植物内生真菌的分离
雷公藤内生真菌的分离及活性菌株的筛选
Ｄ Ａ来证 明其 内生 菌 的存 在… 。它是 植 物 微 生 Ｎ 物 系统 中的天然 组 成成分 ， 进化 过程 中与植 物 在
康植物的各种组织和器官 内部的一类真菌 ， 被感
染 的 宿主植 物一 般不 表 现出外 在症 状 ， 可通 过组 织学 方法 或 从 经 严 格 表 面消 毒 的植 物组 织 中得
Ａ ｓ ａｔＴ ｅ ｅｕｓｉ ｉ ｔ ａ３ ｎｏｈ ｔ ｎｉｔ ｉ ｅｅｓｌｅ ｏ ｒ ｔ ｙｉｎｗｌ ｒｉＨ ｏ ｙ ｓ ｅ １－ ｂｔ ｃ：ｈ ｓｌ ｄ ａ ｄｔ ｔ ６ｅｄｐ ｙｃｕｇ ｓａ ｓ ｒ ｉ ａ ｄｆｍ Ｔｉ ｅ ｇｕ ｉｏｄｉ ｏｋｂ ｓ １ ｒ ｒ ｔ ｎｃｅ ｈ ｉｆ ｒ ｎ ｗ ｏ ｔ ｒ ｐｒ ｆ ｉ ｔ ｕ ８１ ＂
６ ６％。 ６． ７
关键词 ： 雷公 藤 ；内生真菌 ； 生物活性
中图分类 号 ：４３ Ｑ ３ ￥３ ；９５ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ：０ ４ ５４２ ｏ ）５ ３８ ５ １０ —１２ （０ ６ ｏ —００ 一ｏ
Ｔ ｅ ｓｌ ｏ ｄ ｐ ｙ ｃ ｎ ｉｒｍ ｒ ｔｙ ｉ ｉｏ ｉ Ｈ ｏ ｄｔｅ ｃｅｎ ｇ ｈ ｏ ｔ ｎｏ ｅ ｏ ｈ ｔ ｇ ｆ ｉ ａ ｉ ｆｎ ｉ ｏ Ｔｉ ｅ ｇ ｎｗｌ ｒ ｉ ｏｋａ ｒ ｉ ｐ ｒ ｕ ｆ ｄ ｎ ｈ ｓ ｅｎ
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浙江农业 学报 Ａ ｔ Ａ ｒ ｕｔｒ ｈ ｉｎｅｓ ８５ ：０ ３２２ ０ ｃ ｇｉ ｌ ａ Ｚ ｅａｇ ｎｉ１（ ）３ ８ １．０ ６ ａ ｃ ｕ 活 性 菌 株 的 筛选
申屠旭萍 ， 陈宵峰 ， 晓平 俞
（ 中国计量学院 生命科学学 院， 浙江 杭州 ３０ １ ） １ ８ ０
摘
要： 以传统药用植物雷公藤为试验材料 ， 离筛选能产抑制作物病 原真 菌的活性物质 的 内生真 菌。通 过 分
培养基配方
1、PDA培养基（用于分离、培养植物内生真菌）：马铃薯（去皮）200g , 葡萄糖20g , 蒸馏水1000 ml , 琼脂粉15g。
用于分离内生真菌时在倒平板之前加入已过滤除菌的氯霉素和硫酸链霉素各50 µ g/ml，用于抑制细菌的生长。
2、NA培养基（用于分离、培养植物内生细菌）：牛肉膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
用于分离内生细菌时在倒平板之前加入已过滤除菌的放线菌酮50µg/ml，用于抑制真菌生长。
115℃，20min 灭菌。
3、LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g 蒸馏水至1000 mL,pH=7.0；4、DSM1培养基：磷酸三钾26.631 g（pH=7.0)，二水柠檬酸三钠9.999 g，硫酸镁0.2465 g，硫酸铵19.821 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，胰蛋白胨10 g，葡萄糖1 g 蒸馏水至1000 mL，pH=7.0；5、DSM2培养基：磷酸三钾26.631 g（pH=7.0)，二水柠檬酸三钠9.999 g，硫酸镁0.2465 g，硫酸铵19.821 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，细菌学蛋白胨10 g，葡萄糖1 g 蒸馏水至1000 mL,pH=7.0；6、Msgg培养基：磷酸钾5 mmoL/L(pH7.0)，MOPs 100 mmoL/L（pH7.0），MgCl2 2 mmoL/L，CaCl2 700 mmoL/L，MnCl2 50 µM，FeCl3 50 µM，ZnCl2 1 µM，VB1 2 µM，甘油0.5 %，谷氨酸0.5 %，色氨酸50 µg/mL，苯丙氨酸50 µg/mL，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。
7、N%NA培养基：牛肉膏3.0 g，细菌学蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂粉N*10 g，8、BGM1培养基：牛肉膏3 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 5 g，磷酸三钾26.631 g（pH7.0），二水柠檬酸三钠9.999 g，硫酸镁0.2465 g，硫酸铵19.821 g，葡萄糖1 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。
