植物内生真菌的分离
植物内生菌的分离
植物内生菌的分离钱昆121140041一、实验目的1、掌握对植物内生菌的分离处理方法。
2、熟练掌握对细菌、真菌的染色观察技术。
3、了解微生物分子实验的基本操作流程。
二、实验原理在植物的生态环境中，存在着各种各样的微生物,它们有的附着于植物的表面，有的则生活于植物体内。
对于附着于植物表面和根际的微生物已有很多研究，而对于植物体内微生物的研究却刚刚起步。
但有资料显示, 一些植物内生微生物与宿主发生关系时，可明显增强宿主的抗病性，提高植物的生产力。
因此，合理利用植物的内生微生物具有重要的理论意义和实用价值。
植物内生菌作为微生物研究领域之一，近年来一直备受关注。
内生菌概念在1866年首先由Bary提出的，指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织或器官内部的微生物（主要为真菌和细菌）。
其后的很长时间内，内生菌研究进展缓慢。
直到1993 年，美国蒙大拿州立大学Strobel等从短叶红豆杉的韧皮部位分离到一株产新型抗癌物质紫杉醇的内生真菌，从而启发人们可从植物内生菌寻找与植物产生的相同或相似的化合物，由此促进了植物内生菌的研究。
植物内生菌为植物组织内的正常菌群，包括植物内生真菌、内生细菌和内生放线菌，广泛分布于各种陆生及水生的低等植物和高等植物中。
内生真菌是在宿主植物的茎和叶内生存并完成生活周期的真菌。
这类真菌中，有许多种类很少形成孢子，或者在宿生植物上形成孢子（或者孢子果），不容易识别。
真菌感染植物组织，菌丝存在于细胞内和细胞间。
与病原菌不同，这些真菌对宿主植物几乎没有害处，它们和植物之间或者是相互依存的共生关系，或者是不太密切的共生关系。
对于现已分离得到的植物内生细菌，一般可分为专性内生细菌与兼性内生细菌，前者指至今只能在植物体内分离得到的细菌；后者指能在植物根际与土壤中分离得到，也能在植物体内分离得到的细菌，而且种类居多。
根据内生细菌对宿主植物生长发育的影响可以将其分成三类：第一类对植物的作用是中性的，即尚未发现它们的内生定殖对宿主植物生长与繁殖有影响；第二类对植物生长发育有促进作用，如能提高宿主植物抗病、抗逆能力，或能通过固氮与分泌激素促进植物生长发育等；第三类对植物生长具有负面影响，在特别条件下接种到原宿主植物或另外的宿主植物会诱发植物病害。
分离植物内生真菌操作流程
分离植物内生真菌操作流程1.材料准备：植物样本、剪刀、镊子、70%乙醇、3%次氯酸钠（本实验用4?）、酒精灯、计时器、平板、锥形瓶，无菌水，离心管（带盖，灭菌）、打开无菌操作台灭菌30min。
（1）植物样本的采集：选取生长状态良好，不要有病斑或者枯枝烂叶，每种植物实行三株标本，必须具有叶子、叶柄和枝条及其他部位，将样本名字写下在小纸条上放到上装标本的袋子里，檀香的标本与写著名字的纸条一同偷拍，样本上存有脏东西时，恳请用纸轻轻盖住，若不确切植物名字，恳请将整棵植物偷拍领用作鉴别，并搞好有关记录。
（2）制作pda固体培养基，在无菌操作台中倒平板，每瓶250ml的培养基大概倒15个板，等待其凝结后用作注射。
2.清洗：认真用清水将标本洗净，洗去标本表面的灰尘，去除枯叶，备用。
3.取样：（1）在叶片的左上、右上、左下，右下和正中五个部位展开采样，穗序5mm*5mm的叶片，如果是叶柄或枝干，则剪取5~10mm，若是比较粗的枝干或圆圆的果实之类的，总之比较大的，则将它切开，再剪取样本，样本不要剪的太大或太小。
