实训五 酵母菌的形态观察及死活细胞鉴定
酵母菌形态PPT课件
美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是
无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色，由于细胞中新陈
代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝
色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色，而
对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或
还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝
土曲霉菌落
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青霉
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观察霉菌的形态有多种方法：直接制片观 察法，载玻片培养观察法和玻璃纸培养观 察法。
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三、器材
菌种：曲霉（Aspergillussp.），青霉 （Penicillium sp.），根霉（Rhizopus sp.）， 毛霉（Mucor sp．） 试剂与仪器：乳酸石炭酸棉蓝染色液，20 ％甘油，查氏培养基平板，马铃薯培养基； 显微镜，载玻片，盖玻片，解剖针，尖头 镊子等。
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五、实验报告
1、结果
绘图说明你 所观察到的酵母菌的形态特征。
2、思考题
吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母 菌死细胞数量有何影响？试分析其原因？
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实验 放线菌的形态观察
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实验目的：
❖学习丝状微生物制片和染色技术； ❖观察和掌握典型放线菌的形态结构特征
水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。但
美蓝的浓度、作用时间等均有影响，应加注意。
酵母菌形态观察
酵母菌形态观察微生物实验报告酵母菌的形态观察一、目的建议：1、掌握普通光学显微镜的使用方法和注意事项2、观测酵母菌的形态特征、出芽生殖方式，并掌控酵母菌与细菌形态特征的区别3、学习鉴别死活酵母细胞的实验方法二、器材和器皿：2、生理盐水、美蓝染色液、3、显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、注射针、擦拭镜纸酵母菌是单细胞的真核微生物，菌体比细菌大而且不运动。
酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种，以无性繁殖为主。
芽殖是酵母菌普遍的无性繁殖方式，少数为裂殖；有性繁殖是产生子囊和子囊孢子。
本实验是通过美蓝染液水浸片来观察酵母的形态和芽殖方式。
美绿就是一种无毒性的染料，它的水解型呈圆形蓝色，还原型无色。
用美绿对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢促进作用，细胞内具备较强的还原成能力，能够并使美绿由蓝色的水解型变成无色的还原型，而对代谢作用些微或死去细胞，无此还原成能力或还原成能力极弱，而被美绿涂成蓝色或淡蓝色。
因此，不仅用此法可以观测酵母细胞形态，也需用去辨别酵母菌的死细胞和活细胞。
四、操作步骤：（一）显微镜的主要结构：普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分。
（二）显微镜的采用方法1．低倍镜的使用方法（1）取镜和置放：显微镜平时存放在柜或箱中，用时从柜中取出，右手紧握镜臂，左一手托住镜座,将显微镜放在自己左肩前方的实验台上，镜座后端距桌边1－2寸为宜，便于坐着操作。
（2）调节光源（3）低倍镜观察先将标本玻片放在载物台上，并将标本部位处在物镜的正下方，以左手按逆时针方向旋转细调节器，并使镜台缓慢地上跌至物镜距标本片约5毫米处，应注在下降镜台时，切勿在目镜上观测。
一定必须从右侧看著镜台下降，以免下降过多，导致镜头或标本片的损毁。
