食品中赭曲霉毒素的检测-HPLC法
赭曲霉毒素A标准检测规程
赭曲霉毒素A标准操作规程1、目的为了规范亲和柱净化样本中赭曲霉毒素A的操作流程，特制订本操作规程。
2、范围本标准适用于粮食、饲料、食品中赭曲霉毒素A的检测。
3、检出限和定量限项目岛津安捷伦样本检出限（µg/kg）样本定量限（µg/kg）样本检出限（µg/kg）样本定量限（µg/kg）OTA 0.28 0.84 3.6 11.9 4、职责部门名称部门职责质量管理部1、负责本制度的实施。
2、负责本制度的监督执行。
5、程序5.1 原理测定的基础是抗原、抗体反应，抗体连接在柱体内，样品经过提取、过滤后，缓慢的通过赭曲霉毒素A免疫亲和柱，在免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。
用2%乙酸甲醇洗脱赭曲霉毒素A，然后注入到高效液相色谱仪中用于检测。
5.2 溶液配制5.2.1 提取液Ⅰ（用于粮食类样品及酱油、醋类样品的提取）：80%甲醇-水溶液（V甲醇: V水=80 : 20）：取800mL甲醇，加入去离子水定容至1L。
5.2.2 提取液Ⅱ（用于酒类样品的提取）：称取150g氯化钠、20g碳酸氢钠溶于约950mL水中，加水定容至1L。
5.2.3 清洗缓冲液（用于酱油、醋类样品净化步骤的洗涤）：称取12.5g 氯化钠、2.5g 碳酸氢钠溶于水中，加0.1mL吐温-20，用水定容至1L。
5.2.4 冲洗液（用于酒类样品净化步骤的洗涤）：称取25g 氯化钠、5g碳酸氢钠于约950mL水中，加水定容至1L。
5.2.5 洗脱液（甲醇: 乙酸=49 : 1）：取1ml乙酸加入到49ml甲醇中混匀即可。
5.2.6 赭曲霉毒素A标准工作液：用色谱级甲醇将储备工作液分别稀释到20 ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2 ng/ml、1 ng/ml。
5.3 样品前处理5.3.1 粮食类----20g±0.01g样品（固体样品需粉碎，并过2mm分样筛），5g氯化钠于三角瓶中，加入100mL的提取液Ⅰ（见5.2.1）；----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用快速定性滤纸过滤，收集滤液；----取10mL滤液加入40mL去离子水稀释，混匀；----用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；----取25mL上样液过免疫亲和柱净化。
粮食中赭曲霉素A检验方法的研究进展
Apr. 2024 CHINA FOOD SAFETY169食品科技粮食中赭曲霉素A 检验方法的研究进展姜 雪（松原市粮油质量检验监测站，吉林松原 138000）摘 要：赭曲霉素A （Ochratoxin A ，OTA ）是青霉菌属与曲霉菌属共同产生的具有7种结构的二级代谢产物，在小麦、玉米、大米及大麦等粮食中广泛存在。
赭曲霉素A 可致畸，具有肾毒性、神经毒性、免疫毒性等危害，可引起动物肾脏、肝脏损伤、坏死以及肠黏膜损坏。
本文综述了粮食中赭曲霉素A 的主要检验方法，重点分析与讨论了不同检验方法优缺点，以期为更加准确、高效、便捷的检测粮食中赭曲霉素A 提供依据。
关键词：赭曲霉素A ；理化性质；检验方法Research Progress on the Detection Method ofOchratoxin A in GrainJIANG Xue(Songyuan City Grain and Oil Quality Inspection and Monitoring Station, Songyuan 138000, China)Abstract: Ochratoxin A is a secondary metabolite with seven structures produced by Penicillium and Aspergillus. It is widely found in wheat, corn, rice and barley. Ochratoxin A can cause teratogenicity, nephrotoxicity, neurotoxicity, immunotoxicity and other hazards, which can cause kidney, liver damage, necrosis and intestinal mucosal damage in animals. In this paper, the main detection methods of ochratoxin A in grain were reviewed, and the advantages and disadvantages of different detection methods were analyzed and discussed in order to provide a basis for more accurate, efficient and convenient detection of ochratoxin A in grain.Keywords: ochratoxin A; physicochemical properties; testing method1 赫曲霉毒素A 理化性质赫曲霉毒素（Ochratoxin A ，OTA ）是青霉菌属与曲霉菌属共同产生的具有7种结构的二级代谢产物，7种曲霉和6种青霉菌均能产生赭曲霉毒素。
检测葡萄酒中赭曲霉毒素A的SPE-HPLC方法优化
