分子诊断检验程序性能验证指南
分子诊断检验程序性能验证指南
分子诊断检验程序性能验证指南一、验证的目的1.确定检验程序与黄金标准之间的一致性，即检验结果是否与已知的阳性或阴性样本一致。
2.评估检验程序的重复性，即同一样本在不同实验条件下的检验结果是否一致。
3.评估检验程序的灵敏度和特异性，即检验程序是否可以准确地检测出阳性样本，并排除阴性样本的误检率。
4.评估检验程序的准确性和可靠性，即检验结果是否可信赖，并能够为临床诊断提供有效的信息。
二、验证的方法1.对照品验证：使用已知的阳性和阴性样本与检验程序进行对比，以评估检验程序的一致性和准确性。
2.重复性验证：对同一样本进行多次检测，比较结果的一致性和变异性，以评估检验程序的重复性和可靠性。
3.多中心验证：将检验程序应用于不同实验室的样本，比较结果的一致性和差异性，以评估检验程序的可迁移性和通用性。
4.外部质量控制验证：参加国家或行业组织的外部质量评估和质控活动，比较检验结果与标准结果的一致性，以评估检验程序的准确性和可靠性。
三、评估指标1.灵敏度：检验程序能够正确检测出阳性样本的能力。
2.特异性：检验程序能够正确排除阴性样本的能力。
3.阳性预测值：阳性结果是真阳性的概率。
4.阴性预测值：阴性结果是真阴性的概率。
5.重复性：检验程序在相同样本上进行不同实验条件下的检测结果的一致性。
6.准确性：检验结果与黄金标准结果的一致性。
7.可靠性：检验程序的稳定性和可重复性。
8.可控性：检验程序的操作是否可控，是否存在误操作的风险。
四、验证的报告和记录对于分子诊断检验程序的性能验证，应编制验证报告和记录，包括验证的目的、方法、结果和结论等内容。
报告和记录应详细描述验证过程中所采用的样本、实验条件和评估指标，并提供必要的数据和分析结果。
此外，还应包括对于验证过程中出现的问题和改进措施的说明，以便于持续的质量改进。
总之，分子诊断检验程序的性能验证是确保其准确、可靠地进行基因检测和分析的重要步骤。
通过采用对照品验证、重复性验证、多中心验证和外部质量控制验证等方法，评估其灵敏度、特异性、重复性、准确性和可靠性等性能指标，可以确保检验程序的优质和可靠性。
分子诊断试验的方法学验证
分子诊断试验的方法学验证分子诊断试验是通过分析病人的DNA、RNA、蛋白质等分子水平的变化来确定其疾病的诊断方法。
在进行分子诊断试验之前，需要经过一系列的方法学验证来保证试验的准确性和可靠性。
下面是分子诊断试验方法学验证的一般步骤。
首先，确定试验对象。
方法学验证通常是在已知的标准样本上进行，以确保试验的效果。
标准样本可以是已知的阳性样本和阴性样本，或者是已知具有特定变异的样本。
这些样本用于评估试验的灵敏性、特异性和准确性。
其次，确定实验流程。
一个完整的分子诊断试验通常包含样本提取、核酸扩增、基因测序、蛋白质分析等多个步骤。
在方法学验证中，需要明确每个步骤的操作细节，包括使用的试剂、仪器设备、温度和时间等。
然后，确定质控和质量标准。
为了保证试验结果的准确性和可靠性，需要建立质控样本和质量标准来进行监测。
质控样本通常是已知的标准样本，用于评估试验的重复性和一致性。
质量标准可以是已知浓度的标准品，用于评估试验的准确性和灵敏性。
接下来，进行实验方案的优化。
在方法学验证中，可以对实验方案进行调整和优化，以提高试验的效果。
例如，可以调整核酸扩增反应的引物和探针浓度，优化扩增条件，提高扩增效率和特异性。
然后，进行实验的重复性验证。
在进行方法学验证时，对于每个步骤都需要进行重复实验来评估试验的重复性。
重复实验应包括不同实验人员、不同时间和不同批次进行，以确保试验结果的一致性。
最后，进行数据分析和结果解读。
在方法学验证完成后，需要对试验结果进行数据分析和结果解读。
分子诊断试验的结果通常是一个定量或定性的数据，需要根据相关的标准或参考数据进行解读。
同时，还需要对结果的假阳性和假阴性等误差进行评估和分析。
总结起来，分子诊断试验的方法学验证是保证试验准确性和可靠性的重要步骤。
它包括确定试验对象、确定实验流程、确定质控和质量标准、实验方案的优化、重复性验证、数据分析和结果解读等步骤。
只有在经过充分的方法学验证后，分子诊断试验的结果才能够被应用于临床实践中，为病人的诊断和治疗提供准确的依据。
分子诊断试验的方法学验证
方法学验证的要求的修正和改进
“verification”和“validation”
• “确证试验-verification” • “验证试验-validation”
IVDs. And LDTs.
