高效液相色谱法测定谷物及其制品中赭曲霉毒素A
赭曲霉毒素A标准检测规程
赭曲霉毒素A标准操作规程1、目的为了规范亲和柱净化样本中赭曲霉毒素A的操作流程，特制订本操作规程。
2、范围本标准适用于粮食、饲料、食品中赭曲霉毒素A的检测。
3、检出限和定量限项目岛津安捷伦样本检出限（µg/kg）样本定量限（µg/kg）样本检出限（µg/kg）样本定量限（µg/kg）OTA 0.28 0.84 3.6 11.9 4、职责部门名称部门职责质量管理部1、负责本制度的实施。
2、负责本制度的监督执行。
5、程序5.1 原理测定的基础是抗原、抗体反应，抗体连接在柱体内，样品经过提取、过滤后，缓慢的通过赭曲霉毒素A免疫亲和柱，在免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。
用2%乙酸甲醇洗脱赭曲霉毒素A，然后注入到高效液相色谱仪中用于检测。
5.2 溶液配制5.2.1 提取液Ⅰ（用于粮食类样品及酱油、醋类样品的提取）：80%甲醇-水溶液（V甲醇: V水=80 : 20）：取800mL甲醇，加入去离子水定容至1L。
5.2.2 提取液Ⅱ（用于酒类样品的提取）：称取150g氯化钠、20g碳酸氢钠溶于约950mL水中，加水定容至1L。
5.2.3 清洗缓冲液（用于酱油、醋类样品净化步骤的洗涤）：称取12.5g 氯化钠、2.5g 碳酸氢钠溶于水中，加0.1mL吐温-20，用水定容至1L。
5.2.4 冲洗液（用于酒类样品净化步骤的洗涤）：称取25g 氯化钠、5g碳酸氢钠于约950mL水中，加水定容至1L。
5.2.5 洗脱液（甲醇: 乙酸=49 : 1）：取1ml乙酸加入到49ml甲醇中混匀即可。
5.2.6 赭曲霉毒素A标准工作液：用色谱级甲醇将储备工作液分别稀释到20 ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2 ng/ml、1 ng/ml。
5.3 样品前处理5.3.1 粮食类----20g±0.01g样品（固体样品需粉碎，并过2mm分样筛），5g氯化钠于三角瓶中，加入100mL的提取液Ⅰ（见5.2.1）；----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用快速定性滤纸过滤，收集滤液；----取10mL滤液加入40mL去离子水稀释，混匀；----用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；----取25mL上样液过免疫亲和柱净化。
粮食中赭曲霉素A检验方法的研究进展
Apr. 2024 CHINA FOOD SAFETY169食品科技粮食中赭曲霉素A 检验方法的研究进展姜 雪（松原市粮油质量检验监测站，吉林松原 138000）摘 要：赭曲霉素A （Ochratoxin A ，OTA ）是青霉菌属与曲霉菌属共同产生的具有7种结构的二级代谢产物，在小麦、玉米、大米及大麦等粮食中广泛存在。
赭曲霉素A 可致畸，具有肾毒性、神经毒性、免疫毒性等危害，可引起动物肾脏、肝脏损伤、坏死以及肠黏膜损坏。
本文综述了粮食中赭曲霉素A 的主要检验方法，重点分析与讨论了不同检验方法优缺点，以期为更加准确、高效、便捷的检测粮食中赭曲霉素A 提供依据。
关键词：赭曲霉素A ；理化性质；检验方法Research Progress on the Detection Method ofOchratoxin A in GrainJIANG Xue(Songyuan City Grain and Oil Quality Inspection and Monitoring Station, Songyuan 138000, China)Abstract: Ochratoxin A is a secondary metabolite with seven structures produced by Penicillium and Aspergillus. It is widely found in wheat, corn, rice and barley. Ochratoxin A can cause teratogenicity, nephrotoxicity, neurotoxicity, immunotoxicity and other hazards, which can cause kidney, liver damage, necrosis and intestinal