检测葡萄酒中赭曲霉毒素A的SPE-HPLC方法优化宗楠;李景明;张柏林【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2011(000)004【摘要】从固相萃取的上样体积、淋洗液体积以及高效液相色谱的洗脱程序等方面,优化并建立了检测葡萄酒中赭曲霉毒素A的(SPEHPLC)方法.采用10mL酒样与10mL水等体积混合上样,使用2mL水淋洗后再用2mL甲醇/水(60∶40,v/v)溶液的最佳淋洗条件,HPLC 检测首次采用梯度洗脱,优化后方法的加标回收率为94.6%～99.5%,相对标准偏差为0.36%～3.01%.6个市售葡萄酒样品检测表明,OTA阳性率为66.7%,平均含量为0.46μg/L,证明本方法能够排除杂质峰干扰,提高准确度,可以满足葡萄酒中赭曲霉毒素(OTA)的定量检测要求.【总页数】4页(P32-35)【作者】宗楠;李景明;张柏林【作者单位】北京林业大学,生物科学与技术学院,北京,100083;中国农业大学,食品科学与营养工程学院,北京,100083;北京林业大学,生物科学与技术学院,北京,100083【正文语种】中文【中图分类】O657.7【相关文献】1.葡萄酒中赭曲霉毒素A检测方法优化 [J], 庞世琦;刘青;李志勇;潘丙珍;罗敏;刘茜;陈文锐2.对SPE-HPLC检测葡萄酒中赭曲霉毒素A方法中SPE法的优化 [J], 牛玉雪;王秀芹;于静;马丽艳;战吉宬3.葡萄与葡萄酒中赭曲霉毒素A检测方法研究进展 [J], 谢春梅;王华4.酿酒原料及白酒中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的测定方法优化 [J], 任璐;燕玲娟;罗冠龙;桑涛;刘丽丽5.固相萃取-高效液相色谱检测葡萄酒中赭曲霉毒素A [J], 马莉;康维钧;陈庆;李珊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
食品中真菌毒素的分析方法研究
食品中真菌毒素的分析方法研究近年来，食品安全问题引起了广泛关注。
在食品中，真菌毒素是一类常见的致病因素。
真菌毒素是由霉菌分泌的一类具有毒性的化合物，可以在谷物、大豆、坚果等食品中产生。
为了确保食品安全，科学家们一直在研究和开发新的分析方法来检测和监控食品中的真菌毒素。
一种常用的分析方法是高效液相色谱法（HPLC）。
这种方法通过将食品样品与溶剂混合，然后将混合物通过高效液相色谱柱进行分离和检测。
HPLC可以快速准确地检测多种真菌毒素，如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯醇等。
通过这种方法，可以对食品中的真菌毒素进行定量分析，从而确保食品的质量和安全性。
除了HPLC，还有其他一些新的分析方法也得到了广泛应用。
例如，质谱法（MS）结合气相色谱法（GC）可以对真菌毒素进行更加准确的定性和定量分析。
这种方法通过将样品分解成各个组分，并通过质谱仪进行检测和分析，可以得到更加详细和准确的毒素结构信息。
另外，近年来免疫学方法也得到了飞速发展，如嵌入式免疫电极和免疫传感器等。
这些方法基于对特定抗体与真菌毒素结合的原理，可以在食品样品中高度敏感地检测出真菌毒素的存在。
在食品分析领域，快速、高效的检测方法至关重要。
因此，一些快速检测技术也被广泛应用于真菌毒素的分析中。
例如，快速液相色谱法（RPLC）结合紫外光检测器可以在短时间内完成大样品数量的分析。
这种方法具有高灵敏度和稳定性，可以有效地减少分析时间和成本。
此外，近年来还出现了一些基于光学检测的方法，如表面增强拉曼光谱法（SERS）和纳米光粒子法等。
这些方法通过利用光学原理来检测真菌毒素，具有快速、灵敏和准确的优点。
当然，食品中真菌毒素的分析方法研究还远未止步于此。
随着科学技术的不断进步，我们可以预期未来将会涌现出更多更先进的分析方法。
例如，基于人工智能和机器学习的分析方法正在逐渐兴起，这将使得真菌毒素的检测更加准确和高效。
此外，近年来还有研究表明，纳米技术可以用于食品中真菌毒素的去除和修复。
咖啡中3种赭曲霉毒素QuEChERS-UPLC-MS
基金项目:国家市场监管重点实验室(热带果蔬质量与安全)自主研究课题(编号:Z Z Ｇ２０２２００１)作者简介:高云慨,男,海南省食品检验检测中心中级工程师,硕士.通信作者:尹青春(１９８６ ),女,海南省食品检验检测中心高级工程师,硕士.E Ｇm a i l :y i n q i n gc h u n ＠１６３．c o m 收稿日期:２０２３Ｇ０２Ｇ０９㊀㊀改回日期:２０２３Ｇ０８Ｇ２９D O I :１０．１３６５２/j ．s p j x ．１００３．５７８８．２０２３．８００８４[文章编号]１００３Ｇ５７８８(２０２３)１１Ｇ００９１Ｇ０７咖啡中３种赭曲霉毒素Q u E C h E R S ＧU P L C ＧM S /M S 检测方法E s t a b l i s h m e n t o fQ u E C h E R S ＧU P L C ＧM S /M Sm e t h o d t od e t e r m i n e t h r e ek i n d s o f o c h r a t o x i n s i n c o f f e e高云慨G A OY u n k a i ㊀陈小妹C H E N X i a o m e i ㊀陈春泉C H E N C h u n q i a n 周凌聿Z H O UL i n g y u ㊀邓英林DE N GY i n g l i n ㊀尹青春Y I N Q i n gc h u n (海南省食品检验检测中心国家市场监管重点实验室 热带果蔬质量与安全 ,海南海口㊀５７０１００)(H a i n a nI n s t i t u t e f o rF o o dC o n t r o l ,K e y L a b o r a t o r y o f T r o p i c a lF r u i t s a n dV e g e t a b l e sQ u a l i t yS a f e t y f o rS t a t eM a r k e tR e gu l a t i o n ,H a i k o u ,H a i n a n ５７０１００,C h i n a )摘要:目的:建立同时测定咖啡中３种赭曲霉毒素的Q u E C h E R S Ｇ超高效液相色谱 串联质谱检测方法.方法:样品经乙腈 水 甲酸(V 乙腈ʒV 水ʒV 甲酸为５５ʒ４０ʒ５)超声提取,利用Q u E C h E R S 盐包进行脱水盐析,过Z a n C h E R S ＧM y c o １７净化小柱净化.样品采用０．２％甲酸水 乙腈作为流动相经W a t e r sB E H C １８(１．７μm ,２．１mmˑ１００mm )色谱柱梯度洗脱分离.电喷雾正离子模式,多反应监测扫描,内标法定量.结果:３种目标物在０．１~２０．