[生物学]多糖提取纯化以及结构解析
虎奶菇中多糖的提取工艺、结构分析和生物活性研究进展
２. Ｆｕｚｈｏｕ Ｌｉｎｃｈｕａｎ Ｊｉｎｓｈａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ. Ｌｔｄ. ꎬ ３４４０００ꎬ Ｆｕｚｈｏｕꎬ Ｊｉａｎｇｘｉꎬ ＰＲＣ)
虎奶菇中多糖的提取工艺结构分析和生物活性研究进展具有较高的小鼠红细胞溶血抑制率?免疫活性方面?虎奶菇多糖能明显激活体外培养小鼠腹腔巨噬细胞的增殖?使其吞噬活性增强12?具体表现在可使小鼠胸腺和脾的重量增加?使小鼠炭粒廓清速率加快?并能够延长小鼠耐缺氧时间等19?抗肿瘤方面?巫光宏12等报道虎奶菇多糖通过提高巨噬细胞分泌细胞因子的能力?从而抑制肝癌细胞株的增殖?黄飞龙14等报道了虎奶菇多糖在20gml的浓度下即能够促进胃癌细胞早期凋亡?在60gml下即可抑制胃癌细胞的增殖?巫光宏的研究表明2021?虎奶菇多糖具有降血糖能力?其能够增强小鼠肝细胞分解代谢葡萄糖的能力?增强肝细胞的糖原合成能力?从而改善糖尿病小鼠的糖代谢紊乱情况?通过结构修饰能够改善大分子量多糖的水溶性?并一定程度提高或赋予多糖的某种生物活性?邓成华22等从虎奶菇菌核中提取得到碱溶性多糖?对其分别进行羧甲基化和硫酸酯化后?将其变成易溶于水的多糖?并发现两种衍生化多糖都对单纯疱疹病毒2型hsv2具有抗性?但对无囊膜病毒和乙肝病毒抗原却无抑制或破坏作用?推测其活性机理可能是多糖通过破坏病毒囊膜实现的?刘阿娟23等通过沸水提取透析冷冻干燥得到虎奶菇菌核粗多糖?然后分别对其进行了硫酸酯化磷酸化羧甲基化?得到3种改性的虎奶菇多糖?体外抗氧化活性表明?羧甲基化和硫酸化的虎奶菇多糖的总还原力均有提高?对淀粉酶和葡萄糖苷酶的抑制作用有显著增强?其中羧甲基化的虎奶菇多糖对dpph自由基超氧自由基和羟自由基的清除率有显著提高?结论证明了羧甲基化和硫酸化虎奶菇多糖具有重大的开发潜质?2总结和展望众多学者的研究均表明虎奶菇中活性多糖或其改性衍生物具有抗氧化抗肿瘤降血糖抗病毒等重要的生物活性?目前虎奶菇在市场上作为名贵菌种?具有极高的种植和产品开发价值?但对于虎奶菇活性多糖的研究?无论是在结构解析活性机制以及产品开发标准制定上?均处在一般的研究水平上?因此?未来对虎奶菇活性多糖的研究应在分离纯化结构解析药理研究上进行更深入的探索?从而为虎奶菇高附加值产品的开发进行精确定位?参考文献
多糖的分离纯化及性质表征
（3）超高压
超高压提取 也称超高冷等静压提取，是指在常温下用100～1000 MPa的流 体静压力作用于提取溶剂和原料的混合液上，并在预定压力 下保持一段时间，使原料细胞内外压力达到平衡后迅速卸压 ，由于细胞内外渗透压力忽然增大，其结构发生变化使得原 料内的有效成分能够穿过细胞的各种膜而转移到细胞外的提 取液中，达到提取多糖有效成分的目的。
（2） 酸提法
为了提高多糖的提取率，在水提醇沉法的基础上发展了酸提 取法。 如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH值下 难以溶解，可用乙酸或盐酸使提取液成酸性，再加乙醇使多 糖沉淀析出。 由于H＋的存在抑制了酸性杂质的溶出，稀酸提取法提取得到 的多糖产品纯度相对较高，但在酸性条件下可能引起多糖中 糖苷键的断裂，因此，只在一些特定的多糖提取中占有优势 。且酸会对容器造成腐蚀，除弱酸外，一般不宜采用。
5. 整个过程保持凝胶上方有水
原料 前处理 提取 滤渣 过滤或离心
滤液
醇沉 沉淀 脱蛋白 脱色 透析 柱层析
多糖
四、多糖的纯度鉴定
多糖纯度鉴定方法 超速离心法、电泳法、比旋光度法及凝胶色谱法。
比旋光度测定法
不同的多糖具有不同的比旋度，同时在不同的乙醇中 有不同的溶解度。在一定浓度的乙醇中，分子量大的 较分子量小的溶解度小。因此，不同浓度的醇中得到 的多糖沉淀的比旋度相同，则证明该多糖为均一组分。
（2）超声波辅助提取法
超声波提取是利用超声波的机械效应、空化效应及热效应。 机械效应可增大介质的运动速度及穿透力，能有效的破碎生 物细胞和组织，从而使提取的有效成分溶解于溶剂之中； 空化效应使整个生物体破裂，整个破裂过程在瞬间完成，有 利于有效成分的溶出； 热效应增大了有效成分的溶解速度，这种热效应是瞬间的， 可使被提取成分的生物活性尽量保持不变。
《多糖结构解析》课件
质谱技术
