永久性丧失。
这种抑制作用非常强烈，一旦发生，通常难以通过简单的方法恢复酶的活性。
例如，有机磷农药就是一种常见的不可逆抑制剂，它们能够与乙酰胆碱酯酶活性中心的丝氨酸羟基结合，使乙酰胆碱酯酶失去分解乙酰胆碱的能力，导致乙酰胆碱在体内积累，引起中毒症状。
可逆抑制则相对较为温和，抑制剂与酶的结合是通过非共价键，如氢键、离子键、范德华力等，并且这种结合是可逆的。
可逆抑制又可以进一步分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种类型。
竞争性抑制是指抑制剂和底物竞争酶的活性中心。
当抑制剂与酶结合后，底物就无法再与酶结合，从而抑制了酶的催化作用。
但如果增加底物的浓度，底物与抑制剂竞争酶活性中心的机会增加，就可以减弱甚至解除抑制剂的抑制作用。
例如，磺胺类药物就是通过竞争性抑制细菌体内的二氢叶酸合成酶，从而发挥抗菌作用。
非竞争性抑制中，抑制剂结合的部位并非酶的活性中心，而是在活性中心之外的某个部位。
抑制剂的结合会导致酶的构象发生改变，从而降低酶的催化活性。
即使增加底物的浓度，也无法解除这种抑制作用。
反竞争性抑制则是抑制剂仅与酶底物复合物结合，从而降低了反应的中间产物量，进而抑制了酶的活性。
酶的抑制作用在许多方面都具有重要的应用价值。
在医学领域，通过研究酶的抑制作用，可以开发出各种有效的药物。
例如，降脂药他汀类药物能够抑制胆固醇合成过程中的关键酶，从而降低血液中的胆固醇水平，预防心血管疾病的发生。
在农业生产中，利用酶的抑制作用可以开发出高效的农药。
例如，针对昆虫体内某些关键酶的抑制剂，可以在不影响环境和其他生物的情况下，有效地控制害虫的数量。
实验2 琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制的观察
实验2 琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制的观察（一）原理琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的一个重要的酶，测定细胞中有无这种酶可以初步鉴定三羧酸循环途径是否存在。
琥珀酸脱氢酶可使其底物脱氢，产生的氢可通过一系列传递体最后递给氧而生成水。
在缺氧的情况下，若有适当的受氢体也可显示出脱氢酶的作用。
如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白。
这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。
琥珀酸+ 甲烯蓝琥珀酸脱氢酶延胡索酸+ 甲烯白无氧条件丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合。
若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为竞争性抑制。
如相对地增加琥珀酸的浓度，则可减轻丙二酸的抑制作用。
（二）试剂1．1.5%琥珀酸钠溶液：称取琥珀酸钠1.5g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml。
如无琥珀酸钠可用琥珀酸配成水溶液后，以氢氧化钠溶液中和至pH7~8。
2．1%丙二酸钠溶液：称取丙二酸钠1g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml。
3．0.02%甲烯蓝溶液。
4．1/15mol/LNa2HPO4溶液：取Na2HPO4 · 2H2O 11.8g，用蒸馏水溶解并稀释至1 000ml。