０n g /m L 的质量浓度范围内线性关系良好,相关系数ȡ０．９９９４６,方法检出限和定量限分别为０．１~０．２,０．２~０．７μg /k g.咖啡基质中３个添加水平目标物平均回收率为７９．０％~１０３．３％,相对标准偏差为１．５％~７．６％.结论:该方法前处理简单,重现性好,分析时间短,能够适用于不同咖啡基质样品中３种赭曲霉毒素残留的高通量检测.关键词:咖啡;赭曲霉毒素;Q u E C h E R S ;超高效液相色谱 串联质谱法A b s t r a c t :O b je c t i v e :A n e w m e t h o d w a s d e v e l o p e df o r t h e s i m u l t a n e o u s d e t e r m i n a t i o n o f t h r e e k i n d s o f o c h r a t o x i n s i n c o f f e e b y u l t r a Ｇh igh p e r f o r m a n c eli q u i dc h r o m a t o g r a p h yＧt a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y (U P L C ＧM S /M S )c o m b i n e d w i t h Q u E C h E R S p r e t r e a t m e n t ．M e t h o d s :S a m p l e s w e r ee x t r a c t e d b y a c e t o n i t r i Ｇw a t e r Ｇf o r m i c a c i ds o l u t i o n (５５ʒ４０ʒ５)w i t hu l t r a s o n i c ,s a l t e do u tw i t ha Q u E C h E R Ss a l t p o c k e t ,a n dt h e n p u r i f i e d w i t h a (Z a n C h E R S ＧM y c o １７)c o l u m n ．T h ec h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o n w a s p e r f o r m e d o n a n A C Q U I T Y U P L C B E H C １８(１．７μm ,２．１mmˑ１００mm )c o l u m nb yg r a d i e n te l u t i o nu s i n g a m o b i l e p h a s e c o m p r i s i n g ０．２％f o r m i c a c i d a qu e o u s s o l u t i o n a n d a c e t o n i t r i l e ．I n t h e p o s i t i v ei o n m o d e o f e l e c t r i c s p r a y ,t h e s a m p l e sd e t e c t e d w e r e u s e d b y m u l t i p l e r e a c t i o n m o n i t o r i n g(M RM )m o d e s w i t hi n t e r n a ls t a n d a r d m e t h o d ．R e s u l t s :T h r e e t a r g e t s u b s t a n c e sh a da g o o dl i n e a rr e l a t i o n s h i p i nt h er a n g eo f ０．１~２０．０n g /m L ,a n dt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t w a s g r e a t e r t h a n０．９９９４６．T h ed e t e c t i o nl i m i ta n d q u a n t i t a t i v el i m i t w e r e ０．１~０．２μg /k g a n d０．２~０．７μg /k g ,r e s p e c t i v e l y ．A v e r a ge r e c o v e r i e s a t t h r e e s p i k e d l e v e l si n t h e c of f e e m a t r i x w e r e ７９．０％~１０３．３％w i t har e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o no f１．５％~７．６％．C o n c l u s i o n :T h i s m e t h o d h a st h ea d v a n t ag e so fs i m p l e s a m p l e p r e t r e a t m e n t ,g o o dr e p r o d u c i b i l i t y a n dhi g he f f i c i e n c y,a n di ss u i t a b l ef o rt h e h i g h Ｇt h r o u g h p u t d e t e c t i o n o f m u l t i p l e o c h r a t o x i n s i nd i f f e r e n t c o f f e e s a m pl e s ．K e yw o r d s :c o f f e e ;o c h r a t o x i n s ;Q u E C h E R S ;U P L C ＧM S /M S 据统计[１],中国饮用咖啡的消费者已达３．３亿人,近年来咖啡消费市场规模保持２０％的年化速度飞速增长.中国咖啡种植主要分布在温润潮湿的云南㊁四川及海南地区.