（2）每种植物的叶子，叶柄，枝干等其他部位，每种部位注射两块板，小板每个要接种五个样本即左上、右上、左下，右下和正中，小板每个接种四个样本即左上、右上、左下，右下，计算好所要剪的样本数，尽量多剪几个，以免后面的表面灭菌中冲洗时被冲掉。
（3）若植物标本存有余下，且是没烧完的，再次上装不好，放在冰箱里，水泵，洗过的扔掉。
（4）每种植物标本所剪的样本放到一个50ml的离心管中，放到试管架上，并且每个离心管上要标好所对应的植物标本。
4.表面杀菌：在无菌操作台中展开（1）先向各离心管内倒入适量（10~20ml）70%乙醇，拧紧盖子，用计时器已经开始计时1min,每10秒钟摇晃离心管几次，并使其充份杀菌。
（2）1min后，拧松盖子，将乙醇倒入事先准备的锥形瓶中，注意不要将管中样本好像出来，盛满的样本不要再放进其中，也不要用手遇到样本，样本不可以碰触至除了离心管以外的东西。
植物内生菌分离处理方法汇总
d植物内生菌分离处理方法刘明志。
南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离。
热带亚热带植物学报，2011，19(4):360～364剥取红豆杉的老树皮，截成2～3 cm长的小段，去除树皮层，先用75%酒精中浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0．1%升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗3～5次。
用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌解剖刀将小段切成0．5 cm左右长的小块，接种于加有100 mg L－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。
每皿放置10块，依次编号，置于25℃恒温培养箱中培养。
幼茎内生菌的分离方法同上，将幼茎切成1 cm长的小段，以伤口断面垂直接种于PDA固体培养基上培养。
红豆杉叶片内生菌的分离采用两种方法，第一种方法与树皮内生菌的分离方法类似，分离时将叶片切成2至3段，接种于PDA固体培养基上;第二种方法是将叶片消毒后用无菌研钵研磨成匀浆液，然后将研磨液倾倒于PDA固体培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养。
1刘金花。
黄花蒿内生菌的分离与初步鉴定。
２０１１，３３（４）：２７～３０黄花蒿的根，茎，叶，叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口），将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min，再用1%的次氯酸钙溶液浸，置于含双抗的VA培养基平板培养泡1min,用无菌水冲洗5次。
待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离。
2宋培勇，珙桐内生细菌的分离鉴定及系统发育分析，2011, 38(1): 8?13将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗 2 次, 75%酒精浸泡 1 min, 再用 2%NaClO 溶液中浸泡 3 min, 转入 75%酒精中浸泡 30 s,接着用无菌水漂洗 3 次, 平放于 NA 平板上, 28 °C培养 2?3 d。