商洛黄芩内生真菌分离鉴定及抗植物病原菌活性筛选
商洛黄芩内生真菌分离鉴定及抗植物病原菌活性筛选摘要:采用组织分离法从健康黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)植株的根､茎､叶中分离获得36株内生真菌,经鉴定隶属于12属,链格霉属为优势属｡对峙试验结果显示,分离获得的内生菌中有31株对一种或多种植物病原菌有不同程度的抑制作用, 占分离菌的86%;有6株菌对一种或多种病原菌的抑菌率在75%以上,占分离菌的17%｡对这6株菌培养滤液的抑菌活性也进行了测定,结果表明对峙试验中产生抑菌带的菌株其培养滤液抑菌活性也高｡在6株筛选到的活性菌株中,SBF02和SBF06对棉立枯病菌抑制效果较好;SBF08和SBF27对苹果干腐病菌抑制效果较好; SBF11和SBF27对茄腐皮病镰孢霉抑制效果较好;SBF08和SBF32分别对烟草赤星病菌和草燕麦镰孢霉抑制效果较好｡关键词:黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi); 内生真菌;分离;抑菌活性Isolation of Endophytic Fungi from Scutellaria baicalensis Growing in Shangluo Region and Screening of Their Inhibitory Activities to Plant PathogensAbstract: Thirty-six strains of endophytic fungi were isolated from the roots,stems and leaves of healthy Scutellaria baicalensis Georgi with tissue method. They were identified as twelve fungal genera among which Alternaria was the dominant genus. The results of antagonistic cultivation indicated that thirty-one strains of endophytic fungi, accounting for 86% of all the isolates, could inhibit one plant pathogens or more to some extent; and the inhibitory activity of six strains, seventeen percent of total isolates; was significant at least to one plant pathogens, with the anti-bacterial ratio higher than 75%. Antimicrobial activity of six strains’s culture filtrates were also detected and presented that the strains producing inhibition band in antagonistic cultivation also showed remarkable inhibitory activity to indicative pathogens in the test of culture filtrates. Among six screened strains, SBF02 and SBF06 showed remarkable inhibitory activity to Rhizoctonia solani Kühn, SBF08 and SBF27 showed remarkable inhibitory activities to Botryosphae riadothidea, SBF11 and SBF27 showed remarkable inhibitory activities to Fusarium solani(Mart.), and SBF08 and SBF32 showed remarkable inhibitory activities to Alternaria alternata and Fusarium avenaceum respectively.Key words: Scutellaria baicalensis Georgi; endophytic fungi; isolation; inhibitory activity内生真菌普遍存在于健康植物各种组织､器官和细胞间隙内,与宿主之间建立了紧密的生态关系,产生的次生代谢产物对提高植物对各种生物和非生物胁迫的抵抗能力发挥着重要的作用｡