然后，两眼同时睁开，左眼看目镜，同时反时针方向慢慢旋转粗调节轮，当在视野内出现物象后，改用细调节轮，上下微微转动，直至视野内获得清晰的物象。
然后认真观察标本各部位，确定并将需进一步要观察的部位移视野中央，准备用高倍镜观察。
酵母菌——精选推荐
微生物学实验报告题目：酵母菌形态观察、死活细胞的鉴别及子囊孢子的观察姓名：学号：年级班级：组别：同组者：时间：【实验器材】1.菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
2.溶液与试剂：0.1%吕氏碱性美蓝染液，5%孔雀绿，番红染液，95%乙醇。
3.培养基：麦氏（Meclary）琼脂斜面培养基。
4.仪器或其他用品：显微镜，载玻片，盖玻片，酒精灯，接种环等。
【目的要求】1.了解酵母菌形态及出芽方式。
2.学习区分酵母死活细胞。
3.掌握酵母子囊孢子观察方法。
【基本原理】单细胞的酵母菌个体是常见细菌的几倍至十几倍，大多数采取出芽方式进行无性繁殖，也可以通过接合产生子囊孢子进行有性繁殖。
由于细胞个体大，采取涂片的方法制片有可能损伤细胞，一般通过美蓝染液水浸片法或水-碘液浸片法来观察酵母菌形态及出芽生殖方式。
同时，采用美蓝染液水浸片法还可以对酵母菌的死、活细胞进行鉴别。
美蓝对细胞无毒，其氧化型呈蓝色，还原型无色。
由于新陈代谢，活细胞内有较强还原能力，使美蓝由蓝色氧化型转变成无色的还原型，染色后活细胞呈无色。
死细胞或代谢能力微弱的衰老细胞内还原能力弱，染色后细胞呈蓝色或淡蓝色。
子囊孢子是子囊菌类真菌有性生殖产生的有性孢子。
在酵母菌种，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要指标之一。
酵母菌形成子囊孢子需要一定的条件，所以对不同种属的酵母要选择适合形成子囊孢子的培养基。
麦氏（Meclary）培养基（葡萄糖-醋酸钠培养基）有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。
【操作步骤】1.美蓝染色。
（1）滴加一滴吕氏碱性美蓝染液于载玻片中央，无菌操作用接种环由酿酒酵母麦芽汁斜面培养物挑取少许菌体置于染液中，混合均匀。
（2）用镊子取一块盖玻片，将盖玻片一边与菌液接触，缓慢将盖玻片倾斜并覆盖在菌液上。
（3）将制片放置3min后，用低倍镜及高倍镜观察酵母菌形态和出芽情况，并根据细胞颜色区分死活细胞。
（4）染色30min后再次观察，注意死活细胞比例是否发生变化。
实验四放线菌的形态观察和酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别
实验四放线菌的形态观察和酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别一、实验目的：1.了解放线菌和酵母菌的形态特征。
2.学习区分细胞的死活状态。
二、实验原理：1.放线菌的形态特征：放线菌属于细菌的一种，具有很大的细胞大小差异，通常为革兰氏阳性菌。
放线菌的形态特征包括菌落形态、细胞形态、颜色、菌丝特征等。
放线菌的菌落形态多呈现出有规则的褶皱或丝状结构。
2.酵母菌的形态特征：酵母菌属于真菌的一种，单细胞有丝分裂生殖的真菌。
酵母菌的形态特征包括细胞形态、菌落形态、颜色等。
酵母菌的细胞呈球形或卵圆形，常以单细胞或成链形式存在。
3.死活细胞鉴别：通过酵母菌培养基中的亚甲基蓝染色来判断细胞的存活状态，活细胞吸收染料颜色比较浅，死细胞吸收染料颜色比较深。
三、实验材料与方法：1.材料：-放线菌菌种：已提前分离培养好的放线菌-放线菌培养基：含有葡萄糖、酵母提取物、氨基酸、无机盐等-培养皿、显微镜、镰刀、牛津杯、显微镜载玻片-无菌移液器、无菌吸管、火焰灭菌器-酵母菌培养基：含有葡萄糖、酵母提取物、氨基酸、无机盐等-亚甲基蓝染液：浓度为1%2.方法：a.取一小块放线菌菌落，用镰刀切下悬浮于牛津杯中的放线菌菌落。
b.用无菌吸管将放线菌菌液吸入无菌移液器中，将移液器染上菌液的一侧略吹气，使菌液沾附在显微镜载玻片上。
c.让菌液干燥后，用显微镜在高倍镜下观察放线菌的细胞形态和菌落特征。
d.取一小块酵母菌菌落，用镰刀切下悬浮于牛津杯中的酵母菌菌落。
e.用无菌吸管将酵母菌菌液吸入无菌移液器中，将移液器染上菌液的一侧略吹气，使菌液沾附在显微镜载玻片上。
f.将带有酵母菌菌液的显微镜载玻片倾斜，滴入一滴亚甲基蓝染液，静置5分钟。
g.用显微镜在高倍镜下观察染色后的酵母菌细胞，根据染色程度判断细胞的存活状态。
四、实验结果与分析：通过观察放线菌的细胞形态和菌落特征，可以发现放线菌的形态特征是不规则的菌落结构，内部有菌丝状结构。
放线菌的细胞形态多样，有圆形或椭圆形细胞。
酵母菌的形态观察