研究[２]表明,咖啡及其产品在采收㊁加工㊁贮藏过程中易受到霉菌的侵染,产生各种真菌毒素.B e s s a i r e等[３]采集了９个国家咖啡样本,多数样本中含有多种霉１９F O O D &MA C H I N E R Y 第３９卷第１１期总第２６５期|２０２３年１１月|菌毒素,其中赭曲霉毒素A含量最高.饮用咖啡是机体摄入该毒素的主要途径,因在生产及食用环节难以完全避免其毒性,已成为危害健康的主要关键风险因素[４－５].赭曲霉毒素(o c h r a t o x i n,O T)是由真菌产生的具有结构类似的次生代谢产物,常见的有赭曲霉毒素A(O T A)㊁赭曲霉毒素B(O T B)和赭曲霉毒素C(O T C)等[６－７].其主要通过侵害动物肝脏与肾脏,具有致癌㊁致畸等毒副作用,已被国际癌症研究机构(I A R C)列入２B类致癌目录,危害性仅次于黄曲霉毒素[８].研究[９]表明,O T A和O T C 在特定条件下可以相互转化,具有协同毒副效应.同时,代谢的多种真菌毒素的协同作用对人体健康的影响更具危害性[１０－１１].叶林链等[１２]从肉豆蔻中分离了一株赭曲霉毒素产毒菌,同时检出了O T A㊁O T B两种真菌毒素,说明在植物源样本中存在不同结构的赭曲霉毒素.G B２７６１ ２０１７对咖啡中赭曲霉毒素A限值有明确要求,但其他赭曲霉毒素类型尚未见相关规定[１３].近年来,高效液相色谱 串联质谱技术因其强大的分离能力和较好的灵敏度㊁准确性,逐步被应用于部分真菌毒素的定性和定量分析[１４－１８].免疫亲和柱法对真菌毒素具有高特异性,是目前国家标准检测咖啡赭曲霉毒素A采用的前处理方法,但由于采用抗原抗体结合的净化方式,其前处理过程复杂㊁使用成本高,检测的真菌毒素种类有限.相比免疫亲和柱,Q u E C h E R S前处理技术采用提取与净化结合方式,具有操作简单㊁快速㊁价格便宜且选择性好等优点,可应用于多种真菌毒素的高通量检测[１９－２３].目前国内有关咖啡及制品中真菌毒素检测的研究较少[２４],尚未见针对咖啡中同时检测O T A㊁O T B㊁O T C ３种类型赭曲霉毒素方法研究及评价的报道.研究拟将高效液相色谱 串联质谱技术与Q u E C h E R S技术结合,采用内标法定量,旨在建立能快速筛查和准确定量咖啡中３种赭曲霉毒素检测方法,以期为全面监测㊁评估咖啡中赭曲霉毒素的污染风险提供依据.１㊀材料与方法１．１㊀材料与仪器１．１．１㊀材料与试剂O T A㊁O T C:天津阿尔塔科技有限公司;O T B:德国D r．E h r e n s t o r f e r公司;１３C２０ＧO T A:北京曼哈格生物科技有限公司;Q u E C h E R S提取盐包:４g硫酸镁㊁１．０g氯化钠,美国A g i l e n t公司;净化柱:S H I MA D Z U W o n d a P a k Q u E C h E R S净化管,日本S H I MA D Z U公司;W a t e r s O a s i s P R i m e H L B:２００m g,６m L,美国W a t e r s公司;Z a n C h E R SＧM y c o１７净化小柱:北京科德诺思技术有限公司;色谱柱:A C Q U I T Y U P L C B E H C１８(２．１mmˑ１００mm,１．７μm),美国W a t e r s公司;乙腈㊁甲酸㊁甲醇:德国M E R C K公司;咖啡生豆㊁烘焙咖啡豆㊁速溶咖啡粉:市售.１．１．２㊀仪器与设备质谱仪:A B S c i e x T r i p l e Q u a d T M４５００型,美国S C T E X公司;电子天平:X S２０４S型,瑞士梅特勒 托利多公司;冷冻离心机:５８０４R型,德国E p p e n d o r f公司;超声波器:S K７２００型,上海科导超声仪器有限公司.１．２㊀方法１．２．１㊀仪器条件(１)质谱条件:离子源(E S I);正离子模式;多反应监测(M R M)扫描;喷雾电压４５００V;离子源温度５５０ħ;雾化气为氮气;加热气为氮气;碰撞室入口电压１０V.(２)色谱条件:A C Q U I T Y U P L C B E H C１８色谱柱(２．１mmˑ１００mm,１．７μm);柱温４０ħ;进样体积５．０μL;流动相A为０．１％甲酸水溶液;流动相B为乙腈;流速０．３m L/m i n;洗脱程序:０~２．０m i n,１０％B;２．０~３．０m i n,１０％~９０％B;３．０~３．２m i n,９０％~１０％B;３．２~５．０m i n,１０％B.１．２．２㊀标准溶液配制(１)混合标准溶液(１．０μg/m L):准确吸取１００μg/m L的３种赭曲霉毒素混标１００μL,用乙腈定容至１０m L,并于－１８ħ贮藏备用.(２)１３C２０ＧO T A内标使用溶液(１０．０μg/m L):准确吸取１００μg/m L１３C２０ＧO T A溶液１．０m L,用乙腈定容至１０m L,并于－１８ħ贮藏备用.１．２．３㊀基质标准曲线配制㊀称取不含３种赭曲霉毒素的咖啡空白基质样品,按１．２．２的方法处理得到基质溶液,使用该溶液配制成质量浓度为０．１~２０．０n g/m L的标准工作曲线溶液.１．２．４㊀样品前处理㊀称取１．０g(精确至０．０１g)咖啡粉碎样品至５０m L干净离心管中,加入１００n g/m L的１３C２０ＧO T A内标标准溶液２００μL及１０m L乙腈提取液(V乙腈ʒV甲酸ʒV水为６５ʒ５ʒ３０),分别漩涡超声５m i n,加入３．２g Q u E C h E R S盐包,剧烈振摇分散,１００００r/m i n 离心５m i n.吸取２m L上清液上Z a n C h E R SＧM y c o１７净化小柱,收集滤液过０．２２μm P T F E滤膜,上质谱测定.１．２．５㊀线性关系㊀以质量浓度为横坐标㊁峰面积为纵坐标,将３种赭曲霉毒素系列混合标准曲线溶液分析结果绘制校准曲线,计算相应线性方程及相关系数.１．２．６㊀检出限及定量限㊀通过测定系列混合标准曲线溶液,检出限以３倍信噪比(S/N＝３)时对应的目标物浓度换算,定量限以１０倍信噪比(S/N＝１０)时对应的目标物浓度换算.２９安全与检测S A F E T Y&I N S P E C T I O N总第２６５期|２０２３年１１月|１．２．７㊀回收率和精密度测定㊀分别选取不含３种赭曲霉毒素的咖啡生豆㊁烘焙咖啡粉㊁速溶咖啡粉作为基质,分别配制含混标溶液２,５,１０μg/k g３个水平的供试品溶液进行测定,每个水平６个平行,计算各水平目标物回收率和相对标准偏差.