取最后一次漂洗液涂布 NA 平板作为对照。
内生菌分离和纯化。
将 NA 平板上组织块下或周缘长出的菌落或菌苔划线稀释分离 1-2 次直到获得纯培养3孙传伯。
18株植物内生真菌的分离纯化及鉴定
采摘部位 果实、叶、茎
叶、柄、根 叶、茎 叶、茎 叶、根
果实、叶、茎 果实、叶、茎
叶、根 果实、叶、茎
叶 叶、茎
叶
植物样品 日本东北大学药用植物园，分别采 集植物 的 果 实、叶、茎、根 等 部 位，并 做 好 详 细 记 录， 见表 1； Prime STAR TAKARA 公 司； QIAEX II Gel Extraction Kit 德国 Qiangen 公司； 选择性分离培养 基 马铃薯葡萄糖琼脂 （ PDA） 加氯霉素，氯霉素终 浓度为 50 μg / mL。
苯酚 / 氯 仿 / 异 戊 醇 （ 体 积 比 25 ∶ 24 ∶ 1 ） 。 涡 旋， 15000 r / min离心 5 min，上清液转移。加 1 mL 无水 乙 醇 和 40 μL 3 mmol / L NaAc，15000 r / min 离 心 15 min，舍弃上清液。加 200 μL 70% 乙醇，15000 r / min 离心 5 min，舍弃上清液。 1.2.3 目标 DNA 片段的 PCR 扩增 真菌基因组中 编码核糖体的基因 28S rDNA 中 D1 / D2 区域序列长 度适中，适 用 于 真 菌 鉴 定［10］。 以 提 取 的 DNA 为 模 板，利用 rDNA 的保守序列设计引物，PCR 扩增未知 真菌 的 28S rDNA D1 / D2 区 域，引 物 为 NL1 （ 5' － GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG－3'） 和 NL4 （ 5' － GGTCCGTGTTTCAAGACGG － 3'） 。使 用 Prime STAR 体系，反应液总体积为 15 μL，其组成见表 2。
9种药用植物内生或附生真菌的分离及其杀虫、抑菌活性
Ｆ Ｎ Ｌｘ ， ｎ ｕ Ａ ｉｉ ＷＵＷｅ ｑ ｎ —ａ
（ ｓ ｔ ｔ ｏ ｅ ｔ ｉｅ ｃｅ ｃ ． ｒ ｗ ｓ Ａ＆ ＦＵｎｖ ｒｉ ， ａ ｇｉｇ７ ２ ０ ， ｈ ａ ｘ ， ｉａ Ｉ ｔ ｕｅ ｆ ｓ ｃｄ ｉｎ ｅ Ｎｏｔ ｅ ｔ ｎｉ Ｐ ｉ Ｓ ｈ ｉｅｓ ｙ Ｙ ｎ ｌ １ １０ Ｓ ａ ｎ ｉＣｈｎ ） ｔ ｎ
本研究选用9种药用植物采用5种植物病原真菌5种病原细菌1种蚊幼虫进行系统的生物测定以期评价这些植物内生附生真菌的生物活性为筛选结构新颖的农药活性化合物和综合开发利用植物资源提供依据
第 ４ 卷第 ４ ８ 期
农 药
ＡＧＲ０ＣＨＥ＾ 缸ＣＡＬ Ｓ
Ｖ ． ８ ＮＯ ４ ｂ１ ４ ． ． 至 ຫໍສະໝຸດ Ａｐ ． ０９ １ ２０
我国有丰富的药用植物资源 ， 筛选可控制农作物主要 菌 （ ｕ ａ ｉｍ ｘ ｓ ｏ ｕ 、 Ｆ ｓ ｒｕ ｏ ｙ ｐ ｒ ｍ） 番茄 灰 霉 病 菌 （ ｏ ｒ ｔｓ Ｂ ｔｙ ｉ