酵母菌的形态观察酵母菌的形态观察,死活细胞鉴别,微⽣物测量技术,显微镜直接计数法⼀实验⽬的1．观察酵母菌的形态及出芽⽣殖⽅式，学习区分酵母菌死活细胞的实验⽅法；掌握酵母菌的⼀般形态特征及其与细菌的区别。
2．了解⽬镜测微尺和镜台测微尺的构造及使⽤原理，掌握测定微⽣物细胞⼤⼩的⽅法.3. 了解⾎球计数板的构造和使⽤⽅法,学会⽤⾎球计数板对酵母细胞进⾏计数。
⼆实验原理美蓝是⼀种⽆毒性的染料，它的氧化型呈蓝⾊，还原型⽆⾊。
⽤美蓝对酵母的活细胞进⾏染⾊时，由于细胞的新陈代谢作⽤，细胞内具有较强的还原能⼒，能使美蓝由蓝⾊的氧化型变为⽆⾊的还原型。
因此，具有还原能⼒的酵母细胞是⽆⾊的，⽽死细胞或代谢作⽤微弱的衰⽼细胞则呈蓝⾊或淡蓝⾊。
微⽣物细胞的⼤⼩是微⽣物重要的形态特征之⼀，由于菌体微⼩，只能在显微镜下测量。
⽤于测量微主物细胞⼤⼩的⼯具有⽬镜测微尺和镜台测微尺。
⽬镜测微尺是⼀块圆形玻⽚，在玻⽚中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。
测量时，将其放在接⽬镜中的隔板上(此处正好与物镜放⼤的中间物像重叠)⽤于测量经显微镜放⼤后的细胞物象。
由于不同⽬镜、物镜组合的放⼤倍数不相同，⽬镜测微尺每格实际表⽰的长度也不⼀样，因此⽬镜测微尺测量微⽣物⼤⼩时须先⽤置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在⼀定放⼤倍数下，⽬镜测微尺每⼩格所代表的相对长度。
镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的专⽤载玻⽚，⼀般将lmm等分为100格，每格长10µm，每格长（0.01mm），是专门⽤来校正⽬镜测微尺的。
校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同⼀位置，都要经过物镜和⽬镜的两次放⼤成像进⼊视野，即镜台测微尺随着显微镜总放⼤倍数的放⼤⽽放⼤，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实⼤⼩，所以⽤镜台测微尺的已知长度在⼀定放⼤倍数下校正⽬镜测微尺，即可求出⽬镜测微尺每格所代表的实际长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本⽚，⽤校正好的⽬镜测微尺在同样放⼤倍数下测量微⽣物细胞⼤⼩。
酵母菌死活细胞的鉴定
细
菌菌液放入染液里，混合均匀；
胞
鉴
（2）用镊子取一块盖玻片，先将
定
一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻
片放下。
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• 酵母菌死活细胞鉴定的基本程序
酵
母
2.镜检
菌 死 活
（1）将制片放置约3min，先低倍镜后高倍镜观察酵母形态 根据颜色区别死活细胞；
细
（2）染色30min后再次观察，注意死活细胞数量的变化。
细
细胞较少；染色时间长，活细胞数量也会减少。
胞 鉴 定
（2）浓度低老龄细胞与活细胞不易区分，代谢微弱的细胞也能还原 美蓝，不被染色，从而使观察到的死细胞较少，活细胞较多；染色时 间短，活细胞还没从蓝变无色，观察到的活细胞数量会比预计的少。
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• 酵母菌死活细胞鉴定关键控制点
酵
母
菌
2.酵母菌死活细胞鉴定注意事项
死
（1）加染液不宜过多或过少，否则在盖上盖玻片时，菌液会
活 细 胞
溢出或出现大量气泡而影响观察； （2）盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。
鉴
定
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食品微生物检验技术
胞
鉴
定
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酵母菌死活细胞鉴定的关键控制点
1.酵母菌死活细胞鉴定的成败关键 2.酵母菌死活细胞鉴定的注意事项
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• 酵母菌死活细胞鉴定关键控制点
酵
母 菌 死
1.酵母菌死活细胞鉴定成败关键 （1）美蓝浓度高和染色时间过长都会增加酵母菌的死亡。美兰有氧
活
化性，浓度太高会使活菌很快致死，从而使视察到的死细胞较多，活
食品微生物检验技术
目录页
酵母菌死活细胞鉴定的原理、意义 酵母菌死活细胞鉴定的基本程序 酵母菌死活细胞鉴定关键控制点
