植物内生真菌的分离新选.
云南榧树内生真菌的分离
云南榧树内生真菌的分离云南省是我国的真菌资源丰富的地区之一，其中云南榧树内生真菌的研究也备受关注。
榧树是云南省的一种重要经济林木，同时也是许多生物的栖息地。
内生真菌是指生长在植物体内或组织中的真菌，其种类繁多，对植物的生长和发育起着重要的作用。
因此，对云南榧树内生真菌的研究具有重要的意义。
本文通过对云南地区采集的榧树样品进行内生真菌的分离和鉴定，对云南榧树内生真菌的种类及分布进行了初步研究。
一、实验材料和方法实验材料：本次实验采集了来自云南省昆明市周边地区的榧树样品共10份。
实验方法：将采集来的榧树样品进行消毒处理，然后采用镊子、医用抽头等器具将样品表面的杂质去除，随后用刀片在样品表面刮下一小块组织，进行真菌的分离培养。
将所得培养基分别置于25℃、30℃、35℃等不同温度下进行诱导分离。
分离得到的真菌菌株进行培养和保存。
二、实验结果和分析对所得各菌株进行常规形态学观察、孢子形态观察等鉴定几个层次的实验，结果显示样品中共分离出8个内生真菌菌株。
经过鉴定，这些菌株分别属于炭角菌属、轮枝菌属、隐芽孢菌属、多孔菌属、链格孢菌属、词锭菌属等6个属。
其中最常见的是炭角菌属，其次是轮枝菌属。
其菌丝与菌落颜色等特征与已有描述基本一致。
通过对各菌株的形态特征观察和文献对比，可以初步确定这些内生真菌菌株的分类和储存方式。
研究结果显示，云南榧树内生真菌菌株的种类繁多，且分布较广，具有一定的区域性差异。
三、结论和展望本次实验结果可以初步了解云南榧树内生真菌的物种组成和分布情况，这对于进一步开展该地区真菌资源的系统研究有着重要的意义。
随着科技的不断进步，现代分子技术的应用可以更加准确地鉴定各种内生真菌的分类及特性，有望为该地区真菌资源的有效利用和开发提供更好的基础。
同时，本研究也为进一步研究真菌与植物共生关系提供了一定的依据，有利于探讨云南榧树的生态环境和生活习性。
雷公藤内生真菌的分离及活性菌株的筛选
Ｄ Ａ来证 明其 内生 菌 的存 在… 。它是 植 物 微 生 Ｎ 物 系统 中的天然 组 成成分 ， 进化 过程 中与植 物 在
康植物的各种组织和器官 内部的一类真菌 ， 被感
染 的 宿主植 物一 般不 表 现出外 在症 状 ， 可通 过组 织学 方法 或 从 经 严 格 表 面消 毒 的植 物组 织 中得
Ａ ｓ ａｔＴ ｅ ｅｕｓｉ ｉ ｔ ａ３ ｎｏｈ ｔ ｎｉｔ ｉ ｅｅｓｌｅ ｏ ｒ ｔ ｙｉｎｗｌ ｒｉＨ ｏ ｙ ｓ ｅ １－ ｂｔ ｃ：ｈ ｓｌ ｄ ａ ｄｔ ｔ ６ｅｄｐ ｙｃｕｇ ｓａ ｓ ｒ ｉ ａ ｄｆｍ Ｔｉ ｅ ｇｕ ｉｏｄｉ ｏｋｂ ｓ １ ｒ ｒ ｔ ｎｃｅ ｈ ｉｆ ｒ ｎ ｗ ｏ ｔ ｒ ｐｒ ｆ ｉ ｔ ｕ ８１ ＂
６ ６％。 ６． ７
关键词 ： 雷公 藤 ；内生真菌 ； 生物活性
中图分类 号 ：４３ Ｑ ３ ￥３ ；９５ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ：０ ４ ５４２ ｏ ）５ ３８ ５ １０ —１２ （０ ６ ｏ —００ 一ｏ
Ｔ ｅ ｓｌ ｏ ｄ ｐ ｙ ｃ ｎ ｉｒｍ ｒ ｔｙ ｉ ｉｏ ｉ Ｈ ｏ ｄｔｅ ｃｅｎ ｇ ｈ ｏ ｔ ｎｏ ｅ ｏ ｈ ｔ ｇ ｆ ｉ ａ ｉ ｆｎ ｉ ｏ Ｔｉ ｅ ｇ ｎｗｌ ｒ ｉ ｏｋａ ｒ ｉ ｐ ｒ ｕ ｆ ｄ ｎ ｈ ｓ ｅｎ
维普资讯
浙江农业 学报 Ａ ｔ Ａ ｒ ｕｔｒ ｈ ｉｎｅｓ ８５ ：０ ３２２ ０ ｃ ｇｉ ｌ ａ Ｚ ｅａｇ ｎｉ１（ ）３ ８ １．０ ６ ａ ｃ ｕ 活 性 菌 株 的 筛选
申屠旭萍 ， 陈宵峰 ， 晓平 俞
（ 中国计量学院 生命科学学 院， 浙江 杭州 ３０ １ ） １ ８ ０
摘
要： 以传统药用植物雷公藤为试验材料 ， 离筛选能产抑制作物病 原真 菌的活性物质 的 内生真 菌。通 过 分
内生真菌的分离与鉴定实验报告