１．２．８㊀实际样品测定㊀采用市售的咖啡生豆(预包装)㊁咖啡生豆(散装)㊁研磨咖啡粉(预包装)㊁研磨咖啡粉(散装)㊁速溶咖啡(预包装)㊁速溶咖啡(散装)共３０个样品,主要产地为海南省,按试验建立的方法及G B５００９．２８ ２０１６进行测定,每种类型５个样品,每个样２个平行.１．２．９㊀数据处理㊀采用S P S S２２．０软件进行数据处理,采用O r i g i n８．０软件绘图.２㊀结果与分析２．１㊀质谱条件优化分别取质量浓度为２０n g/m L的O T A㊁O T B㊁O T C 和１３C２０ＧO T A标准溶液上机调谐,依次选择正㊁负离子模式扫描一级质谱,比较正㊁负离子模式的响应情况.结果发现,４种目标物采用正离子模式响应最好.继续采用正离子模式扫描二级质谱,同时选择多反应监测模式优化各目标物的其他参数,筛选最优的定性和定量离子.优化后的质谱参数见表１.表１㊀O T A㊁O T B㊁O T C和１３C２０ＧO T A的质谱参数T a b l e１㊀M S p a r a m e t e r s o fO T A,O T B,O T Ca n d１３C２０ＧO T A化合物保留时间/m i n母离子(m/z)定量(m/z)定性(m/z)碰撞能量/V去簇电压/V内标物O T A３．５０４０４．０３５８．０２３９．０２０/３３５０１３C２０ＧO T A O T B３．５１３７０．０２０５．０１８７．０２８/４８５０１３C２０ＧO T A O T C３．３１４３２．０３５８．０２３９．０２５/３６５０１３C２０ＧO T A １３C２０ＧO T A３．９７４２４．０３７７．０/２３５０/２．２㊀色谱柱及流动相的筛选试验对比了W a t e r s A C Q U I T Y U P L C B E H C１８(１．７μm,２．１mmˑ１００mm)㊁C O R T E C S T３(２．７μm,２．１mmˑ１００mm)㊁C O R T E C S T３(１．８μm,２．１mmˑ１００mm)３款类型不同填充粒径的色谱柱和０．２％甲酸水/甲醇㊁水/甲醇㊁０．２％甲酸水/乙腈㊁水/乙腈４种不同配比流动相的分离效果.结果显示,采用W a t e r sB E H C１８及C O R T E C S T３色谱柱均能分离４种化合物,其中W a t e r sB E H C１８色谱柱响应值最高,分离效果最好.李硕等[２４]采用U P L CＧM S/M S测定咖啡粉中黄曲霉毒素和杂色曲霉素,发现C１８色谱柱填料为实心核壳颗粒分离效果要优于全多孔颗粒.对比４种不同配比流动相,当流动相中添加甲酸后,峰型对称㊁信号响应更高,并随着甲酸浓度的增加,其响应不断增强.其中０．２％甲酸水/乙腈作为流动相的色谱峰型及信号响应最好.叶林链等[１２]研究发现,选择乙腈为流动相,不加酸,O T A㊁O T B的保留时间会发生漂移,加酸后能改善目标化合物的峰型.赭曲霉毒素化合物由于含较多羧酸,添加适量的酸可以使其保持分子形式有利于色谱柱的保留,促进分离[２５].因此,选择W a t e r sB E H C１８色谱柱,０．２％甲酸水/乙腈为流动相.４种化合物质谱总离子流图如图１所示.２．３㊀样品前处理条件优化乙腈作为提取溶剂具有沉淀蛋白的作用,对脂肪及蛋白含量较高的食品具有较好的选择[２６].通过加标回收试验考察了６种不同配比提取溶剂１[乙腈 水(V乙腈ʒV水为９０ʒ１０)]㊁提取溶剂２[乙腈 水(V乙腈ʒV水为７５ʒ２５)]㊁提取溶剂３[乙腈 水(V乙腈ʒV水为６５ʒ图１T C和１３C２０ＧO T A质谱总离子流图F i g u r e１㊀T o t a l i o n c h r o m a t o g r a p h y o fO T A,O T B,O T Ca n d１３C２０ＧO T A３５)]㊁提取溶剂４[乙腈 水(V乙腈ʒV水为５５ʒ４５)]㊁提取溶剂５[乙腈 水 甲酸(V乙腈ʒV水ʒV甲酸为５５ʒ４０ʒ５)]㊁提取溶剂６[乙腈 水 甲酸(V乙腈ʒV水ʒV甲酸为５５ʒ３５ʒ１０)]的提取效果.由图２可知,溶剂中加入适量水可以增强乙腈的渗透性,添加无机盐可以促进乙腈与水相分层,当V乙腈ʒV水为６５ʒ３５时,开始分层,其中V乙腈ʒV水为５５ʒ４５的分层效果最好,提取效率最高.当提取液中含有５％甲酸时,O T A㊁O T B的回收率较高,但甲酸含量过高,３种目标化合物的回收率均降低.有研究[２７]表明,体系中加入适当的酸可增强对酸敏感的真菌毒素的提取效果并降低基质效应.试验中加入适当的酸及无机盐可以使目标物保留分子形式利于提取及减少乙腈中水溶性杂质的基质效应,从而获得较高提取效果.综合考虑,选择乙腈 水 甲酸(V乙腈ʒV水ʒV甲酸为５５ʒ４０ʒ５)作为提取溶剂.３９|V o l．３９,N o．１１高云慨等:咖啡中３种赭曲霉毒素Q u E C h E R SＧU P L CＧM S/M S检测方法图提取溶剂对种化合物回收率的影响F i g u r e２㊀T h e e f f e c t o f e x t r a c t o n t h e r e c o v e r i e s o fO T A,O T Ba n dO T C２．４㊀净化方式优化研究[２８]表明,可采用不同类型净化方式去除干扰物质,提高净化效果.试验分别选用W o n d a P a k Q u E C h E R S净化管㊁Z a n C h E R SＧM y c o１７净化小柱㊁P R i m eH L B净化柱３种净化方式,以回收率为指标,考察３种目标化合物的净化情况.由图３可知,W o n d a P a k Q u E C h E R S净化管㊁Z a n C h E R SＧM y c o１７净化小柱对３种目标化合物净化效果较好,其中Z a n C h E R SＧM y c o１７净化小柱净化效果最佳,整体回收率为８５．５％~１０７．５％. Q u E C h E R S净化管采用的净化剂含有P S A㊁G C B㊁C１８,这些成分可有效去除脂类㊁糖类及色素等成分,但会对酸性及含有苯环的官能团毒素具有吸附作用,可能是导致回收率偏低的原因.P R i m e H L B净化柱能够有效去除蛋白㊁盐㊁磷脂等干扰物,但对咖啡色素的净化效果不明显,基质干扰大,导致回收率偏低.Z a n C h E R SＧM y c o１７净化小柱采用磁性金属有机骨架(MO F s)材料键合N H２基团,相比净化管具有较高的理论塔板数及选择性.