通过电离多糖分子并测量其质量 ，可以获得多糖的分子量和组成 信息。
核磁共振技术
通过测量多糖分子中氢原子或其 他原子周围的磁场，可以解析多 糖的精细结构。
生物技术分析法
凝集素结合法
利用凝集素与多糖的特异 性结合，分离纯化多糖， 并进行结构分析。
抗体技术
利用抗体与多糖的特异性 结合，进行多糖的定性和 定量分析。
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亲和色谱法
利用多糖分子与配体之间的特 异性亲和力，将多糖分离纯化
出来。
分离纯化过程中的注意事项
注意温度和pH值
在提取和分离纯化过程中，要控制好温度和pH值 ，以保证多糖的稳定性和活性。
避免长时间高温
长时间高温会导致多糖的结构发生变化，影响其 生物活性和稳定性。
注意防止污染
在分离纯化过程中，要避免污染，如微生物、杂 质等，以保证多糖的纯度和质量。
03
多糖的结构解析方法
化学分析法
01
02
03
酸水解
在酸的作用下，将多糖水 解成单糖，然后进行衍生 化反应，通过气相色谱或 液相色谱进行分析。
碱水解
在碱的作用下，使多糖水 解成寡糖和单糖，同样需 要进行衍生化反应，再进 行色谱分析。
酶解
利用特异性酶将多糖水解 成特定结构的片段，再进 行分析。
物理分析法
食品工业
食品添加剂
01
多糖可作为增稠剂、稳定剂、口感改善剂等用于食品加工中，
提高食品品质和稳定性。
功能性食品
02
利用多糖的生理活性，开发具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖等功
能的食品。
食品包装材料
03
多糖可制成可食用的食品包装材料，具有良好的阻隔性能和环
植物多糖的功能..提取及纯化
植物多糖的功能多糖与蛋白质一样，具有生物大分子的复杂结构，具有一定的生理和生物学活性，概括起来多糖的生物活性包括：免疫调节性、抗肿瘤活性、降血糖活性、降血脂活性、抗病毒活性、抗衰老活性(抗氧化活性)、抗疲劳、抗突变活性，除此之外，还具有其他生物活性，包括抗凝血、抗炎、抗菌、抗惊厥、镇静、止喘及降血压等作用。
植物多糖的提取一、植物多糖的提取1 溶剂提取法1．1 水提法水对植物组织的穿透力强，提取效率高，在生产上使用安全、经济。
用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提。
一般植物多糖提取采用热水浸提法，该法所得多糖提取液可直接或离心除去小溶物；或者利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，沉淀提纯多糖；但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离；还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离；其中，以乙醇沉淀最为普遍。
但以根茎为主的植物体,细胞壁多糖含量高,热水直接提取率不高。
此时为破坏细胞壁,增加多糖的溶出，有两种处理方法:一为酶解,二为弱碱溶解。
1．2酸碱提法有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。
但酸提法只在一些特定的植物多糖提取中占有优势，目前报道的并不多。
而且即使有优势，在操作上还应严格控制酸度，因为酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂。
有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。
采用的稀碱多位为0．1mol／L氢氧化钠、氢氧化钾，为防止多糖降解，常通以氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾。
同样，碱提优势也是因多糖类的不同而异。
与酸提类似，碱提中碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。
另外，稀酸、稀碱提取液应迅速中和或迅速透析，浓缩与醇析而获得多糖沉淀。
1．4 生物酶提取法酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，在多糖的提取过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提取。