• In vitro diagnostics (IVDs):商业化生产；通过FDA 510(k) clearance or PMA (premarket approval)。
• 与确诊试验相比相对复杂
PARR+AS+AS (precision, accuracy, reportable range, reference range, analytic
sensitivity, and analytic specificity) 其他涉及的重要的评价指标
பைடு நூலகம்
Clinical validity/临床验证
• FDA cleared: In vitro diagnostics that have gone through and passed a 510(k) trial. • FDA approved: An IVD that has gone through and passed a PMA trial. • 510(k) trials are designed to show that an IVD is substantially equivalent to a legally marketed
• 主要包括：临床敏感性（clinical sensitivity）和临床特异性（clinical specificity) 。
• 临床敏感性不同于分析敏感性：分析敏感性主要指参考方法检测结果为 阳性的结果中，用实验方法得到阳性结果的一致性（对定性试验来 说）；临床敏感性主要指结果为真阳性的人群中真正罹患某种疾病或异 常的比例，强调实验结果与临床诊断的一致性。
临床分子诊断实验室的风险点与风险评估
临床分子诊断实验室的风险点与风险评估近年来，风险管理的理念在医学实验室管理中日益受到广泛重视。
风险管理指如何在一个肯定有风险的环境里把风险减至最低的管理过程。
风险管理方法是基于对风险的认识、衡量和分析，选择最有效的方式，主动地、有目的、有计划地处理风险，以最小成本争取获得最大安全保证的管理方法。
对于医学实验室的风险管理，指当检验结果影响患者安全时，实验室应评估工作过程和可能存在的问题对检验结果的影响，应修改过程以降低或消除识别出的风险，并将做出的决定和采取的措施文件化。
实验室风险评估包括实验室风险估计和风险评价两个过程。
风险估计是将危害发生概率与严重程度赋值的过程，接下来进行风险评价，估计风险与给定标准的比较，确定风险的可接受性。
总结起来，即判断实验室有哪些风险点，然后判断风险点发生的概率与它的严重程度，进而评价可接受性。
其目的是与实验室预定风险进行比较，把风险设定在可接受或可控的范围。
在临床实践中有学者认为实验室风险评估仅仅是生物安全管理，实际上实验室风险管理是基于实验室生物安全，加入检测项目风险和设备医疗安全等，最大程度保证检测人员和病人的安全。
实验室风险管理相关规范、标准有风险管理原则及指南IS027001和IS031000。
关于生产商风险管理的标准有医疗设备风险管理IS014971、识别和控制实验室误差来源的风险管理技术（FMEA、FTA x FRACAS）、CLSIEP18和CLSlEP23o基于风险管理的实验室质量控制规范可以学习ISO22367o 医学实验室可通过风险管理和持续改进减少错误，本文以分子实验室为例，介绍了实验室风险管理的实施过程。
1、标本采集的风险评估临床实验室的风险评估涉及检验前、中、后的风险评估。
1.标本采集运输保存：(1)检验前。
方法选择和标本类型关乎结果，对于新冠核酸检测可以做普通的荧光定量PCR、测序或等温扩增。
标本采集、运送和保存是质量保证的关键性环节，在采集点是否需要放置冰箱、在常温放置多久等问题都直接关系到检验质量，可通过验证放置时间、提取效率是否降低来保证质量。
分子诊断检验程序性能验证指南变异系数
分子诊断检验程序性能验证指南变异系数下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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分子诊断定量检测系统分析性能评价程序