因此,内生菌已成为筛选新型抗生素和其他生理活性物质的重要资源[1,2]｡尤其近年来随着人们对使用化学农药存在残留､容易引发抗性和再猖獗等隐患问题的深刻认识,从药用植物中分离筛选具有生防作用的内生菌以研发生物农药更是一个新兴的研究热点[3-5]｡黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)为唇形科植物,主要以其根部入药,现代医学研究表明,黄芩含有40多种活性成分,具有抗氧化､抗过敏､抗菌､抗病毒等多方面的功效[6]｡目前有关黄芩内生真菌抗菌活性的研究主要集中在对医学病原菌的抑制方面,而对植物病原菌的抑制研究很少｡由于不同地理环境和气候条件下内生真菌有一定差异,陕西商洛地区具有从北温带向南暖湿带过渡的地理和气候特征,黄芩是驰名的五大商药之一,但对商洛黄芩内生真菌的研究尚未见报道｡本实验对商洛黄芩内生真菌进行了分离鉴定,并测定了内生真菌对5种植物病原菌的抑菌活性,以期获得具有良好抑菌活性的菌株,为寻找新型抑菌物质和研发生物农药提供依据｡1 材料与方法1.1 材料1.1.1 植物材料分离内生菌所用植物材料为黄芩,于2009年8月采自商洛香菊药源基地,取健康植株的根､茎､叶组织样品,装入保鲜袋内带回实验室,4 ℃冷藏保存,2 d内样品处理完毕｡1.1.2 供试植物病原真菌选用以下5种植物病原菌为供试靶标菌:烟草赤星病菌(Alternaria alternata),苹果干腐病菌(Botryosphae riadothidea),棉立枯病菌(Rhizoctonia solani Kühn),茄腐皮病镰孢霉[Fusarium solani(Mart.)],草燕麦镰孢霉(Fusarium avenaceum)｡供试植物病原菌由陕西省微生物研究所提供｡1.1.3 培养基内生真菌的分离纯化以及靶标菌的培养采用PDA固体培养基;内生真菌的发酵用PDA液体培养基;内生菌的鉴定用查氏培养基和促孢培养基,促孢培养基配方如下:KH2PO4 1 g, KNO3 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g,KCl 0.5 g,淀粉0.2 g,葡萄糖0.2 g,蔗糖0.2 g,琼脂20 g,水1 000 mL, pH自然｡1.2 方法1.2.1 内生真菌的分离与纯化内生真菌分离采用组织块分离法[7,8]｡将新鲜黄芩的根､茎､叶用自来水冲洗干净,分别切成约0.5 cm的小段(片),每个部位选标样32块,无菌条件下按下列程序进行表面消毒:75%乙醇(15~20 s)→无菌水(3~4次)→0.1%的升汞(3~5 min)→无菌水(4~5次),叶等幼嫩组织处理时间稍短｡再于无菌条件下将上述表面消毒的样品切成0.2 cm长的小段或0.2 cm×0.2 cm的小片接种于含0.04%氯霉素的PDA平板上,置28 ℃恒温培养5 d 左右｡待组织块断面边缘长出菌丝后,根据菌落形态和颜色等的不同用接种针挑取尖端菌丝分别移至新的PDA培养基上,反复转接纯化,得到纯培养菌株,4 ℃保藏备用｡为了检验对材料表面消毒是否彻底,以消毒后不做任何切割的样品作为对照,于相同条件下培养,如对照平板无菌丝长出则证明表面消毒灭菌彻底,分离的真菌来自植物组织内部,否则分离结果无效｡1.2.2 内生真菌的形态观察与初步鉴定挑取在PDA培养基上纯化好的菌株尖端菌丝接种于查氏培养基和产孢培养基上,培养一段时间后观察菌落､菌丝体和孢子的形态特征,参考有关文献将分离的内生真菌鉴定到属[9-11]｡以点植培养法进行菌落观察和常规镜检:用接种针从斜面上取少量孢子,点植于平板上适当的位置,倒置平板于恒温箱中, 28 ℃培养4､7､10 d,观察菌落特征｡取少量菌丝,用乳酸石炭酸棉蓝染色液染色,进行常规镜检｡以插片法观察培养基内和气生菌丝:将真菌接种到平板上,插上灭菌盖玻片后培养,使真菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上｡观察时轻轻取出盖玻片置于载玻片上,直接观察｡以印片法观察孢子及菌丝体形态:将要观察的菌落先印在盖玻片上,放置于滴有少量乳酸石炭酸棉蓝染色液的载玻片上直接观察｡根据鉴定结果,计算内生真菌的分离率｡分离率=某一指定类型内生真菌株数/分离样品组织块总数×100%1.2.3 拮抗真菌的初步筛选拮抗真菌初步筛选采用对峙培养法[6,11]:在无菌条件下将内生真菌和供试病原菌活化好,用打孔器制成直径为0.5 cm的菌饼分别移至PDA平板上,二者相距2.5 cm,同时以只接病原菌的平板作对照,处理和对照均设3次重复,置于28 ℃下恒温避光培养｡观察记录对峙培养中病原菌菌落的生长和抑菌现象,测量菌丝扩展半径,根据抑菌率初步筛选出对病原菌生长具有抑制作用的内生真菌｡