mucosal damage in animals. In this paper, the main detection methods of ochratoxin A in grain were reviewed, and the advantages and disadvantages of different detection methods were analyzed and discussed in order to provide a basis for more accurate, efficient and convenient detection of ochratoxin A in grain.Keywords: ochratoxin A; physicochemical properties; testing method1 赫曲霉毒素A 理化性质赫曲霉毒素（Ochratoxin A ，OTA ）是青霉菌属与曲霉菌属共同产生的具有7种结构的二级代谢产物，7种曲霉和6种青霉菌均能产生赭曲霉毒素。
HPLC法测定谷物食品中赭曲霉毒素A检出限、精密度、准确度试验
JOURNAL OF INSPECTION AND QUARANTINE 检验检疫学刊Vol.30No.22020年第2期1前言赭曲霉毒素是继黄曲霉毒素后又一种引起世界广泛关注的霉菌毒素,主要由多种生长在粮谷类农作物上的曲霉和青霉产生。
赭曲霉毒素主要侵害动物肝脏与肾脏,可引起肾脏损伤,大量的毒素可引起动物的肠黏膜炎症和坏死[1]。
其中,毒性最大的是赭曲霉毒素A,GB 2762—2017《食品中污染物限量》[2]中规定,谷物制品中赭曲霉毒素A 的最大限量为5.0μg/kg。
2仪器尧材料与方法2.1仪器高效液相色谱仪(HPLC 美国Waters),配荧光检测器。
2.2材料赭曲霉毒素A 免疫亲和柱:Agela,产品编号:BAC10005;甲醇(CH 3OH):色谱纯(默克);乙腈(CH 3CN):色谱纯(默克);冰乙酸(C 2H 4O 2):优级纯(天津大茂化学试剂有限公司);赭曲霉毒素A 标准物质[3]:GBW(E)100303,浓度1.9μg/mL;赭曲霉毒素A 标准储备液:用甲醇-乙腈(50+50)溶液将标物稀释10倍,配制成浓度0.19μg/mL 的标准储备液,4℃冰箱保存;提取液:乙腈+水(60+40);真菌毒素清洗缓冲液:称取25.0g 氯化钠、5.0g 碳酸氢钠溶于水中,加入0.1mL 吐温20,用水稀释至1L;磷酸盐缓冲液:称取8.0g 氯化钠、1.2g 磷酸氢钠、0.2g 磷酸二氢钾、0.2g 氯化钾溶解于约990mL 水中,用浓盐酸调节pH 至7.0,用水稀释至1L。
2.3方法2.3.1色谱条件液相色谱柱C18柱(1.7μm×2.1mm×50mm);检测器:荧光检测器(大流通池),激发波长333nm,发射波长460nm;流动相:水(含2%冰乙酸):乙腈=54∶46;第一作者E-mail:****************收稿日期:2020-02-15HPLC 法测定谷物食品中赭曲霉毒素A 检出限、精密度、准确度试验郝艳萍张胜利冯骁骄(晋中市综合检验检测中心山西晋中030600)摘要为了解晋中市综合检验检测中心是否具备高效液相色谱(HPLC )法开展谷物食品中赭曲霉毒素A 的测定检验能力,本文对HPLC 法测定谷物食品中赭曲霉毒素A 的检出限、精密度、准确度进行评价。
超高效液相色谱-串联质谱法检测中草药中赭曲霉毒素A
Ｄｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｏｃ ｈｒ ａ ｔ ｏ ｘ ｉ ｎ Ａ ｉ ｎ Ｃｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ａ ｌ ＰｌＥ Ｌ ｉ ａ ｎ ｇ － ｃ ｈ ｅ ｎ ， Ｌ Ｉ Ｕ Ｌ ｕ ， Ｚ Ｈ ＥＮＧ Ｘｕ ａ ｎ ， Ｙ Ａ ｏ Ｌ ｉ ． ｆ ｅ ｎ ｇ ， Ｆ Ｅ ＮＧ Ｊ ｉ ａ － ｗａ ｎ ｇ ， ＣＡ Ｉ Ｑ ｉ ｎ － ｒ ｅ ｎ
现 代 食 品 科 技
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２ ０ １ ６ ， Ｖ ｏ １ ． ３ ２ ， Ｎ ｏ ． １ ０
超高效液相色谱一 串联质谱法检测 中草药 中 赭 曲霉 毒素 Ａ
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免疫亲和层析净化液相色谱法检测谷物中赭曲霉毒素A