分子诊断项目定量检测系统分析性能评价程序1 目的规范定量检测系统的分析性能评价程序，对新购置的检测系统在正式用于检测标本前对检测系统的分析性能评价，确认检测系统的分析性能符合临床要求，以保证检验结果的可靠性。
2 适用范围本程序适用于临床分子诊断中心的定量检测系统。
3 职责技术负责人和临床分子诊断中心组长共同负责检测系统分析性能评价实验方法的设计，临床分子诊断中心组长负责组织检测系统的分析性能评价实验的实施。
临床分子诊断中心员工负责执行各项性能评价实验。
4 定义和术语4.1 检测系统完成一个项目检测所涉及的仪器、试剂、校准品、检验方法、操作程序、质量控制程序、保养计划等组合为检测系统，若手工操作还包括具体操作人员。
4.2 检测系统的分析性能检测系统的分析性能不限于包括精密度、正确度、分析灵敏度等。
4.3 检测系统分析性能评价的方式4.3.1 检测系统分析性能的评价：对个检测组自行开发或研究的新检测系统或检验方法的分析性能进行确定，包括精密度、正确度、分析测量范围、临床可报告范围、分析灵敏度、生物参考区间等基本性能的实验评价，使其检验结果符合临床要求，以说明检测系统检测结果的可靠性。
4.3.2 检测系统分析性能的确认：对实验室新购置的已被政府有关部门认可了其分析性能的检验系统，实验室在投入进行患者标本检测前，需对厂家提供的性能资料中的几个分析性能进行实验以确认该检测系统是否具有预期的水平。
对检测系统分析性能的确认包括精密度、正确度、分析测量范围三种性能的评估，对生物参考区间需进行验证。
对于低值在临床上特别有意义的项目需要增加分析灵敏度性能的评估。
5 程序检测系统分析性能评价实验对操作方法如下：5.1 精密度性能评价5.1.1 选择现用的室内质控品作为实验所用样品，按照质控品的说明书进行溶解、分装和冻存。
保证实验样品的稳定性，不要反复冻融。
也可以根据需要选用患者血清作为实验样品。
5.1.2 实验前保证分析仪器状态良好，无故障。
检验项目性能验证
检验项目性能验证
3.干扰物浓度梯度设置。按下表 进行设置(可根据最高浓度采用 不同稀释方式)
4.各干扰血清的配制。将干扰物 质与基础血清比例为1：9的比例 进行配制，按下表操作
序号 干扰物
01
DH 2O
干(1)
干扰物加入 量(ul)
50
50
2 干(2) 50
3 干(3) 50
4 干(4) 50
5 干(5) 50
20xx
检验项目性能 验证ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
-
目录
检验项目性能验 证
CHAPTER 1
检验项目性能验证
检验项目性能验证
随着科学技术的不断发展，各类检验仪器设备的不断更新，临床检验实验室自动化检测系 统基本覆盖二级以上医院检验实验室，同时，多地政府、卫省健康行政部门为减轻患者就 医负担，控制不必要的重复检查，正加快推进二级甲等以上综合医院检验检查结果互认工 作，检验结果的质量是结果互认的必要前提，而检验项目的性能验证是保障检验结果质量 的最基本条件
血清量(ul)
45 0
450
450
450
450
450
对应干扰浓 度
0
1/80* 1/40* 1/20* 3/40* 1/10*
C
C
C
C
C
测定：分别测定0～5 号样本，每样本平行 测定3次，取均值统 计
5.数据处理
(1)统计：采用配对 差异实验，以0号管 为对照，判定试剂的 干扰能力；计算1—5 号管与0号管的偏差
系列 低值样本 高值样本
1
2
3
4
5
400
300
200
100
0
0
核酸检测性能验证模板
数据
样本号
FAM
ORF1ab
检测结果
样本号
FAM
ORF1ab
检测结果
S21
32.988
33.288
阳性(+)
S31
S22
S23
S24
S25
S26
S27
S28
S29
S30
变异系数FAM：CV=XX%；ORF1ab：CV=XX%,均小于5%。
验证结果
Ct值变异系数符合试剂说明书相关说明