病 虫 害的药 用 植物 ， 发现新 的有 一 定作 用特 点 的杀 虫抑 菌 ｃ ｅｅ ）玉米 弯 孢 叶斑 病菌 （ ｕ ｖ ｌｒ ｕ ａａ 、 ｉ ｒａ 、 ｎ Ｃ ｒｕａｉ ｌｎ ｔ）油菜 菌 ａ 的植 物 内生 、 附生 真 菌 ， 于 进 一 步 研 究 植 物 源农 药 、 对 开 核病菌（ｃ ｒｔ ｉ ｓｌｒｔ ｒｍ）由西北农林科技大学植 Ｓｌ ｏｉ ａ ｃ ｏｉ ｕ ， ｅ ｎ ｅ ｏ 发 利 用宝 贵 的 药用 植 物 资 源 有 十分 重 要 意义 。本 研 究 选 物病 理 室提 供 。枯 草 芽孢 杆 菌（ ａ ｉ ｕ ｕ ｔ ｉ 、 状芽 Ｂ ｃｌ ｓｓｂｉｓ 蜡 ｌ ｌ） 用 ９ 药 用 植 物 ， 用 ５ 植 物 病 原 真 菌 、 种 病 原 细 菌 、 孢杆菌（ａ ｉｕ ｅｅｓ、 种 采 种 ５ Ｂ ｃｌ ｓｃｒｕ ）金黄色葡萄球菌（ｔ ｈ ｌｃｃｕ ｌ Ｓ ｐ ｙｏｏ ｃｓ ａ ｕ ｕ ）大 ｒ Ｅｓ ｈ Ｃ ｉ ｃ ） 绿 ｒ Ｚ １ 种蚊 幼虫进行 系统 的生物测定 ， 以期评价这 些植物 内 ａ ｅ ｓ 、 肠 杆 菌 （ Ｃ ｅ ｉ ｈ ａ ｏ ｉ 、 脓 杆 菌 生、 附生 真 菌 的生 物 活性 ， 为筛 选结 构 新 颖 的农 药 活 性 化 （ ｓｕ ｏ ｎ ｓａ ｒｇｎ ｓ）购 自中国科 学 院普 通微 生物 Ｐ ｅ ｄ ｍｏ ａ ｅｕ ｉ ａ ， ｏ
5种药用植物内生真菌的分离及其抑菌活性的研究
２ ０ 年 １ 月 ０７ ２
徐 州 师范 大学 学 报 （ 自然 科 学 版 ）
Ｊ ｆＸｕ ｈ ｕ Ｎｏ ｍａ Ｕｎ ｖ Ｎａ ｕ ａ ｃｅ ｃ ｉｉｎ ．ｏ ｚ ｏ ｒ ｌ ｉ．（ ｔ ｒ ｌＳ ｉｎ ｅ Ｅｄ ｔ ） ｏ
摘 要 ： 樟 树 、 贞 、 大 功 劳 、 股 蓝 及 荔 枝 草 的 叶 片 、 柄 、 和 枝 条 等 部 位 分 离 内 生 真 菌 ， 以 金 黄 色 葡 萄 球 从 女 十 绞 叶 茎 并
菌 、 草芽孢杆菌 、 枯 大肠 杆 菌 、 脓 杆 菌 为 试 验 菌 对 分 离 的 内 生 真 菌 进 行 了 抑 菌 活 性 筛选 ． 果 从 ５种药 用植 物 中共 分 离 绿 结
步探讨 抑 菌活性 菌株 与其 宿主植 物 的某 些相 关性 ， 我们 从 这 ５种 药用 植 物 中分 离 了 内生 真菌 并 进行 了
其菌 株抑 菌活性 的研究 ， 步发现 部分 菌株 具有 抑菌 活性． 初
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
植物 样品 来源
樟树、 女贞 、 十大 功劳 、 绞股蓝 、 枝草均 采 自徐州 师范 大学校 园． 材部位 为 叶片 、 荔 取
内生 真菌 （ｎ ｏ ｈ ｔ ｕ ｇ ｓ 是指 那些 在其 生 活史 中某一 段 时 期 生活 在 活 的植 物组 织 内， ｅ ｄ ｐ ｙｉ ｆｎ ｕ ） ｃ 对植 物 组织 不引起 明显 病 害症状 的真菌 ， 包括 那些 在其 生活 史 中的某 一 阶段 营 表 面生 的腐 生 真 菌 和对 宿 主暂 时没 有伤 害 的潜 伏性病 原 真菌 和菌根 菌 ． ］ 已有研 究 表 明 ， 可从 各 种 内生 真 菌 中发 现新 抗 生 素 ． ］ 近两
红树植物内生真菌的分离鉴定及抗菌活性菌株的筛选