抑制率=(对照菌落半径-处理菌落对峙面半径)/对照菌落半径×100%1.2.4 初筛拮抗真菌培养滤液活性的测定1)摇瓶培养:将分离的拮抗作用较好的内生真菌在斜面培养基上活化,待生长旺盛后,在无菌条件下用直径为0.5 cm的打孔器沿菌落边缘打下10块菌饼,并用接种针挑取接种至含200 mL PDA液体培养基的500 mL锥形瓶中,28 ℃,120 r/min 恒温摇床振荡培养10 d后,无菌条件下过滤除去菌丝,滤液用于代谢产物活性的测定[12]｡2)活性测定:按生长速率法,取20 mL滤液与150 mL熔化的PDA培养基(50~60 ℃)混匀制成平板, 接种直径为0.5 cm的病原菌菌饼于平板上,以不加滤液的PDA平板作对照,每个处理重复3次, 28 ℃下静置培养5 d, 测量菌落直径, 同时观察对照情况,计算抑制百分率｡2 结果与分析2.1 商洛黄芩内生真菌的分离与鉴定结果从8月份采集的商洛黄芩的96个组织块中分离到36株内生真菌,总分离率为37.50%,其中根､茎､叶各分离到14､10､12株,分离率分别为43.75%､31.25%､37.50%｡分离菌株经鉴定隶属于12个属,根､茎､叶分别有8､4､5属,优势属为链格孢属,有12株,占总分离菌的33.33%(表1)｡总体看来,商洛黄芩中分布的内生真菌比较丰富,不同组织部位内生真菌的数量相差不大,但属种分布存在明显差异｡2.2 内生真菌对病原真菌的拮抗作用筛选结果对峙培养测试表明,商洛黄芩中存在丰富的抗菌活性菌株,分离的36株内生真菌中有31株对5种植物病原菌中至少1种有不同程度的拮抗作用,占总分离真菌的86.11%(表2)｡在活性菌株中,对苹果干腐病菌有抑制作用的菌株最多,有25株,占活性菌株总数的80.65%,且14株菌抑菌率在60%以上,其中从叶部分离到的菌株SBF27的抑菌率达82.36%｡对茄腐皮病镰孢霉､烟草赤星病菌､棉立枯病菌和草燕麦镰孢霉抑菌率在60%以上的菌株分别为12､10､8和7株,综合分析得知,36株分离菌中对至少1种病原菌的抑菌率在60%以上的菌株有21株,占总菌株数的58.33%｡对峙试验显示不同内生真菌对同一病原菌的抑制效果差异较大,以对苹果干腐病菌的抑制为例,SBF23对它的抑制率是15.31%,而SBF27对它的抑菌率达82.36%;同一内生真菌对不同病原菌的抑制程度也不相同,如菌株SBF02､SBF08和SBF32对5种病原菌都有较强的抑菌率,而其他菌株只对特定的病原菌产生较强的拮抗效应,拮抗作用因病原菌的不同表现出较大的差异｡可见内生真菌对病原真菌的拮抗作用具有一定选择性｡此外,从对峙试验中发现,内生菌对病原菌的抑制作用也有多种表现形式｡有的内生菌对病原菌产生抑菌带,在显微镜下可以看到病原菌菌丝出现萎缩､断裂p 2.3 初筛菌株培养滤液的活性测定结果测定结果表明,初筛得到的6株菌的培养滤液对5种病原真菌均有不同程度的抑制作用(表3),其中SBF02和SBF06对棉立枯病菌,SBF08和SBF27对苹果干腐病菌,SBF11和SBF27对茄腐皮病镰孢霉,SBF08和SBF32分别对烟草赤星菌和草燕麦镰孢霉的抑制率都在60%以上,抑菌活性最强的是SBF27对苹果干腐病菌的抑制,抑制率为71.37%｡观察发现,培养滤液抑菌活性较高的一般都使病原菌菌落长势变慢,气生菌丝减少,显微镜下可见菌丝变短,末端膨大且少有分枝｡而对照菌丝生长正常,菌丝粗壮,分枝较多且有大量分生孢子产生｡通过比较培养滤液抑菌活性测定和对峙培养的结果发现,培养滤液抑菌活性较高的菌株原来在对峙培养中抑菌率也高且有抑菌带产生,如菌株SBF08对苹果干腐病菌的抑制等,说明这些菌株对相应病原菌的抑菌活性物质是分泌到菌丝外的｡但同时也发现,有些在对峙培养中抑菌率较高但无抑菌带产生的菌株,其培养滤液对相应病原菌的抑菌活性却比较低,如菌株SBF11对苹果干腐病菌的抑制等｡这说明它们对相应病原菌的抑制可能是借菌丝的快速生长优势,与病原菌争夺空间和营养而产生抑菌作用的｡3 结论与讨论对商洛黄芩内生菌的分离鉴定和抗植物病原菌活性测定结果表明,商洛黄芩内生菌具有丰富的多样性,属种分布在根､茎､叶中存在明显差异,活性菌株的比例也较高;实验显示隶属于不同属的菌株对同一病原菌表现出不同程度的拮抗活性,而同一属的菌株其抗菌范围以及抗菌活性既相似又有差异｡黄芩内生菌的多样性和抗菌活性的选择性表明其可以作为生防农药开发的重要资源｡实验筛选出了6株高活性的菌株,其中,SBF02(镰刀菌属)和SBF06(青霉属)对棉立枯病菌抑制效果较好;SBF08(木霉属)和SBF27(链格孢属)对苹果干腐病菌抑制效果较好;SBF11(头孢霉属)和SBF27(链格孢属)对茄腐皮病镰孢霉抑制效果较好;SBF08(木霉属)和SBF32(链格孢属)分别对烟草赤星病菌和草燕麦镰孢霉抑制效果较好｡这些菌株的种的鉴定有待进一步研究,如用分子标记方法进行聚类分析等｡