附：性能验证原始资料存放位置说明
标准物质S2浓度
均值10000copies/ml，范围：3110~32300（邦德盛S2批号：2021131）
稀释液
病毒采样管保存液（广州简册生物，批号：CYG2021010801)
生产日期：2021-0108；有效期：24个月
稀释浓度
按质控物范围高值计，稀释64.6倍后浓度为500copies/ml（32300/64.6=500）
XXXXX医院临床基因扩增检验实验室
XXXXXX检测试剂盒（荧光PCR法）性能验证报告
验证人员
XXX,XXX
验证时间
2022XXXX
依据
CNAS-GL039 分子诊断检验程序性能验证指南（2019年2月15日发布）
医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行第二版）
验证目的
XXXX检测试剂盒新批号启用前，对试剂说明书提供的试剂性能指标进行验证，以保证检验质量，满足临床需要。
阴性
总数
阳性符合率
100.00%
试剂说明书
阴性符合率
100.00%
试剂说明书
总符合率
100.00%
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CNAS-GL039分子诊断检验程序性能验证指南Guidance on the Performance Verification for Molecular Diagnostic Procedures中国合格评定国家认可委员会前言本文件由中国合格评定国家认可委员会（CNAS）制定，是对CNAS-CL02：2012《医学实验室质量和能力认可准则》和 CNAS-CL02-A009：2018《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》中有关分子诊断相关检验程序进行性能验证实验所做的具体解释和指导，供医学实验室和评审员参考使用。
本文件为首次发布。
分子诊断检验程序性能验证指南1 范围本指南适用于申请认可或已获认可的医学实验室对分子诊断相关检测程序进行性能验证实验活动时使用，也可供医学实验室评审员在现场评审过程中参考使用。
本指南适用的分子诊断技术包括：PCR、Sanger测序、二代基因测序(NGS)、原位杂交等，其他分子诊断使用的检验程序/方法可参考使用。
本文件适用于医学实验室采用的经确认的检验程序。
注：鉴于实际临床工作中进行分子诊断的样本类型（如进行原位杂交的样本有血液、羊水穿刺、肿瘤组织等）以及预期用途差别较大，而不同样本类型对性能验证的要求和难易程度差别较大，建议结合实际情况酌情选择与之相符合的性能验证方案。
2规范性引用文件下列文件对于本指南的应用是必不可少的。
凡是注明日期的引用文件，仅该版本适用于本指南。
凡是未注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改部分）适用于本指南。
WS/T 420-2013《临床实验室对商品定量试剂盒分析性能的验证》WS/T 492-2016《临床检验定量测定项目精密度与正确度性能验证》WS/T 505-2017《定性测定性能评价指南》YY/T 1261-2015《HER2基因检测试剂盒（荧光原位杂交法）》YY/T 1459-2016《人类基因原位杂交检测试剂盒》3 术语和定义对于本指南，GB/T 29791.1-2013/ISO 18113-1：2009）中的定义适用。
下列术语和定义适用于本指南。
3.1 可报告范围 reportable range体外诊断医疗器械性能特征已被验证的测量区间。
[GB/T29791.1-2013/ISO 18113-1：2009 3.46 注1]4.总则4.1 性能验证的时机4.1.1 检验程序常规应用前。
4.1.2 任何严重影响检测系统分析性能的情况发生后，应在检测系统重新启用前对受影响的性能进行部分性能验证。
影响检测系统分析性能的情况可包括但不限于仪器主要部件故障，仪器搬迁，设施、环境的严重失控等。