因此,选取Z a n C h E R SＧM y c o１７净化方式.２．５㊀线性范围㊁检出限及定量限G a r cíaＧM o r a l e j a等[２９]以生咖啡豆为基质,建立了U P L CＧM S/M S测定O T A的方法,检出限及定量限分别为１．１３,１．４５μg/k g.由表２可知,试验方法在０．１~２０．０n g/m L的质量浓度范围内３种目标物线性关系良好,相关系数均＞０．９９９４６,检出限为０．１~０．２μg/k g,定量限为０．２~０．７μg/k g,其中O T A的检出限及定量限分别为０．２,０．７μg/k g,均小于同类方法及G B５００９．９６图净化方式对种目标化合物回收率的影响F i g u r e３㊀T h ee f f e c t o f d i f f e r e n t p u r i f i c a t i o n m e t h o d so nt h e r e c o v e r i e s o fO T A,O T Ba n dO T C２０１６中的检出限和定量限,说明试验方法的灵敏度较高.２．６㊀回收率与精密度试验基质效应是影响检测结果准确性的重要因素,减少基质效应的影响一般可选择同位素内标法和基质匹配校正法[３０－３１].鉴于咖啡基质较为复杂,试验选择内标法定量.分别选取不含目标物的咖啡生豆㊁研磨咖啡粉㊁速溶咖啡粉作为阴性样品,各添加２,５,１０μg/k g３个水平浓度O T A㊁O T B和O T C混标溶液及内标溶液,按１．２．７的方法分别计算３种化合物的平均回收率及相对标准偏差(R S D),每个浓度６个平行,结果见表３.由表３可知,３种毒素的平均回收率为７９．０％~１０３．０％,R S D为１．５％~７．６％,方法准确性和重现性较好,满足检测要求.２．７㊀实际样品测定由表４可知,３０份咖啡样品中共检出４批含有O T A,含量为０．８２~２．１５μg/k g,均低于标准规定限值(５．０μg/k g).经比对,除样品YM S４因检测结果低于标准方法定量限而无法准确定量外,试验方法测定结果与标准方法的相对标准偏差均＜１５％,说明该方法测定样品结果准确可靠.一般来说,咖啡样品中赭曲霉毒素的污染主要来自生产㊁运输㊁贮藏过程中残留毒素的直接接触及真菌侵染后产生代谢物两个方面,此次检出的４批样品中,３批来自散装贮藏,可能是由于散装咖啡密封不严㊁贮藏条件控制不当而被真菌污染产生毒素所致.生咖啡豆中O T A残留量通常会比烘焙咖啡的高,主要原因是烘焙过程中高温可一定程度上降低O T A水平[３２－３３].试验也发现,生咖啡豆O T A检出含量要高于研磨咖啡.表２㊀３种化合物的线性关系㊁检出限㊁定量限T a b l e２㊀L i n e a r e q u a t i o n,L O D s a n dL O Q s o fO T A,O T Ba n dO T C化合物线性范围/(μg L－１)回归方程相关系数检出限/(μg k g－１)定量限/(μg k g－１)O T A０．１~２０y＝２．４２０１３x－０．００３６４０．９９９７６０．２０．７O T B０．１~２０y＝２．３６７０５x－０．００６６９０．９９９６３０．２０．７O T C０．１~２０y＝１１．１２５１３x－０．０１５３８０．９９９４６０．１０．２４９安全与检测S A F E T Y&I N S P E C T I O N总第２６５期|２０２３年１１月|表３㊀３种化合物的回收率和R S DT a b l e ３㊀T h e r e c o v e r i e s a n dR S Do fO T A ,O T Ba n dO T C (n ＝６)咖啡基质化合物２μg /k g回收率/％R S D /％５μg /k g回收率/％R S D /％１０μg /k g回收率/％R S D /％咖啡生豆O T A ９３．０１．５９１．５２．３９２．０１．５O T B９２．５５．４１０３．０２．７９４．５３．７O T C ９０．０１．６９３．０１．５９９．５２．１研磨咖啡粉O T A ８３．５２．５８９．５４．０９０．０３．１O T B ８８．０１．６９３．５２．３９０．５２．３O T C ８２．０５．２８９．０４．８８３．０５．１速溶咖啡粉O T A ７９．０５．４８５．０３．３８３．５７．６O T B８２．５４．３８３．５７．６８３．５４．２O T C８０．０７．１８６．０４．９８２．５２．６表４㊀实际样品检测结果†为咖啡生豆(预包装);为咖啡生豆(散装);为研磨咖啡粉(预包装);为研磨咖啡粉(散装);S R Y 为速溶咖啡(预包装);S R S 为速溶咖啡(散装);N D 为未检出;/为无计算值;L D 为低于定量限.㊀㊀相关研究[３４]数据显示,咖啡及制品在一些国家或地区具有较高的赭曲霉毒素检出率及残留量.对实际样品检测发现,赭曲霉毒素检出率及含量均较低,另外,散装贮藏方式咖啡检出率高于预包装,说明可能存在真菌污染导致毒素积累的风险.建议在咖啡生产及销售过程中应对贮藏条件及方式加以严格控制,防止产毒真菌污染.３㊀结论采用Q u E C h E R S 前处理方法结合内标法定量,通过优化色谱质谱条件㊁提取条件和净化条件,建立了可同时测定咖啡基质中３种赭曲霉毒素的U P L C ＧM S /M S 方法.该方法相较标准方法的免疫亲和柱法更加简便㊁准确㊁灵敏,其分析时间短,适用于咖啡基质中３种赭曲霉毒素的快速筛查及定量检测.后续可结合微生物学手段明确污染源,以期为全面监测㊁评估咖啡中赭曲霉毒素的污染风险提供依据.参考文献[1]沈晓静,字成庭,辉绍良,等.咖啡化学成分及其生物活性研究进展[J].热带亚热带植物学报,2021,29(1):112Ｇ122.５９|V o l ．３９,N o ．１１高云慨等:咖啡中３种赭曲霉毒素Q u E C h E R S ＧU P L C ＧM S /M S 检测方法SHEN X,ZI C T,HUI S L,et al.Advances on chemical components and biological activities of coffee[J].Journal of Tropical and Subtropical Botany,2021,29(1):112Ｇ122.[2]VIEGAS C,PACÍFICO C,FARIA T,et al.Fungal contamination ingreen 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食品中黄曲霉毒素检测方法研究进展
