黄连内生真菌分离培养条件筛选
1
黄连内生真菌分离培养条件筛选
摘要：本试验采用压贴法通过对黄连根、茎、叶在不同次氯酸钠浓度及不同表面消毒时间的PDA培养基上的培养，选出黄连内生真菌的适宜培养条件；在获得适宜培养条件后重新培养所有部位，待其长菌后挑选菌落边缘菌丝再培养，如此反复，直到获得纯培养物为止。通过培养筛选在主根、须根、叶柄、叶片四个部位共获得了60多种菌株，并对分离出的菌株进行保种，为后续的菌株鉴定、菌株抗菌活性的测定做准备。
关键词：黄连，内生真菌，分离条件，培养条件
Endophytic fungi of Coptis separation and culture conditions
screening
Abstract: The test select the suitable cultivation condition of endophytic fungi ,using pressure
stick method cultivate roots, stems and leaves on PDA medium at different concentrations of
sodium hypochlorite and different surface sterilization time.Recultivate all parts after acquising
suitable cultivation,then select ege colonies and recultivate when they grow fungi,then circulate
the procedure,until get pure culture.By cultivating and selecting the roots,fibrous roots,petiole
and leaves, more than 60 kinds of fungi are found ,and isolated strains are breed,which is
preparation for subsequent strains of identification, the determination of strains antimicrobial
activity.
Keywords: Coptis, Endophytic fungi, Separation conditions, Culture conditions
黄连（Coptis chinensis Franch）是我国名贵中药材之一，含有大量的异喹啉类生物碱[1]（小蘖碱、黄连碱、甲基黄连碱、小蘖红碱、药根碱、阿魏酸等）。尤其是小蘖碱对人体病原细菌和皮肤真菌[2]具有广谱的抗菌活性，在医药中被广泛应用；同样，小蘖碱对许多植物病原真菌和细菌也有显著的抑制作用。Hirano, H.等用硫酸小蘖碱处理大麦种子减轻了大麦条纹花叶病毒病（BBMV）的发生[3]。
黄连的药理研究主要以小蘖碱和黄连解毒汤为重点，主要包括抗微生物作用（抗菌、抗病毒）[4]、镇静作用、止泻作用、健胃作用[5]、对心脏心率[6]和心律作用等[7]。黄连及复方临床应用常用于治疗痢疾、急性肠胃炎、慢性腹泻、呼吸道感染、白喉、百日咳、结核性胞膜炎、萎缩性鼻炎、流行性结膜炎、化脓性中耳炎、口疮、牙周炎、萎缩性胃炎、胃2
炎、胃及十二指肠溃疡、慢性胆囊炎等，近年来还研究发现黄莲具有较强的抗癌和降血糖功效。
黄连药效作用广泛，历来为医家常用药材，而无节制的开放，野生资源已经枯竭，黄连栽培条件苛刻，生长周期长，难以满足医药生产的需要[8]。因此迫切需要寻找开发新的资源。大量的研究发现[9, 10]，内生真菌能够产生与宿主植物相同或相似的次生代谢产物，是新化合物、新药物的潜在资源。开发和利用植物内生真菌在保护植物物种资源、探索新的产物和新的活性以及提高活性成分的生产效率等方面都具有重要的价值。从目前已经研究过的植物来看，未发现没有分离到内生真菌的，因此可以推断出内生真菌在植物内是普遍存在的。