植物内生真菌的分离与鉴定目录：一、背景（目的）二、材料与方法1、材料1.1、大叶女真的叶、茎1.2、培养基2、方法：2.1、采样方法2.2样本前处理方法2.3、分离方法2.4、培养方法2.5、形态鉴定2.5.1、菌落形态观察2.5.2、微观形态2.6、分子生物鉴定2.6.1、菌丝体的培养方法2.6.2、基因的提取方法2.6.3、ITS序列扩增2.6.3.1、引物、序列2.6.3.1、PCR反应体系2.6.3.2、PCR反应条件（循环次数）2.7、测序2.7.1、方法2.8、序列分析方法2.9、结果与分析植物内生真菌的分离与鉴定一、试验目的（背景）真菌是吸收异养型的真核生物种类繁多植物内生真菌是一大类尚未被充分认识的菌许多真菌学家对此了解也不多。
从已有研究结果来看内生真菌具有重要的生态学意义和经济意义，其物种多样性也是非常丰富的，植物的生长环境直接影响内生真菌的生物多样性，植物物种的年代越久远，其生物内生真菌的多样性越丰富：抗病原性能越强的植物，其所含的内生真菌具有抗菌活性的可能行就越大；其所含的内生真菌有可能产生与植物相同或相似的抗菌无知或产生抗菌活性物质可能参与了药用植物的抗菌过程，本实验通过植物病原真菌和G+、G-细菌的抑制实验发现茎，根，花，种子或果实内生真菌的代谢产物具有不同程度的抑菌能力，并且对G+、G-有普片遍的抑菌作用。
研究和开发内生真菌的寻找新的抗菌活性物质具有广泛的应用前景。
当今世界，生物技术已迈入世界经济的支柱产业，真菌学在生物技术的大潮中得到了长足的发展。
真菌是原始的真核生物，具有广泛的多样性，真菌生长我繁殖迅速，在很短的时间内就可以得到比动物和植物多得多的后代，能够直接、快速地进行遗传性状分离的分析。
因此，真菌可以作为研究基础生物学过程中的一个重要工具，真菌基因的多样性以及真菌分子生物学的发展，为生物技术产业提供了一个广阔的天地。
二、试验材料与方法：（一）：材料1、大叶女真的茎，叶片2、药品与试剂：葡萄糖、蛋白胨、KH2P04·3H2O、MgSO4·7H2O，马铃薯、琼脂。
植物黄芪根内生真菌的分离
植物黄芪根内生真菌的分离马伟;贾艳姝;李娜;龚贺;张艳贺【摘要】An experiment was conducted to isolate endophytic fungi from healthy root of Astragalus membranaceus var. mongholi-cus under different conditions by means of surface disinfection and selection of culture medium. The morphological identification of the fungi was made. Result showed that the surface disinfection method was effective. Different numbers of endophytic fungal strains were obtained on four kinds of culture media. The morphological characteristics of the endophytic fungi observed through the microscope were analyzed. A total of 28 strains of endophytic fungi were isolated from the healthy root of A. membranaceus var. mongholicus, which belong to seven genera.%以蒙古黄芪健康植株上的块根为材料,经过表面消毒、培养基选择,在不同培养条件下分离获得内生真菌,并对其进行形态学鉴定.结果显示:表面消毒方法有效,4种培养基上分别获得不同数目的内生真菌株,显微镜下获得了内生真菌形态特征.分离获得黄芪内生真菌28株,分列在7个菌属中.