内生菌对病原菌抑制作用有各种表现形式,在本实验中,对峙试验产生抑菌带的菌株其培养滤液的抑菌活性也较高,病原菌在活性物质的作用下,菌落萎缩,菌丝断裂､消解｡关于活性物质的具体成分､性质和对病原菌的作用靶点需要进一步提取和分析研究｡内生真菌在黄芩中属种分布的组织差异性可能是由于不同组织的结构､营养､代谢特征等内部环境有别,不同的内生菌在黄芩生长过程中承担的作用不同,因而使内生菌在不同的部位定植｡值得注意的是,正是由于内生菌和植物建立了密切的生态关系,一旦从寄主植物中分离出来后,自身的一些特性也会随之改变[13]｡如在试验中经常会发现,有些活性菌株经多次转接培养或长时间保存后出现菌种退化､抗菌活性降低等现象,这可能是人工培养基成分和保存条件与植物组织的差异所致｡因此,还应对活性菌株的生理生化特性进行测定,以确定内生菌离体培养､保存以及产生活性物质的最适条件,为生防农药开发奠定基础｡参考文献:[1] 史应武,娄恺,李春.植物内生菌在生物防治中的应用[J].微生物学杂志,2009,29(6):61-64.[2] 石晶盈,陈维信,刘爱媛.植物内生菌及其防治植物病害的研究进展[J].生态学报,2006,26(7):2395-2400.[3] 刘霞,党峰峰,贺晓龙,等.陕北野生甘草内生菌的分离及抑菌活性筛选[J].西北植物学报,2010,30(10):2110-2115.[4] 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9种药用植物内生或附生真菌的分离及其杀虫、抑菌活性
Ｆ Ｎ Ｌｘ ， ｎ ｕ Ａ ｉｉ ＷＵＷｅ ｑ ｎ —ａ
（ ｓ ｔ ｔ ｏ ｅ ｔ ｉｅ ｃｅ ｃ ． ｒ ｗ ｓ Ａ＆ ＦＵｎｖ ｒｉ ， ａ ｇｉｇ７ ２ ０ ， ｈ ａ ｘ ， ｉａ Ｉ ｔ ｕｅ ｆ ｓ ｃｄ ｉｎ ｅ Ｎｏｔ ｅ ｔ ｎｉ Ｐ ｉ Ｓ ｈ ｉｅｓ ｙ Ｙ ｎ ｌ １ １０ Ｓ ａ ｎ ｉＣｈｎ ） ｔ ｎ
本研究选用9种药用植物采用5种植物病原真菌5种病原细菌1种蚊幼虫进行系统的生物测定以期评价这些植物内生附生真菌的生物活性为筛选结构新颖的农药活性化合物和综合开发利用植物资源提供依据
第 ４ 卷第 ４ ８ 期
农 药
ＡＧＲ０ＣＨＥ＾ 缸ＣＡＬ Ｓ
Ｖ ． ８ ＮＯ ４ ｂ１ ４ ． ． 至 ຫໍສະໝຸດ Ａｐ ． ０９ １ ２０
我国有丰富的药用植物资源 ， 筛选可控制农作物主要 菌 （ ｕ ａ ｉｍ ｘ ｓ ｏ ｕ 、 Ｆ ｓ ｒｕ ｏ ｙ ｐ ｒ ｍ） 番茄 灰 霉 病 菌 （ ｏ ｒ ｔｓ Ｂ ｔｙ ｉ
病 虫 害的药 用 植物 ， 发现新 的有 一 定作 用特 点 的杀 虫抑 菌 ｃ ｅｅ ）玉米 弯 孢 叶斑 病菌 （ ｕ ｖ ｌｒ ｕ ａａ 、 ｉ ｒａ 、 ｎ Ｃ ｒｕａｉ ｌｎ ｔ）油菜 菌 ａ 的植 物 内生 、 附生 真 菌 ， 于 进 一 步 研 究 植 物 源农 药 、 对 开 核病菌（ｃ ｒｔ ｉ ｓｌｒｔ ｒｍ）由西北农林科技大学植 Ｓｌ ｏｉ ａ ｃ ｏｉ ｕ ， ｅ ｎ ｅ ｏ 发 利 用宝 贵 的 药用 植 物 资 源 有 十分 重 要 意义 。本 研 究 选 物病 理 室提 供 。枯 草 芽孢 杆 菌（ ａ ｉ ｕ ｕ ｔ ｉ 、 状芽 Ｂ ｃｌ ｓｓｂｉｓ 蜡 ｌ ｌ） 用 ９ 药 用 植 物 ， 用 ５ 植 物 病 原 真 菌 、 种 病 原 细 菌 、 孢杆菌（ａ ｉｕ ｅｅｓ、 种 采 种 ５ Ｂ ｃｌ ｓｃｒｕ ）金黄色葡萄球菌（ｔ ｈ ｌｃｃｕ ｌ Ｓ ｐ ｙｏｏ ｃｓ ａ ｕ ｕ ）大 ｒ Ｅｓ ｈ Ｃ ｉ ｃ ） 绿 ｒ Ｚ １ 种蚊 幼虫进行 系统 的生物测定 ， 以期评价这 些植物 内 ａ ｅ ｓ 、 肠 杆 菌 （ Ｃ ｅ ｉ ｈ ａ ｏ ｉ 、 脓 杆 菌 生、 附生 真 菌 的生 物 活性 ， 为筛 选结 构 新 颖 的农 药 活 性 化 （ ｓｕ ｏ ｎ ｓａ ｒｇｎ ｓ）购 自中国科 学 院普 通微 生物 Ｐ ｅ ｄ ｍｏ ａ ｅｕ ｉ ａ ， ｏ
5种药用植物内生真菌的分离及其抑菌活性的研究
２ ０ 年 １ 月 ０７ ２
徐 州 师范 大学 学 报 （ 自然 科 学 版 ）
Ｊ ｆＸｕ ｈ ｕ Ｎｏ ｍａ Ｕｎ ｖ Ｎａ ｕ ａ ｃｅ ｃ ｉｉｎ ．ｏ ｚ ｏ ｒ ｌ ｉ．（ ｔ ｒ ｌＳ ｉｎ ｅ Ｅｄ ｔ ） ｏ
摘 要 ： 樟 树 、 贞 、 大 功 劳 、 股 蓝 及 荔 枝 草 的 叶 片 、 柄 、 和 枝 条 等 部 位 分 离 内 生 真 菌 ， 以 金 黄 色 葡 萄 球 从 女 十 绞 叶 茎 并
菌 、 草芽孢杆菌 、 枯 大肠 杆 菌 、 脓 杆 菌 为 试 验 菌 对 分 离 的 内 生 真 菌 进 行 了 抑 菌 活 性 筛选 ． 果 从 ５种药 用植 物 中共 分 离 绿 结
步探讨 抑 菌活性 菌株 与其 宿主植 物 的某 些相 关性 ， 我们 从 这 ５种 药用 植 物 中分 离 了 内生 真菌 并 进行 了