内生真菌-植物共生体[11]能产生多种次生代谢产物，用来抵御自然界的虫害，吸引有益微生物和传粉者，竞争阳光和营养等。内生真菌在植物体与外界环境的交流中发挥着重要的作用，为了增加对病原微生物的抵抗，他们产生新的抗菌素[12]，这些抗菌素具有环保，高效的特征，是新抗菌素的主要来源，也是生物控制的一个重要手段。将有益的内生真菌接种于药用植物无菌苗的体内，能够缩短组织培养周期，对植株的生长发育和生理代谢进行综合调节，促进宿主药用植物活性成分的合成和积累，提高有效成分的含量。此外，还可以将有益的内生真菌进行合理的优化组合，获得相应的“内生真菌集群”[13]。
目前，国内外未见对黄连内生真菌研究的报道，故笔者预研究我国黄连主产区——重庆石柱的黄连的内生真菌分离培养条件及菌株保存，为寻找含有与黄连相似或相同化合物的菌株打下基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
新鲜无可见病斑的石柱黄连（C. chinensis Franch）的主根、须根、叶柄、叶片。
1.2 试验试剂
青霉素；硫酸链霉素；75%乙醇；次氯酸钠溶液（9%、4.5%、2.25%）（浓度以有效氯含量计）；
1.3 培养基的配置 3
PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂；
不同浓度PDA双抗培养基：以马铃薯20%、葡萄糖2%为基础，分别稀释为12.5%、25%、50%、75%、100%后，再加入琼脂2%，灭菌后稍加冷却，然后加入120ug/mL青霉素和100ug/mL硫黄霉素。
1.4 仪器设备
托盘天平、烧杯、量筒、剪刀、培养皿、注射器、酒精灯、镊子
电热蒸馏水器：WS2-226-77 HS･Z11-5型，北京长安科学仪器厂
电子万用炉：220V･AC 1000W 天津泰斯特仪器有限公司
电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9108A型，上海精宏试验设备有限公司
立式自动电热压力蒸汽灭菌器：LDZX-40SAI型，上海申安医疗器械厂
超净工作台：SW-CJ-2F，苏净集团安泰公司制造
电热恒温培养箱：DNP-9082，上海三发科学仪器有限公司
光照培养箱：MGC-250，上海一恒公司
1.4 试验方法
1.4.1 表面灭菌方法筛选
自来水将整株黄连彻底冲洗干净晾干后，分别取下主根、须根、叶柄、叶片，切割成较大的块，再按下面的方法对试验组及对照组进行处理：
CK1：无菌操作的全过程中将5皿打开盖子的PDA的培养皿放于超净工作台。在试验组处理完后以相同方式培养。
CK2：取适量最后一次漂洗液涂布于PDA培养基中，涂布2皿
CK3：取材料压入PDA培养基中，待0.5h后取出材料，重复10次。
主根：在75%乙醇中处理40 s，然后放入9%、4.5%、2.25%三种浓度的次氯酸钠溶液中分别处理2 min、4 min、6 min、8 min、10 min；
叶柄：在75%乙醇中处理30 s，然后放入9%、4.5%、2.25%三种浓度的次氯酸钠溶液中分别处理2 min、4 min、6 min、8 min、10 min； 4
叶片：在75%乙醇中处理20 s，然后放入9%、4.5%、2.25%三种浓度的次氯酸钠溶液中分别处理1 min、3 min、5 min；
须根：在75%乙醇中处理10 s，然后放入9%、4.5%、2.25%三种浓度的次氯酸钠溶液中分别处理0.5 min、1 min、3 min；
将经过以上消毒处理的材料材料接种于PDA培养基中，重复10次。置于25℃中培养，未接种材料的皿培养7天后观察是否有菌长出。接种材料的皿观察菌长出的时间，生长速度、长出菌量。
1.4.2 分离培养条件筛选
将黄连的主根、须根、叶柄、叶片以前面筛选出的表面消毒时间处理后，接种于不同浓度PDA培养基中，分别于15℃、25℃的培养条件下倒置培养。各材料接种20皿，每变量放置2皿。观察生长出真菌的时间、生长出的数量、生长速度。
1.4.3 内生真菌的分离纯化
培养7天后取各个菌落边缘的菌块接种于PDA培养基上，培养4天后再次取菌落边缘菌丝接种，如此反复多次，直到获得纯培养物为止。