4.1.3 常规使用期间，实验室可基于分析系统的稳定性，利用日常工作产生的检验和质控数据，定期对检验程序的分析性能进行评审，应能满足检验结果预期用途的要求。
新检测系统也包含现用检测系统的任一要素（仪器、试剂、校准品等）变更，如试剂升级、仪器更新、校准品溯源性改变等应按照新系统来进行验证。
4.2 性能验证的参数分子诊断检验程序的性能参数主要包括PCR定性和定量检测、Sanger测序、二代基因测序(NGS)和原位杂交等。
PCR定量检测选择验证的性能指标宜包括测量正确度、测量精密度（含测量重复性和测量中间精密度）、测量不确定度、分析特异性（含抗干扰能力）、分析灵敏度、检出限和定量限、线性区间（可报告区间）等。
PCR定性检测选择验证的性能指标宜包括方法符合率、检出限、抗干扰能力、交叉反应等。
Sanger测序和NGS选择验证的性能指标宜包括方法符合率和检出限等。
原位杂交技术应依据样本类型和预期用途，选用适宜的性能指标进行验证，如基于完整细胞的原位杂交宜选用分析敏感性和特异性，基于组织的宜选用方法符合率。
如果检验程序适用样本类型包括血清与血浆，实验室在临床检测时同时使用血清与血浆，应进行血清与血浆结果一致性的验证。
在肿瘤靶向基因检测时，如果检验程序适用样本类型包括除肿瘤组织/细胞以外的样本（如血浆），应进行与肿瘤组织结果一致性的验证。
如果检验程序高度依赖人工操作或判断，应进行不同操作人员间的验证，验证程序可参照本指南相关内容制定。
实验室应根据检测项目的预期用途以及生产制造商声明，选择对检测结果质量有重要影响的参数进行验证。
不同技术平台、样本类型以及预期用途不同时，所需验证的性能指标宜有所侧重。
4.3 性能验证的判断标准实验室应根据临床需求选择经确认的符合预期用途的检验程序。
实验室性能验证结果的判断标准是厂商或研发者在试剂盒或检测系统说明书中声明的性能指标。
5 实验前准备样本最好来自患者真实样本，尽量与厂家建立性能指标时所用材料一致。
当一份样本需进行多次试验时，对样本进行分装保存，避免反复冻融。
5.1 实验操作人员应熟悉方法原理与操作，包括样本处理、校准、维护程序、质量控制，确保检测系统工作状态正常。
5.2 实验室设施及环境符合分析系统工作要求。
5.3 仪器经过校准，各项性能指标合格。
5.4 试剂和校准品满足要求。
5.5 负责实施性能验证的人员应了解验证方案，制定验证计划，并组织实施。
5.6 涉及病理形态学的样本（如组织、细胞学样本等），需经符合资质的病理医师于显微镜下确认符合相应要求后才可进行后续检测。
需要时,可行肿瘤细胞富集。
5.7 若涉及核酸提取，应使用试剂盒配套或推荐的核酸提取试剂，并确保其提取效率满足要求。
核酸提取效率的评价宜包括：核酸浓度、纯度及完整性。
6 性能验证要求在常规应用前，应由实验室对未加修改而使用的已确认的检验程序进行独立验证。
已确认的检验程序是经国家卫生管理部门批准的体外诊断医疗器械使用说明书中规定的程序，或国际公认标准或指南中规定的程序，或国家、地区法规中规定的程序。
注：如果程序中含有与检验程序不适用的仪器、样本类型、检验方法（包括核酸提取方法）或分析软件的，则不属于已确认的检验程序。
6.1 定性项目的性能验证6.1.1 方法符合率6.1.1.1 验证要求通过与参比方法进行比较。
参比方法包括但不限于：金标准方法、行业公认方法、经验证性能符合要求满足临床预期用途的方法（如：通过ISO15189认可实验室使用的相同检测方法）。
6.1.1.2 验证方案a）样本：选取阴性样本至少5例、阳性样本（宜包含弱阳性/低扩增的样本），一般不少于10例样本。
注1：罕见或少见病种的项目，可酌情减少样本例数。
注2：若弱阳性/低扩增样本不好获取，可用适当稀释阳性样本获得类似的效果。
注3：对于杂交检测技术，若弱阳性/低扩增样本不好获取，可用不同比例的特定细胞系混合获得类似的效果。
阴性样本中应包含与检测对象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似临床症状的样本。