红树植物内生真菌的分离鉴定及抗菌活性菌株的筛选陈昭华;伍菱;杨秋明;王骥妍;朱敏佳;杜希萍【摘要】本文对厦门集美红树植物无瓣海桑(Sonneratia apetala),海马齿(Sesuvium portulacastrum)和秋茄(Kandelia candel)的多个部位进行内生真菌的分离和形态鉴定,并采用菌饼法对分离到的内生真菌进行抗菌活性筛选.结果显示,从3种红树植物的根、茎、叶中分离得到25株内生真菌,分别隶属8个类群,以链格孢属和曲霉属为主,分别占菌株总数的28.0％和24.0％;有19株菌株对至少一种指示菌有抑制作用,占菌株总数的76.0％.研究结果表明,红树植物来源的内生真菌数量多,种属丰富,同时具有良好的抗菌活性,是研究抗菌活性化合物的重要资源.【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2013(022)003【总页数】4页(P263-266)【关键词】红树植物;内生真菌;分离鉴定;抗菌活性【作者】陈昭华;伍菱;杨秋明;王骥妍;朱敏佳;杜希萍【作者单位】集美大学生物工程学院,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;福建省食品微生物与酶工程重点实验室,福建厦门361021;福建省高校食品微生物与酶工程技术研究中心,福建厦门361021;厦门市食品与生物工程技术研究中心,福建厦门361021【正文语种】中文【中图分类】Q939内生真菌(endophyte)是指生活于健康植物组织内部、不引发植物产生明显病症的一类真菌。
不但对促进宿主植物的生长发育，增强抗逆性起到重要作用，而且许多内生真菌能产生与宿主相同或相似的生物活性物质［1-2］。
目前已从植物内生真菌中发现多种具有抗肿瘤、抗病毒、降血糖、抗菌、杀虫、免疫抑制、酶抑制剂或激活剂等活性代谢产物，在医药业、农业的生物防治方面都显示出重要的应用价值［3-6］。
植物黄芪根内生真菌的分离
株 ， 肉膏蛋 白胨 固体 培养基 中得到 内生真 菌 ２株 ； 牛 菌株 在 Ｐ Ａ培养 基 中长势 最好 ， 分离 得 到 的 内生 Ｄ 且 真菌数 量最 多 （ １ 。用 ４种 不 同 的培 养基 进行 黄 表 ） 芪 内生 真菌 的分 离 时 ，Ｄ Ｐ Ａ培 养基 无 论 是 在提 取 菌 的数量 上 ， 是在 菌 的生 长 状 态上 都 要 明显 好 于 其 还 他 ３种培 养基 。因此 ， 确定 Ｐ Ａ培养 基 为本实 验 最 Ｄ 佳 的提取 分离 黄芪 内生真菌 的培 养基 。
１２２ 内生真 菌的分 离纯化及 培 养基 的筛选 ．． 组织培 养 ： 择无 病斑 新鲜黄 芪根块 冲洗 干净 ， 选 晾至表面无 水珠 ， 主根 切 成 约 ３ｃ 长 的小 段 ， 取 ｍ 注
角瓶 （ 海五 一玻璃 仪器 厂 ） 上 。
试验试药 ： 牛肉膏 、 酵母提取物、 胰化蛋白胨 、 蛋 白胨、 可溶性淀粉 （ 北京奥博 星生物技术有限责任 公司） 琼脂 （Ａ Ａ ．Ｏ ＯＤ Ｅ Ｇ Ａ Ｄ ； ； Ｊ Ｐ Ｎ Ｘ Ｉ Ｎ Ｌ Ｎ ） 葡萄糖 （ 分析纯 ， 天津基准化学试剂有 限公 司） 医用酒精 ；
蒙 古 黄 芪 ［ ｓａａ ｓｍ ｍ ｒｎｃ ￣（ ｉ ． Ａｔ ｇｌ ｅ ｂ ａｅ ｒ ｕ ａ ｕ Ｆｓ ） ｈ Ｂ ｅ ａ ｏｇ ｏｃｓ（ ｇ． ｓ ｏ 为 名贵 中药 ｇ．ｖｒ ．ｍ ｎｈｌｕ Ｂｅ ）Ｈ ｉ ］ ｉ ａ 材。但 目前对其过度 的采挖 ， 已造成传统道地黄芪 已远远 不能 满足市 场 需求 Ｊ 因此 从 天然 药 用微 。