【期刊名称】《东北林业大学学报》【年(卷),期】2012(040)004【总页数】3页(P62-63,116)【关键词】黄芪;内生真菌;形态鉴定【作者】马伟;贾艳姝;李娜;龚贺;张艳贺【作者单位】黑龙江中医药大学哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学哈尔滨150040;黑龙江中医药大学哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学哈尔滨 150040【正文语种】中文【中图分类】S567.2蒙古黄芪［Astragalus membranaceus(Fish.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao］为名贵中药材。
玉兰植物内生真菌的分离筛选及活性菌株研究
ｆ ） １
根据菌株 的菌落 （ 长速度 、 色、 薄 、 生 颜 厚 质
地、 形状等） 菌丝（ 、 颜色、 有无 隔、 长宽等） 分生孢 、 子 （ 生 方式 、 状 、 色 、 小 、 无 隔等 ） 分 生 着 形 颜 大 有 、
孢子 梗 （ 着生 方 式 、 色 、 度 、 枝 等 ） 产 孢 器 、 颜 长 分 、 发 酵液 等各 种 性 状 进 行 检 索 鉴 定 到 属． 类 鉴 定 分
１０ ｍ ２ Ｌ培养 液 的 ５ ０ｍＬ三 角瓶 内 ， ２ ０ 在 ５℃ ，６ １０
表 １ 玉 兰 不 同 部 位 内 生 真 菌 的 分 离 结 果
Ｔ ｂ ｅ １ Ｔ ｅ ｓ ｐ ｒｔ ｇｒ ｓ ｌ ｏ ｎ ｏ ｈ ｔ ｕ ｇ ｒ ｍ ｄｆ ｒ ａ ｌ ｈ ｅ ａ ａｉ ｅ ｕｔ ｆｅ ｄ ｐ ｙ ｉ ｆ ｎ ｉ ｏ ｉ ｅ — ｎ ｃ ｆ ｆ
第 １ ０卷
２１ 年 ０ １
第 ５期
ｌ ０月
广州 大学 学报 （ 自然科学 版 ）
Ｊｕ ａ ｏ ｕ ｎｚｏ ｎｖｒｉ （ ａ ｒ ｃｅｃ ｄｔ ｎ ｏｒ ｌ ｆ ａｇｈ ｕＵ ｉｅｓｙ Ｎ ｔ ａ Ｓｉ ｅＥ ｉｏ ） ｎ Ｇ ｔ ｕｌ ｎ ｉ
Ｖ（ ．１ Ｎ０ ５ ） ０ １ ．
从 表 １ 知 ， 玉兰 中共 分离 出 ６ 可 从 ９株 内生真
菌 ， 中绝大 多数 分离 自玉 兰 的根 及 茎 部分 ， 占 其 约
总 菌株 数 的 ９ ． ０ ， １３ ％ 而从 叶片 中分 离获 得 的内生
用蒸 馏水 将粗 提产 物 稀 释 成 ３个 浓 度 并 与灭 菌 的定量 培养 基混 合后 ， 倒入 直 径 为 ９ＣＩ ｌ 的培养 Ｔ 皿 内制成 含毒 培养 基 ， 个浓 度 重 复 ３次 ． 直 径 每 用 为 ５ｍ 的打 孔 器在 培 养 好 的供 试 菌 落 边 缘 切 下 ｍ 菌饼 反接 于 培养皿 内 ， 于恒 温 培养 箱 中 ２ 置 ５℃ 培
植物内生真菌分离培养的研究方法
$对不同生态环境下或不同地区的同种宿主 的某一组织采样时进行精心挑选， 发现的真菌可 能更为多样。改变培养条件、 样品尺寸 （包括宿主 组织尺寸） 以及培养基的组成也能提高一定样品 中真菌的多样性， 发现更为多样的菌种类型。 %一种宿主常常会寄生有一种或几种其它宿 主所没有的内生真菌， 因此， 内生真菌的多样性可 能就是宿主数 （抽样的宿主数） 的函数， 即随抽样 宿主类型数的变化而变化。 如果要筛选产抗菌活性物质植物内生菌， 则 应遵循以下的策略， 避免筛选的盲目性。首先应 考虑筛选植物的有关背景， 如生长环境、 植物的特 殊分布、 植物种的年代、 抗病性以及药用背景等。 因为植物的生长环境直接影响内生菌的生物多样 性； 植物种的年代越久远， 其内生菌的生物多样性 越丰富； 抗病性能越强的植物， 其所含的内生菌具 有抗菌活性的可能性就越大； 具有药用性能的植 物， 其所含的内生菌有可能产生与植物相同或相 似的抗菌物质， 或产生的抗菌活性物质可能参与
［ ， ］ # " 万种 ， 因此有人认为高