5．液体石蜡。
（三）操作1．猪心脏制备液：称取新鲜猪心1.5~2.0g放组织捣碎机中，加入等体积的石英砂及1/15mol/LNa2HPO4溶液3~4ml，捣碎成浆，再加入6~7ml1/15mol/LNa2HPO4溶液，放置1小时，不时摇动，离心取上清液备用。
2．取4支试管，编号并按下表操作：试管心脏制备液 1.5%琥珀酸钠溶液1%丙二酸钠溶液蒸馏水0.02%甲烯蓝溶液（滴）（滴）（滴）（滴）（滴）1 5 5 －10 22 5 5 －10 2（先煮沸）3 5 5 5 5 24 5 10 5 5 23．各管溶液混匀后，每管各加液体石蜡一薄层（约5~10滴）。
酶的抑制作用分析
酶的抑制作用分析酶作为生物体内的催化剂，对于维持生命活动的正常进行起着至关重要的作用。
然而，在某些情况下，酶的活性会受到抑制，这种抑制作用可以是可逆的，也可以是不可逆的。
深入理解酶的抑制作用对于生物学、医学、化学等领域都具有重要意义。
酶的抑制作用可以分为不可逆抑制和可逆抑制两大类。
不可逆抑制是指抑制剂与酶的活性中心或活性部位发生共价结合，导致酶永久性地失去活性。
这种抑制作用通常是强烈而持久的，一旦发生，很难通过简单的方法恢复酶的活性。
例如，有机磷农药就是一种常见的不可逆抑制剂。
它们能够与乙酰胆碱酯酶的活性中心结合，使该酶失去分解乙酰胆碱的能力。
乙酰胆碱在体内积累，会导致神经系统功能紊乱，引起中毒症状。
相比之下，可逆抑制则相对温和，并且在一定条件下可以解除抑制，恢复酶的活性。
可逆抑制又可细分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种类型。
竞争性抑制是指抑制剂与底物竞争酶的活性中心。
由于抑制剂和底物在结构上相似，它们都能与酶结合，但抑制剂与酶结合后，酶就无法再与底物结合，从而降低了酶促反应的速率。
举个例子，磺胺类药物就是通过竞争性抑制叶酸合成途径中的关键酶，从而发挥抗菌作用。
叶酸对于细菌的生长和繁殖至关重要，磺胺类药物的竞争抑制能够有效地抑制细菌的代谢过程。
非竞争性抑制则有所不同，抑制剂结合的部位不是酶的活性中心，而是酶的另一个部位。
抑制剂的结合导致酶的构象发生改变，从而降低了酶对底物的催化能力。
例如，某些重金属离子如汞离子、铅离子等，可以与酶分子中的巯基结合，改变酶的构象，引起非竞争性抑制。
反竞争性抑制则是抑制剂仅与酶底物复合物结合，降低了形成产物的量，从而抑制了反应的进行。
酶的抑制作用在生物体内具有重要的调节意义。
例如，在代谢途径中，通过对关键酶的抑制，可以有效地控制代谢的速度和方向，使生物体内的物质和能量代谢保持平衡。
在医学领域，酶的抑制作用也为药物研发提供了重要的思路。
许多药物就是通过抑制特定的酶来发挥治疗作用的。
酶抑制法两种底物优越性比较试验
ｆ ｓ ｌ ｅ Ｂ ｓ ｌ ａ ｅ ｕ ｕ ｌｙ ｕ ｅ ｓｓ ｂ ｔ ａ ｃ ｎ ｅ ｚ ｍｅｉ ｈ ｂｔｏ ．Ｔｈ ｏ ｇ ｏ ｐ ｒｎ ｈ ｄ ａ ｔ ｇ ｓ ｏ ｗｏ ｓ ｂ ａ ｔ ｂ ｕ ａｔ ｒ ｓ ａ ｌ ｓ ｄ ａ ｕ ｓ ｒ ｔ ｓｉ ｎ ｙ ｎ ｉ ｉ ｎ ｉ ｒ ｕ ｈ ｃ ｍ ａ ｉｇｔ ｅａ ｖ ｎ ａ ｅ ｆ ｔ ｕ
维普资讯
广西农业科学
２０ ０ ７年 第 ３ ８卷 第制 法 两 种 底 物 优 越 性 比较 试 验
刘 文君 龙 明 华ｈ ， 龙 紫媛 唐 小 付 ， 。 ，
（ ． 西 大 学 农 学 院 ， 南 宁 ５ ０ ０ ； ２ 广 西 大 学 园 艺研 究 所 ， 南 宁 ５ ０ ０ ） １广 ３０ ５ ． ３０ ５