意保持切 口的整齐。 培养组织表面消毒： 自来水冲洗干净，５ 乙醇 ７％ 漂洗 ３ ｉ， ｎ 无菌水冲洗 ３ ， ％ 的次氯酸钠溶液 ｍ 次 １ ０ 浸泡 ７ ｉ， ｎ 无菌水冲洗 ３ ， ｍ 次 每次 ２ ｉ。为检查材 ｎ ｍ 料表面消毒是否彻底做对照实验如下 ： ①接组织块 ： 将 与上述 同样 条件 处 理过 的根 段不 作 分 割 ， 接 种 直
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植物内生真菌的分离
一、实验目的
1．理解内生真菌存在的普遍性和多样性
2.掌握常规的微生物分离纯化方法
3.掌握分菌过程中的一些基本操作技能
二、实验原理
植物内生真菌( Ｅnｄophｙte) 是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，而宿主植物一般不表现出外在的症状。
所有植物中几乎都存在内生菌. 由于植物内生真菌与宿主在长期的进化过程中形成了特殊的生态关系,因而内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的次生代谢产物，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物越来越成为微生物次生代谢产物的研究热点之一。
采用微生物学常规的组织分离法从植物中分离内生真菌
三、实验材料
板蓝根新鲜健康的叶片
试剂:次氯酸钠、无水乙醇、葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素
培养基：PDA培养基、分离培养基
四、实验步骤
（一)、配制PDA培养基
10月27号晚上：
(1）配置ＰDA培养基,用电子称称取去皮的土豆10０g，煮沸30min，4层纱布过滤，滤液加热,加入琼脂７.5克，琼脂完全融化后加入葡萄糖10g，待稍冷却后加水至5０0毫升。
(2)准备1０瓶无菌水，每瓶150ml左右。
(3)包好烧杯,培养皿，涂布棒等实验仪器，等待消毒。
(二)、配制分离培养基
28号中午：
（1）配置分离培养基，将PDA培养液均分成两份，一份备用,另一份待高温灭菌后,加入青霉素１0０mg／L、链霉素200mg/L的混合液20mｌ，即得到分离培养基。
（2）用消毒后的培养皿在通风橱中倒平板,注意在整个过程中保证无菌操作。
(三)、采集新鲜板蓝根叶片
２8号晚上到实验室外采集新鲜健康叶片完整的板蓝根叶片。
(四)、植物组织表面消毒
2８号晚上将新鲜、健康的板蓝根叶片于自来水下冲洗干净，用吸水纸吸干表面水分后剪成小段(片）做如下表面消毒处理:75%酒精漂洗3ｍin，无菌水冲洗4~5次,5％次氯酸钠溶液漂洗叶3ｍin,无菌水冲洗4~5次，无菌滤纸吸干水分。
（五）、接种并培养
28号晚上:
(1）将上述表面消毒后的材料剪切成0.５ｃm 2 小块,放入含
有分离培养基的平板中(3块／每板)28℃恒温培养3～15天。
最后一次洗涤水涂布平板作为对照。
（2)取备用PDＡ培养液高温灭菌后,加入青霉素100mg/L、链霉素２00ｍg/L的混合液2０mｌ,在通分橱中倒平板。
（六）、分离真菌
29号晚上：接种培养24小时后,观察对照组无细菌产生，说明实验成功。
３1号中午：继续培养2天后,实验组组织块边缘没有菌丝产生，放入恒温箱继续培养。
１1月1号中午:观察到实验组组织块边缘没有菌丝产生，放入恒温箱继续培养。
1１月2号晚上:观察到实验组组织块边缘有少量菌丝产生,及时采用菌丝尖端挑取法将其转入另一ＰDＡ平板培养。
（七）、纯化
待分离培养基中长出真菌后，挑入斜面培养基中培养。