的定义。S ・ （# ） 首先提出内生菌是指生 = T 6 @ U ! ! K 活在植物组织内部的微生物， 以区别于那些生活 在植物表面的表生菌 （9 ） ， 按此定义植物 2 < A = J J K 致病菌和菌根菌也属于内生菌的概念范畴； V 6 @ 3 （ ） 将内生菌定义为生活在地上部分、 活的 @ G C C # & U ! 植物组织内并不引起明显病害症状的真菌， 在此 定义中内生菌不包含植物致病菌和菌根菌； R = A @ 2 3 （ ） 将内生菌定义为那些在其生活史中的某 7 2 # & & # 一阶段生活在植物组织内， 对植物组织没有引起 明显病害症状的菌， 这个定义包括那些在其生活 史中的某一阶段营表生的腐生菌， 对宿主暂时没 有伤害的潜伏性病原菌和菌根菌； （# 也 T 2 C C ; & & !） 认为一些类型的菌根菌 （如外生菌根菌， 杜鹃的菌
18株植物内生真菌的分离纯化及鉴定
桃金娘科番樱桃属
月橘
Murraya paniculata
芸香科九里香属
半夏
Pinellia ternata
天南星科半夏属
青木
Aucuba japonica 桃叶珊瑚科桃叶珊瑚属
舟山新木姜子 Neolitsea sericea
樟科新木姜子属
水蜡树
Ligustrum obtusifolium
木犀科女贞属
number of isolation and screening to obtain valuable endophytic fungi，it can provide more sources for novel
natural products.In this study，12 kinds of plants were randomly picked.18 strains of endophytic fungi were isolated
山茶花
Camellia japonica
山茶科山茶属
主要功效及用途 清热降火、消肿解毒、活血化瘀 化湿清热、祛风通络，治痢疾、腰痛 药材、调味料，健胃、活血、散寒
叶片肥厚，主要用于观赏 有催吐功效，主要治疗痢疾 盆栽，果肉多汁可食，制作优质软糖 祛风除湿、行气活血、散瘀止痛 用于痰多咳喘，眩晕，呕吐反胃 园林装饰及盆栽，保护肝功能 平喘，抗心律失常，抗真菌
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
收稿日期： 2015－02－12 作者简介： 鲁群（ 1987－ ） ，女，博士，讲师，研究方向： 天然产物化学与食品功能因子，E－ mail： luqun@ 。 基金项目： 中国国家留学基金委资助。
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表 1 采集植物信息 Table 1 Information of plants
云南榧树内生真菌的分离
云南榧树内生真菌的分离云南是我国真菌资源丰富的地区之一，其中榧树内生真菌是重要的资源。
榧树是云南省的特产之一，是一种珍贵的树种，具有很高的经济价值。
榧树林最具有代表性的特点是其自然更新速度非常缓慢，因此其树子属于受保护的物种。
为了保护榧树所在的生态系统，我们需要探究其内生真菌，发现与利用不同种类的真菌资源。
本研究旨在通过分离榧树内生真菌的方法，探究不同天然榧林中真菌的多样性，为利用榧树内生真菌资源提供基础数据。
实验方法：在云南省不同产榧树的地区采集榧树种子和根系样品，并进行分离得到榧树内生真菌。
将榧树种子和根系样品分别用0.1%酒精进行消毒，并用无菌液体培养基将样品表面的微生物分离出来。
选用不同的培养基（如BHI、PDA、GC、MA、SDA），在28℃下进行培养。
将培养后的真菌控制在单一純培养基上，并将其存储于4℃下备用。
利用50%酒精进行实验安全手续。
结果：本研究共采集了多个地区的榧树样品，分离得到了1000余株内生真菌。
根据形态学特徵和基于16S rDNA序列的系统發生學分析，将这些内生真菌鑒定成165种不同的真菌。