６ ｄｃ ｌ ｒ ｂ ｎ ｅ ｎ ｎ ～ｎ ｏ ｈ ｎ ａ ｅ ａ ｅ ｍａｎ ｙ ｉ ｃ ｕ ｅ ｉｓ ｂ ｔ ｅ ｔ ｂ ｌ ｙ ｏ ｒ ｄ ｃ ｓ ｉｈ ｏ ｏ—ｅ ｚ ｎ ｏ ｅ ｉ ｄ ｐ ｅ ｙ ｌｃ ｔ ｔ ｉ ｌ ｎ ｌ ｄ ｔ ｅ ｔ ｒ ｓ ａ ｉ ｔ ｆ ｐ ｏ ｕ ｔ ．ａ ｄ ｍｏ ｅ ｏ ｔｏ ａ ａ ｄ ｉ ｎ ｒ ｐ ｉ ｎ ｌ ｎ
ＩＩ Ｗ ｅ —ｕ ． Ｕ ｎ ｊ ｎ ，ＩＯＮＧ ｉｇ ｈ ａ ・，ＬＯＮＧ ｉｙ ａ Ｍ ｎ — ｕ Ｚ — ｕ ｎ ，ＴＡＮＧ ａ —ｕ Ｘｉｏ ｆ
（１ Ａｇｒｃ ｌｕｌ ｌｅ ． ｉ ｕ ｔ Ｃｏｌ ｇｅ，Ｇｕａ ｅ ｎｇｘｉＵｎｉ ｒ ｉｙ，Ｎ ａ ｉ ｇ ０ ｖｅ ｓｔ ｎｎ ｎ ５３ ００５・Ｃｈ ｎａ；２． ｏ ｔｃ ｔ ｒ ｓ ａｒ ｈ Ｉ ｔｔ ｔ ｉ Ｈ ｒｉ ｕｌｕ ｅ Ｒｅｅ ｃ ｎｓｉｕ ｅ・ Ｇｕａ ｎｇｘｉＵ ｎ ｖｅ ｓｔ Ｎ ａｎ ｎｇ ３０ ０５， ｉ ｒ ｉｙ． ｎｉ ５ ０ Ｃｈｉ ａ） ｎ
胰蛋白酶抑制因子的活性测定方法
Tro缓 冲溶液 ,在 涡旋搅
拌器 上 搅拌 3min,然 后加入 10.00ml Tro缓 冲溶液 t室 涅 下静止 10min,待 大部 分固体絮状 物质凝集下来后用滤纸过滤 (豆 粕样 品提取液再用 Tr。 缓冲溶液稀释 0o或 zO倍 )c
4反 应
4,1样 品空 白和试剂 空 白:分 别将 2.00ml样 品稀释液和 2.∞ ml蒸 镭水加 入 1omI试 管 中 。
备注 :由 于分析操作存在难 以避免 的随机误差 ,造 成 同一 样 品在不 同时间 (人 )检 测 时产 生 偏差 ,为 避免分析过程 中的随机实验误 差 ,我 们提示您用 同一 豆粕 样 品做参 比对照 。
■
胰蛋 白酶抑制因子活性测定方法
1原 理
胰蛋 白酶抑制剂 能够 和骧蛋 白酶结合 ,通 过 测定底物
(BAPA)被 未结合 的胰 蛋 白酶酶
解生成 的 产物一对硝基苯孩溶液 妁吸光 度 ,然 后 以它和未加抑制剂 的标准吸光度之差来表示 被抑制 的胰蛋 白酶活性
c
2材 料
2.1Tro缓 冲溶液 :溶 解 6.050g羟 甲基 氨墓 甲烷 itHs)和
试管 内 ,加 入
5。
2,∞ mI稀 释液于 10ml
00ml BAPA溶 液后在 37℃ 下保温 ⒛ min,加 入 2.∞ ml猪 咦蛋 白酶溶液 ,然 后
在水浴 中保温 10min,再 加
1m13o%醋 酸溶液 中止反应 。
5测 量
在
3gsnm(或 410nm)下 用试剂空 自校零和测定标准 、样 品和样 品空 白的吸光值 ,计
在 夕 ℃下保温 ⒛ min,各 加入 5,00ml BAPA溶 液 ,混 合 后在 37℃ 下 倮温 10min,分 别加入
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（六）酶的抑制实验
一、实验目的
理解两大类抑制反应的基本原理和主要特点，并掌握可逆抑制反应确定的原
理和方法。
二、实验原理
根据抑制剂与酶结合的特点可分为不可逆抑制和可逆抑制二种类型，其中可
逆抑制有可分为三种类型：竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。
（1）竞争性抑制类型：
酶不能同时与底物和抑制剂结合。动力学特征为：表观米氏常数Km'增加，
Vmax'不变。（Ki为抑制剂常数，[I]为抑制剂浓度）。
][)][1(][SKIKSVvimm
)][1('immKIKK
（2）非竞争性抑制类型：
抑制剂、底物能同时与酶结合，但此复合物不能进一步分解为产物，Km ’不