1.4.4 保种
用水浴保种的方法对纯化所得的菌株进行保种。用灭菌的大头针挑取纯化的菌落的一部分，放入1.5mL的无菌EP管中，加入无菌水至淹没菌种，密封保存。
2 结果与分析
2.1 表面消毒条件筛选
2.1.1 主根表面消毒的筛选
表1 主根在次氯酸钠各浓度不同时间表面消毒后长菌率
Table 1 The percentage of growing fungi on root at different times of the surface concentration in
sodium hypochlorite disinfecting
次氯酸钠浓度（%） 次氯酸钠时间（min） 第4日长菌率（%） 第7日长菌率（%） 第10日长菌率（%） 对照是否长菌
9 6 17 50 83 -
8 0 0 0
- 5
10 0 0 0 -
4.5 2 0 100 100 -
4 0 20 90 -
6 0 33 83 -
8 40 80 80 -
10 0 17 17 -
2.25 2 20 100 100 +
4 0 60 100 +
6 17 33 67 +
8 33 67 83 +
10 33 100 100
+
注：“-”表示未长菌，“+”表示长菌，下同。
通过表1数据可以发现在次氯酸钠浓度为2.25%时，对照组有菌长出，说明浓度过低；在浓度为9%时，对照组未长菌，但试验组几乎无菌长出，表明浓度过高；在浓度为4.45时，比较发现4min、6min的消毒时间为最佳时间，故选择次氯酸钠浓度为4.5%和消毒时间4min作为最佳筛选条件，既达到消毒水平也最节约时间。
2.1.2 须根表面消毒的筛选
表2 须根在次氯酸钠各浓度不同时间表面消毒后长菌率
Table 2 The percentage of growing fungi on fibrous root at different times of the surface
concentration in sodium hypochlorite disinfecting
次氯酸钠浓度（%） 次氯酸钠时间（min） 第4日长菌率（%） 第7日长菌率（%） 第10日长菌率（%） 对照是否长菌
9 0.5 13 25 50 -
1 13 25 50 -
3 13 25 25 -
4.5 0.5 50 75 100 -
1 38 75 88 -
3 0 0 13 -
2.25 0.5 38 75 88 +
1 38 75 63 -
3 38 88 63
+
对表2数据分析发现：在次氯酸钠浓度为2.25%时，对照组不仅有真菌长出还有细菌长出，说明浓度太低；在浓度为9%时，对照组未长菌，但试验组的长菌率只有50%，偏
土壤内生真菌的分离
土壤内生真菌的分离
摘要
土壤内生真菌是一类生活在土壤中与植物共生的微生物群体，对植物的生长发挥了重要的作用。本文旨在介绍土壤内生真菌的分离方法及其重要性。通过分离土壤内生真菌，可以研究真菌的多样性、功能和生态学意义，为进一步探索土壤与植物相互作用机制提供理论基础。
引言
土壤内生真菌是土壤中一类与植物共生的微生物，其数量和多样性对土壤生态系统的稳定性和植物健康具有重要影响。因此，分离土壤内生真菌是研究土壤微生物多样性及其在土壤生态系统中的生态功能非常关键的步骤。
分离方法
分离土壤内生真菌的方法主要包括以下几个步骤：
1.土壤样品采集：在研究区域选择代表性的土壤样品，使用干净的工具（如无菌铁铲或锹）采集土壤样品。尽量避免污染和混杂。
2.样品处理：将采集到的土壤样品在无菌条件下放置在干燥平板上，用无菌工具将土壤样品分成小块，并均匀摊开。
3.培养基制备：根据需要选择适合真菌生长的培养基，制备培养基。
4.种植真菌：将处理好的土壤样品均匀撒在培养基表面，然后将培养皿放置在恒温培养箱中培养。
5.纯化单菌株：当培养皿上出现单独的真菌菌落时，使用无菌石英棒将菌落取下，横切在无菌平板上，然后再进行培养。
6.鉴定和保存：通过观察菌落形态、产孢特征、显微镜下的菌丝特征等进行初步鉴定，进一步通过分子生物学方法进行确诊，并将纯化的单菌株保存在酒精或冷冻保存。
重要性