甘草多糖提取纯化工艺研究
甘草多糖提取纯化工艺研究甘草多糖是一种天然多糖，具有很多药理学特性，被广泛应用于中药、食品、保健品等领域。
然而，由于甘草多糖在天然状态下含量较低，提取纯化工艺成为了研究重点。
本文将针对甘草多糖提取纯化工艺进行探讨。
一、甘草多糖的结构和特性甘草多糖是一种天然多糖，由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等单糖组成。
其分子量较大，具有多种生物活性，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降血糖等。
甘草多糖的结构特点是分支程度高，分子链长度不一，具有多种单糖组分。
二、甘草多糖的提取方法目前，甘草多糖的提取方法主要有水提法、酸提法、碱提法、超声波提取法、微波提取法等。
其中，水提法是最常用的提取方法，其具体步骤包括：将甘草粉末加入水中，加热至一定温度，过滤得到甘草多糖溶液，再经过浓缩、沉淀、洗涤等步骤，最终得到甘草多糖粉末。
三、甘草多糖的纯化方法甘草多糖在提取过程中容易受到杂质、色素等的干扰，因此需要进行纯化处理。
目前，甘草多糖的纯化方法主要有凝胶过滤法、离子交换法、超滤法、逆流色谱法等。
其中，凝胶过滤法是最常用的纯化方法，其具体步骤包括：将甘草多糖溶液经过过滤膜过滤，将过滤液加入凝胶柱中，通过洗涤、洗脱等步骤，最终得到纯化后的甘草多糖。
四、甘草多糖提取纯化工艺的优化甘草多糖提取纯化工艺的优化是提高甘草多糖产率和纯度的重要途径。
目前，甘草多糖提取纯化工艺的优化主要从以下几个方面入手：（1）提高提取效率。
可通过改变提取温度、提取时间、提取溶剂、提取pH值等因素，来提高甘草多糖的提取效率。
（2）降低成本。
可通过改变提取方法、减少中间步骤、优化设备等措施，来降低甘草多糖的生产成本。
（3）提高纯度。
可通过改变纯化方法、加强对杂质的去除等措施，来提高甘草多糖的纯度。
五、结论甘草多糖是一种具有广泛应用前景的天然多糖，其提取纯化工艺的研究对其应用价值的发挥至关重要。
通过优化提取纯化工艺，可以提高甘草多糖的产量和纯度，降低生产成本，为其在中药、食品、保健品等领域的应用提供了有力支持。
多糖的提取和纯化
多糖的提取和纯化目前，真菌多糖的提取可从子实体和采用深层培养发酵液的菌丝中分离获得，但以从子实体中提取多糖为主。
首先是将子实体粉碎，加入甲醇或乙醇乙醚1:1混合液，水浴加热搅拌1一3小时除去表面脂肪。
其次是用残渣提取多糖，常用的方法有不同温度下的水提法、稀酸提法、冷热稀碱提法。
水提法采用的较多，适合于提取水溶性多糖。
稀酸提取法适用于提取酸溶性多糖、时间宜短，温度不超过50℃，以防止糖昔键断裂。
稀碱法适合于提取碱溶性糖。
然后除去小分子杂质，常采用透析法，将多糖提取液置于半透膜透析袋中，逆向流水透析1一3天。
第四步是沉淀多糖。
大部分多糖在有机溶剂中的溶解度极小，所以可用有机溶剂来沉淀。
常用4一5倍低级醇、丙酮，一般在pH=7.0左右沉淀多糖，制得粗多糖。
最后是除去蛋白质。
除去多糖中的蛋白质常用的方法是三氯醋酸法。
得到的溶液基本上是没有蛋白质与小分子杂质的多糖混合物或单一多糖。
多糖的纯化是将多糖混合物分离为单一的多糖。
纯化方法很多，主要纯化方法有:(l)分步沉淀法根据不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小而大加入这些醇或酮分步沉淀。
此法适用于分离各种溶解度相差较大的多糖。
(2)盐析法根据不同多糖在不同浓度盐中具有不同溶解度而分离。
纯度鉴定和分子量测定多糖纯度标准不能用通常化合物纯度标准来衡量，因为我们所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围内的均一组成。
因此，测得的分子量一般为平均分子量。
过去常用粘度法、蒸气压渗透计法、沉降法、超速离心法、光散射法等测定高分子化合物分子量的方法测定真菌多糖的分子量，但由于这些方法测定起来比较麻烦，且误差较大，现多数已不采用。
目前实验室常用的方法为凝胶过滤法和高压液相色谱法，对于分子量小于1百万的多糖用高压液相法为最好。
1.2.1发酵、提取取香菇465菌株斜面菌种接人摇瓶培养基中振荡培养，逐级扩大培养至10O0L，25℃下通气培养72h，压滤，得香菇深层培养菌丝体。