中国农业科技导报，2022，24（1）：106-118Journal of Agricultural Science and Technology食品中黄曲霉毒素检测方法研究进展胡冰，时浩楠，胡本伦，赵思明，刘茹，贾才华*（华中农业大学食品科学技术学院，环境食品学教育部重点实验室，武汉430070）摘要：产毒真菌极易对食品造成污染并产生真菌毒素，尤其是谷物在生长及加工过程中，其中对人体危害较大的为黄曲霉毒素，严重危害消费者的身体健康。
高效的食品安全检测技术是保护消费者免受黄曲霉毒素毒害的有力手段。
介绍了近几年国内外食品中黄曲霉毒素检测的研究进展，重点分析了高效液相色谱法、液相色谱质谱法、酶联免疫吸附法、时间分辨荧光免疫分析法、胶体金免疫层析法、表面增强拉曼光谱法、电化学传感器法等在食品黄曲霉毒素检测中的应用及存在的问题，以期为相关研究提供参考。
关键词：食品；黄曲霉毒素；检测技术；仪器分析；免疫分析doi：10.13304/j.nykjdb.2021.0530中图分类号：TS207.5文献标志码：A文章编号：1008⁃0864（2022）01⁃0106⁃13Progress on the Aflatoxin Determination Method in FoodHU Bing，SHI Haonan，HU Benlun，ZHAO Siming，LIU Ru，JIA Caihua*（Key Laboratory of Environment Correlative Dietology，Ministry of Education；College of Food Science andTechnology，Huazhong Agricultural University，Wuhan430070，China）Abstract：Toxic fungi is easy to contaminate food and produce mycotoxins，especially in the growth and processing of cereal，among which aflatoxin is more harmful to human body，seriously endangering the health of consumers.Efficient food safety detection technology is important means to protect consumers from aflatoxin poisoning.This paper introduced the research progress of aflatoxin detection in food at home and abroad in recent years.The application and existing problems of high performance liquid chromatography（HPLC），liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS），enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），time-resolved fluorescence immunoassay （TRFIA），gold immune chromatography assay（GICT），surface enhanced Raman spectroscopy（SERS）and electrochemical sensor（ES）in the detection of aflatoxin in food were analyzed，so as to provide reference for related research.Key words：food；aflatoxin；detection technology；instrumental analysis；immunoassay民以食为天，食品安全问题是关系国计民生的大事，其中，真菌毒素对食品的污染已成为各国高度关注的食品安全问题［1］。
HPLC-MSMS测定豆类及其制品中的赭曲霉毒素A含量
T logy科技分析与检测赭曲霉毒素（ochratoxin）是一种天然存在的毒性污染物质，有A、B、C与D 4种，其中赭曲霉毒素A （ochratoxin A,简称OTA）毒性最大[1]。
赭曲霉毒素广泛存在于粮食、豆类、咖啡豆和饲料等，在存储及运输方式不当时，食品发生霉变可产生。
OTA 对动物及人类的免疫系统有显著性的破坏作用，对动物及人类肾脏、肝脏等具有致癌、致畸等作用[2-3]，所以食品中OTA含量检测至关重要。
目前，我国对于豆类及其制品中赭曲霉毒素A的定量检测方法主要包括液相色谱（HPLC）[4]和液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）法[5]。
HPLC法采用荧光检测器检测，准确性高。
LC-MS/MS法具有更高的灵敏度和高效性，但实验前处理方法对检测结果的干扰较大。
常用的净化方法有免疫亲和柱净化[6]、离子交换固相萃取柱净化[7]、酶联免疫吸附法[8]等。
此外，目前文献中对于豆类及其制品中赭曲霉毒素A测定技术的研究较少。
本研究基于LC-MS/MS检测技术，在现有检测方法基础上对豆类及其制品的赭曲霉毒素A提取及测定方法进行优化，研究成果可为实验室检测赭曲霉毒素A提供可靠依据。