免疫亲和层析净化液相色谱法检测谷物中赭曲霉毒素A作者：李建忠张舸来源：《粮食科技与经济》2018年第06期【摘要】采用免疫亲和层析净化液相色谱法测定多种谷物（小麦、玉米和大米）样品中的赭曲霉毒素A。
提取液提取试样中的赭曲霉毒素A，经免疫亲和柱净化后，采用高效液相色谱法荧光检测器测定，外标法定量。
结果表明，不同粮食中赭曲霉毒素A在0.5～50.0ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数（r）>0.999；样品在0.3μg/kg、5.0μg/kg和10.0μg/kg 三个添加水平下的加回收率为84.4%～96.7%；方法检出限为0.3μg/kg，重复性的相对标准偏差为1.03%～3.17%。
【关键词】免疫亲和；层析净化；液相色谱法；赭曲霉毒素A赭曲霉毒素包括A、B、C、D四种结构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素A（OTA）毒性最强、分布最广、对人类和动物影响最大，广泛分布于谷物、饲料及动物体内，对食品污染的范围广泛。
毒理学研究表明，赭曲霉毒素A具有很强的肝脏毒性和肾脏毒性，并有致畸、致突变和致癌作用，许多国家对其制定了严格的限量标准，国际癌症研究机构将其定为2B类致癌物，所以控制谷物中OTA的含量至关重要。
国家标准GB 2761规定谷物及其研磨加工品中OTA限量为5.0μg/kg。
采用国标方法GB5009.96-2016中免疫亲和层析净化液相色谱法，通过加标实验测定阴性样品中OTA含量，采用的方法和所得数据为粮油质检部门提供参考。
1材料与方法1.1材料新收获玉米样品，经国标方法检测后确定为阴性样品。
锤式旋风磨粉碎，85%过孔径为1mm试验筛，制备成玉米粉样品。
1.2主要仪器与试剂LC-2010AHT液相色谱仪，配荧光检测器，日本岛津公司；HQBTWT93不锈钢均质器，北京中检维康生物技术有限公司；N-EVAPl2氮吹仪；CP512百分之一电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司；OTA标准物质，浓度均为50.0μg/mL，有国家标准物质证书；甲醇、乙腈、冰乙酸：色谱纯；10倍PBS浓缩液；水为GB/T6682规定的一级水。
粮油检测粮食中赭曲霉毒素A的测定超高效液相色谱方法编制说明
《粮油检测粮食中赭曲霉毒素A的测定超高效液相色谱方法》行业标准制定编制说明赭曲霉毒素A主要由曲霉属的赭曲霉（Aspergillus ochraceus）、洋葱曲霉(A．alliaceus)、硫色曲霉(A．sulphureus)、蜂蜜曲霉(A．melleus)、孔曲霉(A．ostianus)、佩特曲霉(A．petrakii)和菌核曲霉(A．sclerotiorum)、黑曲霉（A. niger）等, 青霉属的纯绿青霉（Penicillium verrucosum）、震颤青霉（Penicillium palitans）、团青霉（Penicillium commune）、变紫青霉（Penicillium purpursescens）、圆弧青霉（Penicillium cyclopium）等产生，对人、动物具有致病、致癌作用，被WHO的国际癌症研究组织列为2B级可疑致癌物质。
易污染玉米、大麦、小麦、燕麦、高粱、绿咖啡豆、豌豆、豆类、花生、面包、橄榄、啤酒、饲料、肉、奶酪、奶粉、干草、葡萄干、坚果。
我国食品安全国家标准《GB2761-2011 食品中真菌毒素限量》中规定谷物及豆类制品中赭曲霉毒素A限量为5 μg/kg。
目前报道用于检测赭曲霉毒素A的分析方法有酶联免疫法、免疫胶体金试纸法、生物传感器法、高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法、间接竞争免疫分辨荧光免疫分析、薄层色谱法等。
薄层色谱法由于操作复杂，目前应用较少；胶体金和酶联免疫方法用于快速筛查；普通液相色谱方法目前应用较多，但分析速度较慢，耗费溶剂较多，成本增加，环保性不足；液质联用仪检测需要高端的质谱仪。
当前急需建立一种更加灵敏、高效、低溶剂量的赭曲霉毒素A微量快速定量方法。
为了满足当前我国粮食绿色检测、监测定量分析的需要，通过查阅文献，根据范德米特(van Deemeter)方程理论，结合免疫亲和净化手段，基于UPLC分离技术，建立了一种进样量小、分离度高、快速准确、环保的赭曲霉毒素A定量分析方法。