酵母菌的形态观察及死活鉴别与显微直接计数法
酵母菌的形态观察及死活鉴别与显微镜直接计数法I 酵母菌的形态观察及死活鉴别一、目的要求观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。
二、基本原理酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，菌体比细菌大。
繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。
本实验通过用美蓝染色制成水浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。
美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的。
用它采对酵母细胞进行染色。
活细胞内由于新陈代谢作用而具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母活细胞染色后无色。
而死细胞或代谢缓慢的老细胞因无还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。
因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。
三、器材酿酒酵母（Saccharomyces cerevissiae）；0.1％吕氏碱性美蓝染液，革兰氏染色用的碘液；显微镜，载玻片，盖玻片等。
四、操作步骤（美蓝浸片观察）(1)在载玻片中央加一滴0.1％吕氏碱性美蓝染液，液滴不可过多或过少，以免盖上盖玻片时，溢出或留有气泡。
然后按无菌操作法取在豆芽汁琼脂斜面上培养48小时的酿酒酵母少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。
(2)用镊子夹盖玻片一块，小心地盖在液滴上。
盖片时应注意，不能将盖玻片平放下去，应先将盖玻片的一边与液滴接触；然后将整个盖玻片慢慢放下，这样可以避免产生气泡。
(3)将制好的水浸片放置3分钟后镜检。
先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察酿酒酵母的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。
五、实验报告(1) 绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。
II 显微镜直接计数法一、目的要求1．明确显微镜计数的原理。
2．学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。
二、基本原理利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。
实验六 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别
（请预习下一个实验： 实验七 霉菌的形态观察）
还原剂 美蓝（氧化型） 蓝色 氧化剂 美蓝（还原型） 无色
二、基本原理——美蓝染色液
酵母活细胞 新陈代谢 还原能力
美蓝（氧化型） 蓝色
美蓝（还原型） 无色
二、基本原理——子囊孢子观察
子囊孢子是子囊菌类真菌有性生殖产生的有性 孢子。在酵母菌中，能否形成子囊孢子及其形 态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。酵母菌 形成子囊孢子需要一定的条件，所以对不同种 属的酵母要选择适合形成子囊孢子的培养基。 麦氏 (McClary) 培养基 ( 葡萄糖－醋酸钠培 养基 ) 有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。
四、操作步骤——美兰染色
在载玻片中央加一滴0.05%吕氏碱性美蓝染色液，用接种环 挑取少量酵母菌苔，混合均匀；（注：染液不宜过多或过少）
用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖 玻片放下使其盖在菌液上；（注：盖玻片不宜平着放下）
将制片放置约3min，先低倍镜后高倍镜观察酵母形态和出芽 情况，并根据颜色区别死活细胞。
四、操作步骤——子囊孢子观察
1.菌种活化：将酿酒酵母移种至新鲜的麦芽汁琼脂斜面上， 25-28℃培养24h左右，然后再转种2-3次。（注：麦芽 汁斜面培养基需用新配制、表面湿润的。） 2. 产孢培养：将经活化的菌种转接到麦氏琼脂斜面上， 25-28℃培养约一周。 3. 制片：取经产孢培养的酵母斜面培养物，在洁净载玻片 上按常规涂片、干燥、固定。 4. 染色：滴加孔雀绿染液染色3min。 5. 脱色：用95%的乙醇脱色30s，水洗。 6. 复染：用番红复染30s，水洗，用吸水纸吸干。 7. 镜检：干后用油镜观察。子囊孢子呈绿色、菌体和子囊 呈粉红色。