其菌 株抑 菌活性 的研究 ， 步发现 部分 菌株 具有 抑菌 活性． 初
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
植物 样品 来源
樟树、 女贞 、 十大 功劳 、 绞股蓝 、 枝草均 采 自徐州 师范 大学校 园． 材部位 为 叶片 、 荔 取
内生 真菌 （ｎ ｏ ｈ ｔ ｕ ｇ ｓ 是指 那些 在其 生 活史 中某一 段 时 期 生活 在 活 的植 物组 织 内， ｅ ｄ ｐ ｙｉ ｆｎ ｕ ） ｃ 对植 物 组织 不引起 明显 病 害症状 的真菌 ， 包括 那些 在其 生活 史 中的某 一 阶段 营 表 面生 的腐 生 真 菌 和对 宿 主暂 时没 有伤 害 的潜 伏性病 原 真菌 和菌根 菌 ． ］ 已有研 究 表 明 ， 可从 各 种 内生 真 菌 中发 现新 抗 生 素 ． ］ 近两
青阳参内生真菌分离与鉴定
青阳参内生真菌分离与鉴定【摘要】目的：从云南民间药用植物青阳参的根、茎和叶中分离内生真菌，并进行分类鉴定。
方法：利用平板分离法分离内生真菌。
通过显微形态观察分类鉴定。
结果：从植物根、茎和叶中共分离获得34株内生真菌，其中25 株真菌经鉴定归属为5目，7 科，12个属。
结论：结果表明青阳参植物内生真菌存在多样性，不同部位内生真菌的数量、组成与种群分布存有差异。
【关键词】青阳参；内生真菌；分离；分类鉴定Isolation and Identification of Endophytic Fungi From Cynanchum Otophyllum SchneidLU Ze-bao( Chuxiong Medical College ，Chuxiong Yunnan 675005 ，China)【Abstract 】Objective ：To isolate and identify endophytic fungi from the root ，stem and leaf of Cynanchum otophyllum Schneid, which is one of Yunnan ' flok medicinal plant. Method：The methods of plate cultivation was uesd to isolate endophytic fungi. Identification of endophytic fungi was carried out by morphology. Result ：34 strains of endophytic fungi were isolatedfrom the root ，stem and leaf of plant ，which belonged to twelve genera，seven families and five orders. Conclusion ：Studies shown that the diversities of endophytic fungi in Cynanchum otophyllum Schneid made obviously a great difference inquantity ，composition and distribution.【Key words 】Cynanchum otophyllum Schneid ；Endophytic fungi ；Isolation ；Identification青阳参( Cynanchum otophyllum Schneid )是萝摩科鹅绒藤属( Cynanchum Linn. )植物，属多年生草本缠绕植物，根茎入药，一直在云南民间流传沿用，主产于云南中部、西北部和东北部地区。
《三株植物内生真菌次级代谢产物及其生物活性研究》
《三株植物内生真菌次级代谢产物及其生物活性研究》一、引言植物内生真菌是生态系统中不可或缺的组成部分，它们与宿主植物之间形成了复杂的共生关系。
近年来，随着对植物内生真菌的深入研究，越来越多的次级代谢产物被发现并展现出独特的生物活性。
本文将针对三株植物内生真菌的次级代谢产物及其生物活性进行详细研究，旨在为相关领域的研究提供理论依据。
二、材料与方法1. 材料本研究选取了三株具有代表性的植物内生真菌，分别来自不同地区和不同种类的植物。
这些真菌经过分离、纯化后，用于后续的实验研究。
2. 方法（1）次级代谢产物的提取与分离：采用适当的溶剂对内生真菌进行提取，通过柱层析、薄层扫描等技术分离出次级代谢产物。
（2）生物活性检测：通过体外实验和体内实验，检测次级代谢产物的生物活性，如抗菌、抗肿瘤、抗氧化等。
（3）结构鉴定：利用现代分析技术，如核磁共振、质谱等，对次级代谢产物的结构进行鉴定。