土壤内生真菌的分离对于研究土壤生态系统功能具有重要意义：
1.多样性研究：通过分离土壤内生真菌，我们可以了解土壤中真菌的多样性，从而对其功能和生态学作用进行深入研究。
2.生态功能研究：土壤内生真菌与植物之间存在着复杂的相互作用，分离土壤内生真菌可以研究其在植物营养吸收、病害防治和土壤有机质分解等方面的生态功能。
3.人类利用价值：土壤内生真菌中有许多具有重要的生物活性物质，如药物、酶和生物农药等，因此研究和分离土壤内生真菌对于开发利用这些有益资源具有重要意义。
内生真菌的分离与鉴定实验报告
植物内生真菌的分离与鉴定
目录：
一、 背景（目的）
二、 材料与方法
1、 材料
1.1、 大叶女真的叶、茎
1.2、 培养基
2、 方法：
2.1、采样方法
2.2样本前处理方法
2.3、分离方法
2.4、培养方法
2.5、形态鉴定
2.5.1、菌落形态观察
2.5.2、微观形态
2.6、分子生物鉴定
2.6.1、菌丝体的培养方法
2.6.2、基因的提取方法
2.6.3、ITS序列扩增
2.6.3.1、引物、序列
2.6.3.1、PCR反应体系
2.6.3.2、PCR反应条件（循环次数） 2.7、测序
2.7.1、方法
2.8、序列分析方法
2.9、结果与分析
植物内生真菌的分离与鉴定
一、 试验目的（背景）
真菌是吸收异养型的真核生物 种类繁多植物内生真菌是一大类尚未被充分认识的菌
许多真菌学家对此了解也不多。从已有研究结果来看内生真菌具有重要的生态学意义和经济
意义，其物种多样性也是非常丰富的，植物的生长环境直接影响内生真菌的生物多样性，植物物种的年代越久远，其生物内生真菌的多样性越丰富：抗病原性能越强的植物，其所含的内生真菌具有抗菌活性的可能行就越大；其所含的内生真菌有可能产生与植物相同或相似的抗菌无知或产生抗菌活性物质可能参与了药用植物的抗菌过程，本实验通过植物病原真菌和G+、G-细菌的抑制实验发现茎，根，花，种子或果实内生真菌的代谢产物具有不同程度的抑菌能力，并且对G+、G-有普片遍的抑菌作用。研究和开发内生真菌的寻找新的抗菌活性物质具有广泛的应用前景。
分离植物内生真菌操作流程
分离植物内生真菌操作流程
1. 材料准备：植物样本、剪刀、镊子、70%乙醇、3%次氯酸钠（本实验用4%84）、酒精灯、计时器、平板、锥形瓶，无菌水，离心管（带盖，灭菌）、打开无菌操作台灭菌30min。
（1） 植物样本的采集：选取生长状态良好，不要有病斑或者枯枝烂叶，每种植物采取三株标本，要带有叶子、叶柄和枝条及其他部位，将样本名字写在小纸条上放在装标本的袋子里，采下来的标本与写有名字的纸条一同拍照，样本上有脏东西时，请用纸轻轻擦掉，若不清楚植物名字，请将整棵植物拍照留用于鉴定，并做好相关记录。
（2） 制作PDA固体培养基，在无菌操作台中倒平板，每瓶250ml的培养基大概倒15个板，待其凝固后用于接种。
2. 清洗：认真用清水将标本洗净，洗去标本表面的灰尘，去除枯叶，备用。
3. 取样：
（1） 在叶片的左上、右上、左下，右下和正中五个部位进行取样，剪取5mm*5mm的叶片，如果是叶柄或枝干，则剪取5~10mm，若是比较粗的枝干或圆圆的果实之类的，总之比较大的，则将它切开，再剪取样本，样本不要剪的太大或太小。
（2） 每种植物的叶子，叶柄，枝干等其他部位，每种部位接种两块板，大板每个要接种五个样本即左上、右上、左下，右下和正中，小板每个接种四个样本即左上、右上、左下，右下，计算好所要剪的样本数，尽量多剪几个，以免后面的表面灭菌中冲洗时被冲掉。
（3） 若植物标本有剩余，且是没有洗过的，重新装好，放到冰箱里，备用，洗过的扔掉。
（4） 每种植物标本所剪的样本放在一个50ml的离心管中，放在试管架上，并且每个离心管上要标好所对应的植物标本。
4. 表面灭菌：在无菌操作台中进行
（1） 先向各离心管内倒入适量（10~20ml）70%乙醇，拧紧盖子，用计时器开始计时1min,每10秒钟晃动离心管几次，使其充分灭菌。
（2） 1min后，拧松盖子，将乙醇倒入事先准备的锥形瓶中，注意不要将管中样本倒出，倒出的样本不要再放入其中，也不要用手碰到样本，样本不可以接触到除了离心管以外的东西。