拐枣多糖的分离纯化和结构解析及其降血糖活性研究
拐枣多糖的分离纯化和结构解析及其降血糖活性研究拐枣是一种在中国南方地区常见的鸭脚木科植物，其叶、根、枝和果实均可入药。
其中，拐枣果实中富含多种物质，包括多糖、皂苷和黄酮等活性成分。
其中，拐枣多糖是一种重要的天然多糖，在降低血糖、增强免疫力等方面具有广泛的应用价值。
因此，为了深入研究拐枣多糖的活性成分和机制，本文就拐枣多糖的分离纯化和结构解析及其降血糖活性进行了研究，并取得了一定的探索性成果。
一、拐枣多糖的提取纯化1、拐枣多糖的提取采用对应重量的鲜拐枣果实，经过加水搅拌煮沸，滤液去渣后，用20倍的乙醇沉淀，得到拐枣多糖。
2、拐枣多糖的纯化采用DEAE色谱柱层析纯化拐枣多糖，以50mmol/L的NaCl梯度洗脱，通过测定糖含量，检查各组分的释放，然后进一步纯化，使用size exclusion chromatography和紫外吸收光谱检测纯化程度。
二、拐枣多糖的结构解析1、拐枣多糖的分子量用羟基苯甲酸钠比色法测定拐枣多糖的分子量，结果显示，拐枣多糖的分子量为2.67×10^4 Da。
2、拐枣多糖的组成采用HPLC法对拐枣多糖的组成进行分析，结果表明拐枣多糖为一种多糖混合物，含有葡萄糖、半乳糖等多个单糖组成。
3、拐枣多糖的结构采用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-ESI-MS）对拐枣多糖结构进行分析，结果显示，拐枣多糖主要为葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖等单糖组成的异构体多糖。
同时，糖链还包含了一些分支链。
三、拐枣多糖的降血糖活性研究1、拐枣多糖的胰岛素敏感性实验采用体外细胞实验，将L6小鼠肌肉细胞培养1至2天，然后分相（顶层浮液做悬浮液，底层沉淀做悬浸液），先用100nmoL的胰岛素处理半小时，再加入不同浓度的拐枣多糖悬浸液，最后比较各处理组的胰岛素结合活性。
结果表明，拐枣多糖可以显著提高L6小鼠肌肉细胞的胰岛素结合活性，表现出明显的胰岛素敏感性。
2、拐枣多糖的血糖调节实验将10只SD大鼠随机分为两组，一个为对照组，一个为处理组，对照组给予1ml生理盐水，处理组给予口服1g/kg的拐枣多糖，连续7天，每天1次。
多糖结构方面
多糖的提取、分离纯化真菌多糖是从真菌细胞壁和组织体的菌丝之中分离出的由十个以上的单糖以糖苷键连接而成的高分子多聚物。
真菌多糖能通过对淋巴细胞、巨噬细胞、网状内皮系统而调节机体的免疫功能，在治疗肿瘤、心血管、肝炎、糖尿病，甚至爱滋病等方面显示出特殊的效果，有些已在临床上广泛应用[1]。
真菌多糖作为药物毒性极小，其在治疗代谢紊乱、感染及癌症等疾病方面的应用正不断增加，它在医疗上是一种很好的佐料。
真菌多糖其研究日益受到人们重视。
1 真菌多糖的提取、分离纯化与纯度检测1.1 真菌多糖的提取和分离提取真菌多糖的原料，应先用丙酮、乙醚或乙醇进行预处理，以除去原料中的脂类物质,然后用热水、稀酸或稀碱反复提取，提取液中和至中性后，用甲醇或乙醇沉淀，沉淀物经离心、干燥后，制得粗多糖。
1.1.1 粗多糖中蛋白的去除常用的脱蛋白的方法主要有3种：Sevag法是用氯仿、正丁醇或正戊醇按5:1混合后,加到样品水溶液中振摇，离心除去凝胶状蛋白质，反复多次直至蛋白质除尽为止。
三氟三氯乙烷法[2]是多糖溶液和三氟三氯乙烷1:1混合,在低温下搅拌10min左右,离心得上层溶液, 上层溶液继续用上述方法处理几次,即得无蛋白的多糖溶液。
三氯乙酸法是在多糖水溶液中滴加3%的三氯乙酸，直至溶液不再浑浊为止，于5～10℃放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白的的多糖溶液，但是此法会引起多糖的降解，不宜采用。
另外还有硫酸铵法和蛋白酶法。
1.1.2脱色多糖中所含的色素一般有两种，即游离色素和结合色素。
游离色素大多呈阴离子状态，可以通过离子交换法除去，常用DEAE纤维素或DEAE-Sepharose TM Fast Flow来吸附色素。
若多糖与色素结合，则色素易被离子交换柱吸附，不易被水洗脱，这类色素可采用氧化脱色：以浓氨水（或NaOH溶液）调至ph8.0左右，于50℃以下滴加H2O2至浅黄色，保温2h；根据真菌多糖与色素的结合情况选择合适的脱色方法[3]。