三、实验结果1. 次级代谢产物的提取与分离结果通过适当的溶剂提取和柱层析、薄层扫描等技术，成功分离出三株内生真菌的次级代谢产物。
这些产物在紫外灯下呈现不同的荧光特性，表明其化学结构具有多样性。
2. 生物活性检测结果（1）抗菌活性：三株内生真菌的次级代谢产物均表现出不同程度的抗菌活性，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用。
其中，某株真菌的代谢产物对某种病原菌的抑制效果尤为显著。
（2）抗肿瘤活性：通过体外实验，发现某株内生真菌的次级代谢产物具有显著的抗肿瘤活性，能够抑制肿瘤细胞的生长。
这一结果为抗肿瘤药物的研究提供了新的思路。
（3）抗氧化活性：三株内生真菌的次级代谢产物均具有一定的抗氧化活性，能够清除自由基，减轻氧化应激对机体的损伤。
3. 结构鉴定结果通过现代分析技术，成功鉴定了三株内生真菌次级代谢产物的化学结构。
这些产物包括多种酮类、酚类、萜类等化合物，具有不同的生物活性。
四、讨论本研究发现的三株植物内生真菌的次级代谢产物具有丰富的生物活性，如抗菌、抗肿瘤、抗氧化等。
蛇足石杉体内抑制乙酰胆碱酯酶活性物质的内生真菌的分离
蛇足石杉体内抑制乙酰胆碱酯酶活性物质的内生真菌的分离凌庆枝;董丽辉;范三微;何军邀;高莉莉;黄贝贝;魏兆军【摘要】[目的]从蛇足石杉体内分离筛选出具有体外抑制乙酰胆碱酯酶活性的内生真菌.[方法]取野外采集的蛇足石杉的叶、茎和根进行表面消毒后接种于PDA培养基,分离出内生真菌后进行摇瓶发酵,超声提取其发酵产物,以DTNB法检测其发酵产物在体外抑制乙酰胆碱酯酶的活性.[结果]从根、茎、叶中分离得到194株内生真菌,在马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中发酵后,对内生真菌发酵提取液进行体外AChE抑制活性检测；共有31株内生真菌显示出体外AChE抑制活性,抑制活性较强的有13株,抑制率在50.2％～80.5％.其中从蛇足石杉茎部位分离得到9株,叶部位分离得到4株.[结论]从蛇足石杉体内可分离出内生真菌,该内生真菌的发酵产物在体外有较强的抑制乙酰胆碱酯酶活性,这可能是寻找乙酰胆碱酯酶抑制药物的有效途径之一.%[Objective] To isolate endophytic fungi with acetylcholinesterase (AChE) inhibitory activities from Huperziaserrata(Thunb. ) Trev. [Method] Stems, leaves and roots of H. serrata were collected from the open field. Then, they were inoculated on PDA culture medium after the surface sterilization. Based on the isolation of endophytic fungi, shaking flask fermentation was conducted; and fermentation products were extracted by ultrasound. Inhibitory effects in vitro of fermentation products on AChE were detected by DTNB method. [ Result] A total of 194 endophytic fungi were isolated from the roots, stems and leaves. After the fermentation in potato glucose liquid medium (PDB), in vitro AChE inhibitory activity was detected in endophytic fungi fermentation extracting liquid. 31 endophytic fungi showed in vitro AChEinhibitory activity. Among them, 13 strains had relatively strong inhibitory activity, with the inhibitory rate being 50. 2% -80.5%. 