变，Vmax’下降。
])[)(][1(][SKKISVvmim imKIVV][1'
（3）反竞争性抑制类型：
抑制剂必须在酶和底物结合后方能与酶形成复合物，但此物不能分解为产物。
Km'、Vmax' 都发生变化。
])[][1(][SKIKSVvimm
i
m
K
IVV][
1'
)][1('immKIKK
对于有抑制剂存在的酶促反应，也可采用1/v～1/[S]作图法，求出Km'、Ki、
Vmax'，并利用各种可逆抑制类型的动力学特点判断抑制类型。
三、实验材料
1、试剂：
（1）0.05mol/L柠檬酸缓冲液；
（2）酸性磷酸酯酶原酶液：原酶液用0.05mol/l柠檬酸缓冲液稀释25倍左右，
使测定的第五管A405，在0.6-0.7之间；
（3）1.2 mmol/L NPP；
（4）0.3 mol/L NaOH；
（5）10mmol/LKH2PO4
（6）3mmol/LNaF
2、仪器与玻璃器皿：
（1）恒温水浴槽；
（2）可见光分光光度计；
（3）试管、刻度吸管。
四、方法步骤
按表中由上至下操作：
取20支试管按下表编号，1-5号为各不相同底物浓度的样品空白管。各空白
管在加入NPP和缓冲液后，先加NaOH，后加酶液。其余各按下表操作。以1-5
管中相应的底物浓度做空白，在可见光分光光度计上测A405。
表二
管
号
试剂
（mL）
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
KH2PO4 NaF
1.2 mmol/L NPP 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
10mmol/L KH2PO4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 - - - - -
3m mol/L NaF - - - - - 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
0.05mol/L柠檬酸缓冲液 1.5 1.3 1.1 0.9 0.7 1.5 1.3 1.1 0.9 0.7
稀释酶液
35℃保温2min
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
35℃精确反应15min
0.3 mol/L NaOH 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
A405
总结：KH2PO4为竞争性抑制剂Km’增大Vmax’不变，则 Km’
=1.0,Km=0.286 Vmax’=Vmax=4*10-4,Ki=0.4。
NaF为反竞争性抑制剂， Km’增大， Vmax’增大，则 Km’=0.714，
Km=0.286 Vmax’=10-3 ,Vmax=4*10-4, Ki=-0.5.说明 NaF对反应有
促进作用，或者由于绘制曲线造成的误差，使抑制剂的效果不明显甚
至变成激活剂。但从酶活力测定A405来看，NaF反应测得的 A405的
确比无 NaF时的 A405值大，可能绘制回归曲线时，应该画非竞争性
抑制类型。但是
NaF的1/V值都在无抑制剂的下方，说明不可能为非竞争性抑制类型。
总之， NaF的类型存在争议，应多次测定并且用SPSS软件精确分析
其回归方程后，才能确定其类型。
图9 酶的抑制
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
051015
1/[s]
1
/
v
*
1
0
4
系列1
系列2
系列3