分离细菌和培养基的条件
分离细菌和培养基的条件
细菌分离和培养是微生物学研究中的重要步骤，它可以使我们更好地了解细菌的特性和功能。在进行细菌分离和培养时，需要一定的条件来保证实验的准确性和成功率。本文将介绍分离细菌和培养基的条件。
一、细菌分离条件
1. 无菌操作环境：细菌分离需要在无菌条件下进行，以避免外界细菌的污染。实验室中的工作台、培养器具和试剂瓶等都要经过高温高压灭菌处理，操作人员要穿戴好无菌衣物和手套。
2. 样品来源：细菌可以从多种来源中分离得到，如土壤、水体、食品、人体等。在选择样品时，要考虑到需要研究的细菌类型，并确保样品的新鲜度和质量。
3. 适当的培养基：不同的细菌对培养基的要求不同，因此选择适合目标细菌生长的培养基非常重要。培养基的成分应包含细菌所需的碳源、氮源、矿物质和生长因子等。
4. 适宜的温度和pH值：不同的细菌对温度和pH值有着不同的适应性。一般来说，常温下的细菌分离宜在25-30℃进行，而嗜热菌则需要在高温条件下进行。pH值也要根据细菌的需求进行调整，通常在7左右。
5. 适当的氧气浓度：细菌对氧气的需求也不同，有些细菌需要氧气进行呼吸，而有些则为厌氧菌，不能在氧气存在下生长。因此，根据细菌的需求选择适当的氧气浓度非常重要。
二、培养基制备条件
1. 培养基成分：培养基的成分应根据细菌的需求进行选择和调配。常见的培养基成分包括碳源、氮源、矿物质、生长因子和缓冲剂等。这些成分可以提供细菌生长所需的营养物质和环境条件。
2. pH值调节：培养基的pH值对细菌生长有着重要的影响。一般来说，大多数细菌的生长pH范围在6-8之间。因此，在制备培养基时，需要根据细菌的需求调节pH值。
3. 灭菌处理：培养基在制备完成后需要进行灭菌处理，以杀灭其中的细菌和其他微生物。常见的灭菌方法有高温高压灭菌、紫外线照射和过滤等。
4. 培养基的固化：一些细菌需要在固体培养基上进行培养，以便于单个菌落的形成和分离。在制备固体培养基时，常用的方法是在培养基中加入凝固剂如琼脂。
商洛黄芩内生真菌分离鉴定及抗植物病原菌活性筛选
商洛黄芩内生真菌分离鉴定及抗植物病原菌活性筛选
摘要:采用组织分离法从健康黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)植株的根､茎､叶中分离获得36株内生真菌,经鉴定隶属于12属,链格霉属为优势属｡对峙试验结果显示,分离获得的内生菌中有31株对一种或多种植物病原菌有不同程度的抑制作用, 占分离菌的86%;有6株菌对一种或多种病原菌的抑菌率在75%以上,占分离菌的 17%｡对这6株菌培养滤液的抑菌活性也进行了测定,结果表明对峙试验中产生抑菌带的菌株其培养滤液抑菌活性也高｡在6株筛选到的活性菌株中,SBF02和SBF06对棉立枯病菌抑制效果较好;SBF08和SBF27对苹果干腐病菌抑制效果较好; SBF11和SBF27对茄腐皮病镰孢霉抑制效果较好;SBF08和SBF32分别对烟草赤星病菌和草燕麦镰孢霉抑制效果较好｡
关键词:黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi); 内生真菌;分离;抑菌活性
Isolation of Endophytic Fungi from Scutellaria baicalensis Growing in Shangluo
Region and Screening of Their Inhibitory Activities to Plant Pathogens
Abstract: Thirty-six strains of endophytic fungi were isolated from the roots,stems
and leaves of healthy Scutellaria baicalensis Georgi with tissue method. They were
identified as twelve fungal genera among which Alternaria was the dominant genus.