9 strains were isolated from the H, serrata stems; and 4 strains were isolated from leaves. [ Conclusion ] Endophytic fungi could be isolated from the H. serrata. The fermentation products of the endophytic fungi showed relatively strong in vitro inhibitory activity to AChE, which might be one of the effective approaches to find the inhibitory drugs of AChE.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(000)030【总页数】3页(P14706-14707,14712)【关键词】蛇足石杉[Huperzia serrata(Thunb.)Trev.];内生真菌;乙酰胆碱酯酶;抑制【作者】凌庆枝;董丽辉;范三微;何军邀;高莉莉;黄贝贝;魏兆军【作者单位】浙江医药高等专科学校,浙江宁波315100;浙江医药高等专科学校,浙江宁波315100;浙江医药高等专科学校,浙江宁波315100;浙江医药高等专科学校,浙江宁波315100;浙江医药高等专科学校,浙江宁波315100;浙江医药高等专科学校,浙江宁波315100;合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽合肥230009【正文语种】中文【中图分类】S567蛇足石杉［Huperzia serrata(Thunb.)Trev.］是石杉科(Huperiaceae)石杉属(Huperzia)的蕨类植物，又名千层塔、山芝、蛇足草等，分布于东北、福建、广东、广西、云南和贵州等地。
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植物内生真菌的分离
一、实验目的
1.理解内生真菌存在的普遍性和多样性
2.掌握常规的微生物分离纯化方法
3.掌握分菌过程中的一些基本操作技能
二、实验原理
植物内生真菌( Endophyte) 是指那些在其生活史的一定阶段或
全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，而宿
主植物一般不表现出外在的症状。所有植物中几乎都存在内生菌. 由
于植物内生真菌与宿主在长期的进化过程中形成了特殊的生态关系，
因而内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的次生代谢
产物，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物越来越成为微生物次生
代谢产物的研究热点之一。
采用微生物学常规的组织分离法从植物中分离内生真菌
三、实验材料
板蓝根新鲜健康的叶片
试剂：次氯酸钠、无水乙醇、葡萄糖、琼脂、青霉素、 链霉
素
培养基：PDA培养基、分离培养基
四、实验步骤
(一)、配制PDA培养基
10月27号晚上:
(1)配置PDA培养基,用电子称称取去皮的土豆100g，煮沸30min，
4层纱布过滤，滤液加热，加入琼脂7.5克，琼脂完全融化后加入葡
萄糖10g，待稍冷却后加水至500毫升。
(2)准备10瓶无菌水，每瓶150ml左右。
(3)包好烧杯，培养皿，涂布棒等实验仪器，等待消毒。
(二)、配制分离培养基
28号中午：
（1）配置分离培养基，将PDA培养液均分成两份，一份备用，另一
份待高温灭菌后，加入青霉素100mg／L、链霉素200mg／L的混合
液20ml，即得到分离培养基。
（2）用消毒后的培养皿在通风橱中倒平板，注意在整个过程中保证
无菌操作。
(三)、采集新鲜板蓝根叶片
28号晚上到实验室外采集新鲜健康叶片完整的板蓝根叶片。
(四)、植物组织表面消毒
28号晚上将新鲜、健康的板蓝根叶片于自来水下冲洗干净，用吸水
纸吸干表面水分后剪成小段（片）做如下表面消毒处理：75%酒精漂
洗3min，无菌水冲洗4~5次，5%次氯酸钠溶液漂洗叶3min，无菌水
冲洗4~5次，无菌滤纸吸干水分。
（五）、接种并培养
28号晚上：
（1）将上述表面消毒后的材料剪切成 0.5cm 2 小块，放入含有
分离培养基的平板中（3块／每板）28℃恒温培养3~15天。最后一
次洗涤水涂布平板作为对照。
（2）取备用PDA培养液高温灭菌后，加入青霉素100mg／L、链霉
素200mg／L的混合液20ml，在通分橱中倒平板。
（六）、分离真菌
29号晚上：接种培养24小时后，观察对照组无细菌产生，说明实验
成功。
31号中午：继续培养2天后，实验组组织块边缘没有菌丝产生，放
入恒温箱继续培养。
11月1号中午：观察到实验组组织块边缘没有菌丝产生，放入恒温
箱继续培养。
11月2号晚上：观察到实验组组织块边缘有少量菌丝产生，及时采
用菌丝尖端挑取法将其转入另一PDA平板培养。
（七）、纯化
待分离培养基中长出真菌后，挑入斜面培养基中培养。