1 实验部分1.1 仪器、试剂与材料 Agilent1290-6470液相色谱-三重四级杆串联质谱仪（美国，安捷伦公司）；BAS224S-CW万分之一天平（赛多利斯）；KQ-400KDE高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TGL-18高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；RE-2000B旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-IIIA循环水式多用真空泵（上海豫康科教仪器设备有限公司）；AutoVapS60氮吹浓缩仪（美国ATR）。
赭曲霉毒素A标准品（10 μg/L，Pribolab Pte Ltd），氯化钠，甲醇（AR级，国药集团）；甲醇，乙腈，甲酸（HPLC级，美国Honeywell公司）；免疫亲和柱（Romer Labs）。
高效液相色谱法测定小麦粉中赭曲霉毒素A的不确定度评定
分析检测高效液相色谱法测定小麦粉中赭曲霉毒素A的不确定度评定唐 莉（镇江市食品药品监督检验中心，江苏镇江 212000）摘 要：按照《食品安全国家标准食品中赭曲霉毒素A的测定》（GB 5009.96—2016）检测小麦粉中赭曲霉毒素A的含量，并建立不确定度分析的数学模型，对检验结果的不确定度来源进行分析及量化评定。
分析结果显示，标准曲线拟合和标准溶液的配制引入的不确定度最大。
小麦粉中赭曲霉毒素A的含量为4.62 μg·kg-1时，其扩展不确定度为0.31 μg·kg-1，k=2。
关键词：赭曲霉毒素A；不确定度；小麦粉；高效液相色谱法Evaluation of Uncertainty in the Determination of OchratoxinA in Wheat Flour by HPLCTANG Li(Zhenjiang Food and Drug Supervision and Inspection Center, Zhenjiang 212000, China) Abstract: According to GB 5009.96—2016, the content of ochratoxin A in wheat flour was detected, and a mathematical model for uncertainty analysis was established to analyze and quantitatively evaluate the sources of uncertainty in the test results. The analysis results show that the fitting of standard curves and the preparation of standard solutions introduce the greatest uncertainty. The content of ochratoxin A in wheat flour is 4.62 μg·kg-1, its expanded uncertainty is 0.31 μg·kg-1, k=2.Keywords: ochratoxin A; uncertainty; wheat flour; high performance liquid chromatography赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是一种分布广，与人类健康密切相关的真菌毒素，主要表现为慢性毒性，且具有很强的肝脏和肾脏毒性，并有致畸、致癌性，已受到全世界的广泛关注。
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食品中赭曲霉毒素HPLC检测法
1.0液相色谱条件：
色谱柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）
流动相：乙腈/水/乙酸（99+99+2）
流速：1mL/min
检测器：荧光检测器，激发波长333nm,发射波长477nm
进样体积：20-50uL
2.0 样品的提取
2.1 粮食及粮食制品：
研磨样品，但不要研成粉末，使所称样品的95%通过20目筛，置25克研磨的样品于磨口量筒中，加入5克氯化钠和100mL提取液（甲醇：1%碳酸氢钠溶液=8:2），手动震荡3分钟，然后用定量滤纸过滤，收集滤液10ml，加40ml水稀释，混匀后，用玻璃纤维滤纸过滤，收集滤液A。
2.2酒类：
取脱气酒类样品(含二氧化碳的样品使用前先置于4℃冰箱冷藏30min，超声脱气)或不含二氧化碳样品20g于磨口量筒中，用提取液（150g氯化钠，20g碳酸氢钠，水定容至1L）至100ml，混匀，用定量滤纸过滤，收集滤液B。
2.3酱油、醋、酱及酱制品：
取25g样品，用提取液（甲醇：1%碳酸氢钠溶液=8:2）定容至50ml，混匀，用定量滤纸过滤，取10ml滤液，加40ml水稀释，混匀后，用玻璃纤维滤纸过滤，收集滤液C。
3.0 亲和柱操作
3.1粮食及粮食制品：
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取10mL滤液A，注入玻璃注射器，调节压力，使上述滤液以1滴/秒的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入柱子。
用10ml 纯水以2滴/秒的流速冲洗柱子，直至空气进入柱子。
3.2酒类：
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取20mL滤液B，注入玻璃注射器，调节压力，使上述滤液以1滴/秒的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入柱子。
用5ml 纯水以2滴/秒的流速冲洗柱子，直至空气进入柱子。
3.3酱油、醋、酱及酱制品：
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取10mL滤液C，注入玻璃注射器，调节压力，使上述滤液以1滴/秒的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入柱子。
用10mlPBS缓冲液及10ml纯水以2滴/秒的流速冲洗柱子，直至空气进入柱子。
4.0 洗脱
将甲醇分配器中的1.0 mL色谱级甲醇以1滴/秒的流速淋洗柱子，并将所有的样品
洗脱液（1.0mL）收集于玻璃试管中，混匀，上机检测。