微生物的培养与筛选
微生物的培养与筛选
微生物是一类无形无色的微小生物，它们广泛存在于自然环境中，包括水、土壤、空气、植物、动物等各种生物体内。微生物包括细菌、真菌和病毒等多种类型，它们可以对人类生活产生很大影响，如食品发酵、药物制造、环境污染处理等方面。为了更好地利用微生物的功能，人们需要对微生物进行培养和筛选。
一、微生物培养
微生物培养是将微生物放置于含有足够营养物质和适宜生长条件的培养基上，以促进微生物的生长和繁殖过程。微生物培养需要掌握以下几个方面：
1.培养基的选择
培养基是微生物生长的必要条件，不同的微生物需要适宜的培养基。培养基的成分应该包含不同种类的碳源、氮源、矿物元素和生长因子等，以满足微生物生长所需要的基本要素。常见的培养基包括营养琼脂、LB培养基、MRS培养基等。
2.环境条件的控制
微生物生长需要适宜的温度、pH值、气体含量和湿度等条件。温度是其中最重要的条件之一，不同的微生物对温度的需求也不同。细菌类微生物的适宜温度一般在20-37℃之间，而真菌类微生物的适宜温度则较低，一般在15-30℃之间。
3.微生物的分离和纯化
微生物培养前需要进行分离过程，将目标微生物与其他微生物进行区分。可以通过制备稀释液，利用Pick管、铅笔头、医用棉签等工具进行分离，然后将其分别培养在含有适宜营养物质的固体培养基上，以获得纯种菌株。
二、微生物筛选
微生物筛选是指从大量微生物中选择出具有特定功能或产生目标物质的微生物的过程。微生物筛选需要掌握以下几个方面：
1.选择筛选的微生物种类
根据需要筛选的目标物质或功能，选择适宜的微生物进行筛选。例如，如果需要筛选具有碳酸酸化功能的细菌，可以选择嗜酸杆菌属的细菌进行筛选。
2.筛选微生物的方法
微生物筛选方法包括传统方法和现代方法两种。传统方法主要采用对微生物颜色、形态、臭气等属性进行观察和分类。现代方法则包括基因工程、高通量筛选等多种技术，可通过DNA修饰和蛋白表达等手段进行微生物功能和代谢产物的筛选。
黄连化学成分的分离与鉴定
- 1 - 黄连化学成分的分离与鉴定
黄连是一种中药，在中医学中被广泛应用于治疗各种疾病。黄连的主要功效包括清热解毒、燥湿止泻、消炎止痛等。黄连中含有丰富的化学成分，其中包括黄连素、蒽醌类、生物碱、黄酮类、苯丙酮类、黄酮类、黄酮苷类、挥发油等多种成分。这些化学成分对黄连的药理作用起到了重要的作用。本文将介绍黄连中主要的化学成分的分离与鉴定方法。
一、黄连素的分离与鉴定
黄连素是黄连中的主要成分之一，具有很好的药理作用。黄连素的提取方法可以采用超声波辅助提取法。将黄连粉末与甲醇混合，置于超声波浴中进行提取，得到甲醇提取物。然后将甲醇提取物过滤，去除杂质，再用旋转蒸发仪将溶液浓缩至一定程度。最后，用硅胶柱层析法对甲醇提取物进行分离纯化，得到黄连素。
黄连素的鉴定方法可以采用高效液相色谱法（HPLC）。将黄连素样品与标准品进行比较，通过检测样品中黄连素的峰面积和保留时间，确定黄连素的含量和纯度。此外，还可以采用红外光谱法（FTIR）和质谱法（MS）进行黄连素的鉴定。
二、蒽醌类的分离与鉴定
蒽醌类是黄连中的另一类重要成分，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等作用。蒽醌类的提取方法可以采用超声波辅助提取法或微波辅助提取法。将黄连粉末与乙醇混合，置于超声波浴或微波炉中进行提取，得到乙醇提取物。然后将乙醇提取物过滤，去除杂质，再用旋转蒸发仪 - 2 - 将溶液浓缩至一定程度。最后，用硅胶柱层析法对乙醇提取物进行分离纯化，得到蒽醌类。