b）验证方法：按照患者样本检测程序，采用参比方法和候选方法平行检测。
将所有检测结果按下表汇总填表，计算符合率。
表：方法符合率验证参比方法总数阳性阴性候选方法阳性 a b a+b 阴性 c d c+d总数a+c b+d a+b+c+d 阳性符合率=a/(a+c)×100%阴性符合率=d/(b+d)×100%总符合率=(a+d)/( a+b+c+d)×100%6.1.1.3 判断标准参见4.3。
6.1.2 检出限6.1.2.1 验证要求所用检验程序在厂家试剂使用说明书等有声明检出限时，检测项目在有标准物质时，或以定量形式表达定性结果时，应进行检出限的验证。
6.1.2.2 验证方案a）样本：定值标准物质（如：国际参考品、国家参考品、厂家参考品）。
对于报告具体基因型的方法，其选用的标准物质需包括所有的突变类型。
对于检测对象同时含有不同比例的不同基因型时，应设置多个梯度，主要从扩增反应终体系总核酸浓度和突变序列所占比例两个方面进行评价。
b）验证方法：使用定值标准物质的样本梯度稀释至厂家声明的检出限浓度，可重复测定5次或在不同批内对该浓度样本进行20次重复测定（如测定5天，每天测定4份样本）。
稀释液可根据情况选用厂家提供的稀释液或阴性血清，该阴性血清除被验证的目标物必须阴性外，所含干扰物质浓度必须在厂家声明的范围之内。
6.1.2.3 判断标准如果是5次重复检测，必须100%检出靶核酸；如果是20次检测，必须检出至少18次靶核酸。
示例1：NGS和Sanger测序对于基因变异类型（如：SNV，indel，CNV，SV）的检测，均应分别进行检测限的验证，以确定不同变异类型各自的检测限。
建议使用已知突变丰度的包含所有待检测变异类型的经过福尔马林固定石蜡包埋的细胞系混合物或临床样本，将其稀释至厂家声明的检出限浓度，以及高于和低于该浓度一个梯度浓度，按照厂家声明的测序深度对该系列浓度样本进行测定（样本总数不得少于5个，每个样本检测浓度不得少于3个），如果 95%检出限浓度以上的样本检测到可靠变异，则检出限验证通过。
示例2：杂交使用经合格病理医师评估的接近最低检测限的按照一定比例混合的细胞系沉降制片/或组织切片，在不同批内对样本进行测定（如连续测定5天，每天测定4份样本），如果90%以上样本符合细胞系特性或与中心参考实验室结果相同（必要时可原片复核（快递或进行数字切片转化），则测定下限验证通过。
需说明的是，此方法不适用原位杂交，原位杂交验证见6.1.5。
6.1.3 交叉反应6.1.3.1 验证要求应验证与检测对象可能存在交叉反应的核酸物质对检测的影响。
对于病原体核酸检测来说，主要指与检测对象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似临床症状的病原体核酸，宜在病原体感染的医学决定水平进行验证。
对于报告具体基因型的方法，应在待测核酸浓度水平验证其它基因型对待测核酸测定的影响。
6.1.3.2 验证方案对于病原体核酸检测，取一定浓度与待测核酸可能存在交叉反应的病原体加入样本保存液或经确认为阴性的样本中，与常规样本一样处理，至少重复检测3次；对于基因型检测，取一定浓度经其它方法（如测序等）确认为其它基因型的样本，与常规样本一样处理，至少重复检测3次。
6.1.3.3 判断标准结果应为阴性。
6.1.4 抗干扰能力6.1.4.1 验证要求分子诊断常见的干扰物质主要包括血红蛋白、甘油三酯、胆红素、免疫球蛋白G、类风湿因子和药物等。
实验室可根据临床需求、厂家声明和样本特点（实际可能存在的干扰物质及达到的浓度）选择需要验证的干扰物质及浓度。
需要时，也应评估抗凝剂和样本保存液等对结果的影响。
6.1.4.2 验证方案实验室可根据实际情况选择验证方案。
方案1：实验组为在弱阳性样本中加入干扰物质溶液（对照组加入等量的溶剂），使得干扰物质的终浓度与厂家声明的浓度相同，与常规样本一样处理，至少重复测定3次以上。
方案2：选取含待验证的高浓度水平干扰物质且经确认不含被测物的临床样本作为实验组，选取含低浓度水平干扰物质且经确认不含被测物的临床样本作为对照组。