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实训五酵母菌的形态观察及死活细胞鉴定
一、实验目的
1、观察酵母细胞的形态结构及出芽繁殖；
2、掌握鉴别死活酵母细胞的染色技术；
3、学会水浸制片观察酵母菌。
二、实验原理
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，细胞一般呈球状、卵圆状、椭圆状、柱状或分枝状的假菌丝。
其细胞核与细胞质有明显分化，菌体较细菌大几倍甚至十几倍，在高倍显微镜下即可观察到胞内有明显的细胞核和内含物。
酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种。
无性繁殖大多是以出芽的方式进行，也有分裂繁殖；有性繁殖则是通过接合产生子囊孢子。
酵母菌的母细胞经过一系列的芽殖后，如长大的子细胞不与母细胞分离，就会形成藕节状的假菌丝，成为假丝酵母。
用生理盐水（或水-碘液染色液）制作水浸片可以观察酵母菌的形态和出芽繁殖方式。
用美蓝染色液制水浸片可鉴别酵母细胞的死活状态。
美蓝是一种弱氧化剂，氧化时呈蓝色，还原后呈无色。
用美蓝对酵母菌进行染色时，活酵母细胞因新陈代谢不断进行，胞内具有很强的还原能力，能将进入细胞的美蓝还原，使得细胞呈无色。
因此，具有还原能力的酵母活细胞为无色，而老化细胞还原能力弱，染色后呈淡蓝色，死细胞则失去还原能力，被染料染成蓝色。
三、实验材料
1、菌种：啤酒酵母或葡萄汁酵母（制成斜面培养物或液体培养物）
2、试剂：0.1%吕氏美蓝染色液、0.05%吕氏美蓝染色液、水-碘液染
色液（革兰氏染液用碘液：水=1：3）、0.85%生理盐水
3、仪器及其他：显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、
滴管、酒精灯、蒸馏水、吸水纸等
四、实验时间
2课时
五、实验步骤
（一）生理盐水浸（封）片（酵母菌的形态观察）
1、在载玻片中央加1滴无菌生理盐水（不宜用无菌水制作水浸片，
否则细胞易破裂），然后以无菌操作从斜面培养基上用接种环取少量啤酒酵母菌苔与生理盐水混匀，使其分散成云雾状薄层。
2、用镊子取洁净盖玻片，先将其一边与菌液接触，然后缓慢地将盖
玻片放下，避免产生气泡影响观察。
3、在显微镜下，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察酵母菌的形态、
大小及出芽情况。
（二）水-碘液浸片（酵母菌的形态观察）
1、在洁净载玻片中央滴1滴水-碘液，用接种环在火焰区以无菌操作
方式从斜面培养基上取出少量菌种（或加1滴酵母菌悬液），与载玻片上的水-碘液相混合。
2、以同样方法盖上盖玻片后镜检。
（三）美蓝染色液制水浸片（酵母菌的死活细胞鉴别）
1、在洁净载玻片上加一滴0.1%吕氏美蓝染色液，用接种环以无菌操
作挑取少量酵母菌苔放在美蓝染色液中，混合均匀，染色2-3min。
2、取一块洁净的盖玻片，先将一边与染液接触，然后慢慢将盖玻片
放下，避免产生气泡，并将多余染液用吸水纸吸干。
3、先用低倍镜观察，然后用高倍镜观察酵母的形态、出芽情况和着
色情况。
着色清晰的是死细胞，无色的是活细胞，淡蓝色的是老龄细胞。
4、染色约0.5h后再进行观察，注意观察死细胞数量是否增加。
5、用0.05%吕氏美蓝染色液重复上述操作，比较两个浓度的美蓝染
液的染色结果。
注意事项
1、如用酵母菌的液体培养物，先稍微振荡使酵母菌上浮，再用接种
环以无菌操作方法取培养液。
2、美蓝浓度不宜过高，染色时间不宜过长，否则对细胞活性有影响。
3、美蓝染液不宜过多或过少，否则在加盖玻片时菌液溢出或有气泡。
4、酵母菌细胞较大，采取涂片方法制片有可能损伤细胞，因此可用
水-碘液浸片法来观察酵母菌形态及出芽生殖方式。
5、由于活酵母菌还原能力的有限性，必须严格控制染料的浓度和染
色时间。
染色时间过长，死酵母菌细胞数量会增加。
六、实验报告
（一）观察内容与记录
1、把观察到的酵母菌形态特征绘图。
2、酵母菌染色结果填于表5-1中，在同一视野范围内观察酵母菌活
细胞和死细胞的数量变化。
表5-1 酵母菌细胞染色结果
3、计算酵母菌细胞的死亡率
死亡率 =（死细胞总数/死活细胞总数）×100%
（二）思考题
1、在显微镜观察下，酵母菌有哪些特征区别于一般细菌？
2、吕氏美蓝染色液浓度、作用时间与酵母菌活、死细胞比例变化有
何关系？试划出关系图并分析原因。
七、实验总结。