蒽醌类的鉴定方法可以采用高效液相色谱法（HPLC）。将蒽醌类样品与标准品进行比较，通过检测样品中蒽醌类的峰面积和保留时间，确定蒽醌类的含量和纯度。此外，还可以采用红外光谱法（FTIR）和质谱法（MS）进行蒽醌类的鉴定。
三、生物碱的分离与鉴定
生物碱是黄连中的一类重要成分，具有镇痛、抗炎、抗菌等作用。生物碱的提取方法可以采用乙酸乙酯-正丁醇-水三相分配法。将黄连粉末与乙酸乙酯混合，加入正丁醇和水，进行三相分配，得到生物碱的乙酸乙酯层。然后将乙酸乙酯层过滤，去除杂质，再用旋转蒸发仪将溶液浓缩至一定程度。最后，用硅胶柱层析法对乙酸乙酯层进行分离纯化，得到生物碱。
真菌的分离培养及形态观察.和无菌操作
真菌的分离培养及形态观察
—、真菌的分离培养方法
（－）平板划线分离法
1．取适合真菌的琼脂培养基融化，冷至45℃，注入无菌平皿中，每皿15～20ml，制成平板待用。
2．取要分离的材料（如田土、混杂的或污染的真菌培养物、真菌）少许，投入盛无菌水的试管内，振摇，使分离菌悬浮于水中。
3．将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸取上述菌悬浮液，进行平板划线(同细菌的划线法)。
4．划线完毕，置温箱中培养2～5d，待长出菌落后，钓取可疑单个菌落先作制片检查，若只有一种所需要的真菌生长，即可进行钓菌纯培养。如有杂菌可从单个菌落中钓少许菌制成悬液，再作划线分离培养，有时需反复多次，才得纯种。另外，也可在放大镜的观察下，用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝，直接放在平板上作分离培养，可获得该种真菌的纯培养。
（二）稀释分离法
1．取盛有无菌水的试管5支（每管9ml），分别标记1、2、3、4、5号。取样品（如田土等）1g，投入1号管内，振摇，使悬浮均匀。
2．用1ml灭菌吸管，按无菌操作法，从1号管中吸取1ml悬浮液注入2号管中，并摇匀；同样由2号管取1ml至3号管，依此类推，直至5号管。注意每稀释一管应更换一支灭菌吸管。
3．用2支无菌吸管分别由4号、5号试管中各取1ml悬液，并分别注入2个灭菌培养皿中，再加入融化后冷至45℃的琼脂培养基约15ml，轻轻在桌面上摇转，静置，使冷凝成平板。然后倒置温箱中培养，2～5d后，从中挑选单个菌落，并移植于斜面上。
二．真菌培养性状观察
（一）真菌在固体培养基上的生长表现
1 .酵母菌菌落：酵母菌在固体培养基上多呈油脂状或蜡脂状，表面光滑、湿润、黏稠，有的表面呈粉粒状、粗糙或皱褶。菌落边缘有整齐、缺损或带丝状。菌落颜色有乳白色、黄色或红色等。
2. 霉菌菌落：将不同霉菌在固体培养基上培养2～5d，可见霉菌菌落呈绒毛状、絮状、蜘蛛网状等。菌落大小依种而异，有的能扩展到整个固体培养基，有的有一定的局限性（直径1～2mm或更小）。很多霉菌的孢子能产生色素，致使菌落表面、背面甚至培养基呈现不同的颜色，如黄色、绿色、青色、黑色、橙色等。
内生真菌HLY3中小檗碱的分离鉴定
内生真菌HLY3中小檗碱的分离鉴定
选用PDA培养基对黄连内生真菌进行分离，运用薄层色谱法和高效液相色谱法检测到菌株HLY3可产小檗碱，菌丝中质量分数为9.313 μg·g-1，形态学观察结合5.8S rDNAITS序列分析鉴定内生真菌HLY3为交链孢属Alternaria sp.，采用薄层制备分离到小檗碱单体，质谱和核磁鉴定的结果表明小檗碱样品图谱与文献报道基本一致，确证分离到的生物碱为小檗碱，为小檗碱的开发利用提供了新的资源。
标签： 黄连； 内生真菌； 小檗碱； 鉴定
黄连属毛茛科黄连属多年生草本植物，主要分布在四川、贵州、湖南、湖北、陕西等地的山谷凉湿荫蔽密林中，由于黄连中主要含有小檗碱，具有泻火燥湿、清热解毒之功效，在临床上应用广泛、需求量大，近几年出现了掠夺性采挖，导致野黄连数量逐年降低，少数种类濒临灭绝[1]。除人工种植黄连补充药源的不足外，探索小檗碱的新来源将是有益的尝试。