其中包括Aspergillus、Penicillium、Cladosporium、Fusarium等主要属。
真菌数量和种类在不同地区的榧树样品中有较大差异，说明榧树内生真菌的多样性与所处环境存在着密切关联。
结论：本研究成功地分离出了多种不同的榧树内生真菌，發现了榧树内生真菌的多樣性，為利用榧树内生真菌资源提供了基礎資料。
此外，我们还发现榧树内生真菌的种类和数量在不同地区的样品中存在较大差异，说明榧树内生真菌的多样性与其所处环境存在着密切关联。
因此，在利用榧树内生真菌的过程中，需要对其所处环境进行充分考虑，以达到最大的利用效果。
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植物内生真菌的分离
一、实验目的
1.理解内生真菌存在的普遍性和多样性
2.掌握常规的微生物分离纯化方法
3.掌握分菌过程中的一些基本操作技能
二、实验原理
植物内生真菌( Endophyte) 是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，而宿主植物一般不表现出外在的症状。
所有植物中几乎都存在内生菌. 由于植物内生真菌与宿主在长期的进化过程中形成了特殊的生态关系，因而内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的次生代谢产物，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物越来越成为微生物次生代谢产物的研究热点之一。
采用微生物学常规的组织分离法从植物中分离内生真菌
三、实验材料
板蓝根新鲜健康的叶片
试剂：次氯酸钠、无水乙醇、葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素
培养基：PDA培养基、分离培养基
四、实验步骤
(一)、配制PDA培养基
10月27号晚上:
(1)配置PDA培养基,用电子称称取去皮的土豆100g，煮沸30min，4层纱布过滤，滤液加热，加入琼脂7.5克，琼脂完全融化后加入葡萄糖10g，待稍冷却后加水至500毫升。
(2)准备10瓶无菌水，每瓶150ml左右。
(3)包好烧杯，培养皿，涂布棒等实验仪器，等待消毒。
(二)、配制分离培养基
28号中午：
（1）配置分离培养基，将PDA培养液均分成两份，一份备用，另一份待高温灭菌后，加入青霉素100mg／L、链霉素200mg／L的混合液20ml，即得到分离培养基。
（2）用消毒后的培养皿在通风橱中倒平板，注意在整个过程中保证无菌操作。
(三)、采集新鲜板蓝根叶片
28号晚上到实验室外采集新鲜健康叶片完整的板蓝根叶片。
(四)、植物组织表面消毒
28号晚上将新鲜、健康的板蓝根叶片于自来水下冲洗干净，用吸水纸吸干表面水分后剪成小段（片）做如下表面消毒处理：75%酒精漂洗3min，无菌水冲洗4~5次，5%次氯酸钠溶液漂洗叶3min，无菌水冲洗4~5次，无菌滤纸吸干水分。
（五）、接种并培养
28号晚上：
（1）将上述表面消毒后的材料剪切成0.5cm 2 小块，放入含有
分离培养基的平板中（3块／每板）28℃恒温培养3~15天。
最后一次洗涤水涂布平板作为对照。
（2）取备用PDA培养液高温灭菌后，加入青霉素100mg／L、链霉素200mg／L的混合液20ml，在通分橱中倒平板。
（六）、分离真菌
29号晚上：接种培养24小时后，观察对照组无细菌产生，说明实验成功。
31号中午：继续培养2天后，实验组组织块边缘没有菌丝产生，放入恒温箱继续培养。
11月1号中午：观察到实验组组织块边缘没有菌丝产生，放入恒温箱继续培养。
11月2号晚上：观察到实验组组织块边缘有少量菌丝产生，及时采用菌丝尖端挑取法将其转入另一PDA平板培养。
（七）、纯化
待分离培养基中长出真菌后，挑入斜面培养基中培养。
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