谷类中赭曲霉毒素A的快速检测
谷类中赭曲霉毒素A的快速检测是由曲霉菌和青霉属菌株产生的一种有毒的真菌次级代谢产物,广泛存在于谷物及谷物产品、香料和咖啡豆等产品中。
赭曲霉毒素A具有很强的肝脏和肾脏毒性,并有致畸、致突变和致癌作用,严峻危害人类健康。
赭曲霉毒素普通用薄层色谱、高效液相色谱法检测,但因其操作繁杂、费用昂贵而影响实际应用。
［采样地点］农贸市场、大型超市等。
［样品］预包装、散装形式的大米、豆类等食品。
［检测原理］用法谷类中赭曲霉毒素的迅速检测（ELlSA法）。
此办法的原理是采纳间接竞争ELISA办法,在酶标板微孔条上预包被赭曲霉毒素抗原,样本中赭曲霉毒素和此抗原竞争抗赭曲霉毒素的抗体（抗试剂），加入酶标二抗（酶标物）与抗赭曲霉毒素抗体结合,再经（3,3'，,5,5'-四甲基联苯胺）（TMB）底物显色,样本吸光值与其含有的赭曲霉毒素成负相关,与标准品比较再乘以其对应的稀释倍数,即可得出样品中赭曲霉毒素的含量。
［试验材料与设备］（1）NCD- IOOA型多功能农产品平安分析仪（上海瑞鑫科技仪器有限公司）。
（2）赭曲霉毒素试剂盒（含酶标板、3倍标准品×5瓶、赭曲霉毒素抗试剂、赭曲霉毒素酶标物、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、、、去离子水）。
（3）微量移液器单道 20~200μL,200 ~1000μL。
（4）电子天平等。
［试验办法］（1）溶液的配制分离配制洗涤工作液、样品提取液、5个不同浓度的标准液等。
（2）样本前处理粉碎并取5 g有代表性的样品,加入25 mL样品提取液,同时加入2mL。
强烈振荡5min ；于5000r/min离心5min ；取中间层用蒸馏水成倍稀释,即一份中间层清液加一份蒸馏水;取稀释后液体待测。
(3)加标准品/样本加标准品/样本50uL到对应的微孔中,然后加赭曲霉毒素抗试剂50uL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应 30min。
(4)洗板当心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,用洗涤工作液300μL/孔,充分洗涤5次,每次间隔30s,用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未用法过的枪头戳破)。
HPLC-MSMS测定豆类及其制品中的赭曲霉毒素A含量
T logy科技分析与检测赭曲霉毒素（ochratoxin）是一种天然存在的毒性污染物质，有A、B、C与D 4种，其中赭曲霉毒素A （ochratoxin A,简称OTA）毒性最大[1]。
赭曲霉毒素广泛存在于粮食、豆类、咖啡豆和饲料等，在存储及运输方式不当时，食品发生霉变可产生。
OTA 对动物及人类的免疫系统有显著性的破坏作用，对动物及人类肾脏、肝脏等具有致癌、致畸等作用[2-3]，所以食品中OTA含量检测至关重要。
目前，我国对于豆类及其制品中赭曲霉毒素A的定量检测方法主要包括液相色谱（HPLC）[4]和液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）法[5]。
HPLC法采用荧光检测器检测，准确性高。
LC-MS/MS法具有更高的灵敏度和高效性，但实验前处理方法对检测结果的干扰较大。
常用的净化方法有免疫亲和柱净化[6]、离子交换固相萃取柱净化[7]、酶联免疫吸附法[8]等。
此外，目前文献中对于豆类及其制品中赭曲霉毒素A测定技术的研究较少。
本研究基于LC-MS/MS检测技术，在现有检测方法基础上对豆类及其制品的赭曲霉毒素A提取及测定方法进行优化，研究成果可为实验室检测赭曲霉毒素A提供可靠依据。
1 实验部分1.1 仪器、试剂与材料 Agilent1290-6470液相色谱-三重四级杆串联质谱仪（美国，安捷伦公司）；BAS224S-CW万分之一天平（赛多利斯）；KQ-400KDE高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TGL-18高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；RE-2000B旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-IIIA循环水式多用真空泵（上海豫康科教仪器设备有限公司）；AutoVapS60氮吹浓缩仪（美国ATR）。