研究表明，部分植物内生真菌具有与宿主产生相同活性物质的潜能[24]，因此，马庆等[5]从三角叶黄连中筛选出了具有抑菌活性的内生真菌，厉秀秀等[6]从黄连中分离出了产小檗碱的内生真菌，发现内生真菌发酵液中小檗碱的质量分数为0.664 mg·L-1。本研究在厉秀秀等的试验基础上，分离黄连内生真菌中的小檗碱，并用波谱技术进行鉴定。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 GNP9080型恒温培养箱；美国Waters高效液相色谱仪，Water 2489紫外检测器；MoticBA 210生物显微镜；BioRad PTC150 PCR扩增仪；Bruker AVANCE III 型核磁共振仪；ABSisex API 2000型质谱仪；分析纯溶剂，成都市科龙化工试剂厂；色谱纯溶剂，天津科密欧化学试剂有限公司。
药材黄连于2014年8月采自重庆市开县岩水乡倪家村农田，经西北农林科技大学生命科学学院李玉平副教授鉴定为Coptis chinensis Franch。小檗碱对照品购自上海融禾医药科技发展有限公司（批号120227，纯度>98%），实验所用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）[7]。
植物内生真菌的分离
植物内生真菌的分离
一、实验目的
1.理解内生真菌存在的普遍性和多样性
2.掌握常规的微生物分离纯化方法
3.掌握分菌过程中的一些基本操作技能
二、实验原理
植物内生真菌( Endophyte) 是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，而宿主植物一般不表现出外在的症状。所有植物中几乎都存在内生菌. 由于植物内生真菌与宿主在长期的进化过程中形成了特殊的生态关系，因而内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的次生代谢产物，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物越来越成为微生物次生代谢产物的研究热点之一。
采用微生物学常规的组织分离法从植物中分离内生真菌
三、实验材料
板蓝根新鲜健康的叶片
试剂：次氯酸钠、无水乙醇、葡萄糖、琼脂、青霉素、 链霉素
培养基：PDA培养基、分离培养基
四、实验步骤
(一)、配制PDA培养基 10月27号晚上:
(1)配置PDA培养基,用电子称称取去皮的土豆100g，煮沸30min，4层纱布过滤，滤液加热，加入琼脂7.5克，琼脂完全融化后加入葡萄糖10g，待稍冷却后加水至500毫升。
(2)准备10瓶无菌水，每瓶150ml左右。
(3)包好烧杯，培养皿，涂布棒等实验仪器，等待消毒。
(二)、配制分离培养基
28号中午：
（1）配置分离培养基，将PDA培养液均分成两份，一份备用，另一份待高温灭菌后，加入青霉素100mg／L、链霉素200mg／L的混合液20ml，即得到分离培养基。
（2）用消毒后的培养皿在通风橱中倒平板，注意在整个过程中保证无菌操作。
(三)、采集新鲜板蓝根叶片
28号晚上到实验室外采集新鲜健康叶片完整的板蓝根叶片。
(四)、植物组织表面消毒
28号晚上将新鲜、健康的板蓝根叶片于自来水下冲洗干净，用吸水纸吸干表面水分后剪成小段（片）做如下表面消毒处理：75%酒精漂洗3min，无菌水冲洗4~5次，5%次氯酸钠溶液漂洗叶3min，无菌水冲洗4~5次，无菌滤纸吸干水分。