赭曲霉毒素A标准品（10 μg/L，Pribolab Pte Ltd），氯化钠，甲醇（AR级，国药集团）；甲醇，乙腈，甲酸（HPLC级，美国Honeywell公司）；免疫亲和柱（Romer Labs）。
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高效液相色谱法测定谷物及其制品中赭曲霉毒素A
摘要针对谷物及其制品可能污染的霉菌毒素——赭曲霉毒素A,用免疫亲和柱净化高效液相色谱法进行了验证。
关键词赭曲霉毒素A;高效液相色谱法;谷物及其制品;OchraTest免疫亲和柱
赭曲霉毒素A是曲霉属和青霉属一些菌种的有毒产物,动物毒性试验表明,赭曲霉毒素A具有免疫抑制毒性、神经毒性、致畸性及致癌性。
1993年,国际癌症研究中心已将赭曲霉毒素A列为可能的人类致癌物。
被赭曲霉毒素A污染的谷物及其制品是人体内赭曲霉毒素A的主要来源,通过对谷物及其制品中赭曲霉毒素A的检测可以估计人体每天摄入量。
目前国际上检测赭曲霉毒素A的方法有薄层层析法、酶联免疫吸附法及高效液相色谱法等,高效液相色谱法是最常用的方法。
本文验证了用高效液相色谱法测定谷物及其制品中赭曲霉毒素A含量的方法,现报告如下。
1材料与方法
1.1试验原理
将试样与提取溶液混合后高速均质、过滤得到提取液,提取液经稀释后加入到装有赭曲霉毒素A专一化抗体的免疫亲和柱中,使样品中的赭曲霉毒素A与抗体结合。
淋洗除杂质后,以甲醇洗脱溶液使赭曲霉毒素A与抗体分离洗脱,供液相色谱定性定量测定。
1.2材料与设备
1.2.1材料。
色谱纯已腈、纯水、乙酸、磷酸盐缓冲液、色谱纯甲醇、折叠滤纸、微孔玻璃纤维滤纸、赭曲霉毒素A标准品。
1.2.2设备。
OchraTest免疫亲和柱,Agilent1100液相色谱仪(带有荧光检测器),高速均质机,手动玻璃注射器泵流架,电子天平(感量1g),谷物粉碎机。
1.3样品测定方法
1.3.1提取。
称取50g磨细的样品,置于搅拌杯中,加入100 mL乙腈水溶液(乙腈∶水=60∶40),盖上搅拌杯的盖子,高速搅拌1min,取下盖子,将提取物倒入槽纹滤纸上,滤液收集于干净的容器中。
1.3.2提取物的稀释。
移取10mL上步的滤液,置于干净的容器中,用40mL纯水将滤液稀释、混匀,将上步稀释液通过玻璃微纤维滤纸过滤器,滤液收集于玻璃注射器筒中。
1.3.3分离柱色谱操作。
将上步10mL滤液以1~2滴/s的流速全部通过OchraTest免疫亲和柱,直至空气进入到亲和柱中。
将10mL磷酸盐缓冲液以1~2滴/s的流速全部通过亲和柱,直至空气进入到亲和柱中。
将10mL纯水以1~2滴/s 的流速全部通过亲和柱,直至空气进入到亲和柱中。
用1.5mL色谱纯甲醇以1滴/s的流速淋洗亲和柱,收集全部淋洗液与2mL小瓶中,供测试用。
1.3.4测定。
液相色谱条件:色谱柱流速:1mL/min;柱温:30℃;检测波长:激发波长333nm,发射波长477nm;流动相为水∶乙腈∶乙酸=99∶99∶1;进样量:30μL。
1.3.5液相色谱测定。
赭曲霉毒素A不同浓度标准溶液的液相色谱出峰面积线性关系见表1,赭曲霉毒素A标准品的液相色谱图见图1。
1.3.6计算方法。
样品中赭曲霉毒素A(μg/kg)=C×V/m,其中,C为液相色谱仪测得的样品溶液的浓度,μg/L;V为样品溶液的定容体积,mL;m为样品质量,g。
2结果与分析
2.1流动相的选择
在其他色谱条件不变的情况下,分别用甲醇∶水∶冰乙酸(99∶99∶1)、乙腈∶水∶冰乙酸(99∶99∶1)2种溶液作流动相,赭曲霉毒素A标准溶液浓度5ug/L,进样30μL。
试验表明,甲醇∶水∶冰乙酸(99∶99∶1)流动相在30min内无色谱峰出现,乙腈∶水∶冰乙酸(99∶99∶1)流动相在 6.7min出峰,且被测组分有较高的灵敏度,所以选用了后一种溶液作流动相。
2.2回收率与精密度
2.2.1回收率试验。
在面粉样品中分别加入浓度为0.8μg/L、4.0 μg/L的赭曲
霉毒素A标准溶液,回收率分别是82.0%、96.3%。
2.2.2精密度试验。
取分别加入5μg/L、10μg/L赭曲霉毒素A标准溶液的3个样品,每份样品3个平行样,在相同条件下连续每份样品6次重复测定,每份样品测定18次,分别计算各种浓度测定结果的相对标准偏差(RSD),其结果为9.21%和7.58%。
3结论
免疫亲和柱净化高效液相色谱法测定谷物中赭曲霉毒素A不仅测定灵敏度高,准确可靠,而且快速、经济、实用。