医疗器械无菌检验方法验证方案
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医疗器械产品无菌检验操作规程1 目的通过无菌检验，确保灭菌后产品能够达到无菌的要求。
2 适用范围适用于灭菌后医疗器械产品（列举）的无菌检验。
3 检验依据本厂产品注册标准（编号）EN1174—1996 医疗器械灭菌产品中微生物数量的评估《中国药典》（2005年版）GB14233。
2—2005 医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分：生物试验方法GB15980-1995 一次性使用医疗用品卫生标准4 仪器、设备百级层流超净工作台、电热干燥箱、电热恒温培养箱、霉菌培养箱、压力蒸汽灭菌器、集菌仪（器）、电子天平、PH计、冰箱、恒温水浴锅、酒精灯、三角烧瓶，接种环、无菌棉签、镊子,试管架,大试管若干等。
5 无菌检验室的环境要求5.1 无菌检验应在环境洁净度10000级下的局部百级的单向流空气区域内进行.5。
2 缓冲区与外界环境、无菌检验室与缓冲区之间空气应保持正压，阳性对照室与缓冲区之间空气应保持负压。
无菌检验室与室外大气之间静压差应大于10Pa。
无菌检验室的室温应保持18～26℃，相对湿度：45～65％。
5。
3 无菌检验室的单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的监测.每年至少检测一次。
5.4 无菌检验过程中应同时检查超净工作台单向流空气中的菌落数：每次操作时在层流空气所及台面的左中右置3个营养琼脂平板，暴露30min，于30～35℃培养48小时，菌落数平均应不超过1CFU/平板.6 无菌检验前的准备6。
1 器具灭菌、消毒6.1。
1 灭菌:试验过程中与供试品接触的所有器具必须采用可靠方法灭菌。
可经电热干燥箱160℃以上干烤2小时,或置压力蒸汽灭菌器内121℃蒸汽灭菌30分钟后使用（根据灭菌效果验证决定灭菌参数）。
所有的灭菌物品不应超过2周即用毕，否则应重新灭菌.6.1。
2 消毒：凡检验中使用的器材无法灭菌处理的,使用前必须经消毒处理.如无菌检验室的试管架、电子天平、工作台面、工作人员的手、橡胶吸头等。
无菌医疗器械清洗工艺验证报告
无菌医疗器械清洗工艺验证报告一、目的为保证产品配件（以下简称：配件）清洗工艺的产品质量及工艺稳定性，按照质量管理体系的要求，对配件的清洗工艺进行验证。
二、确认项目清洗工艺的方案、配件清洗的效果。
三、方法采取不同的清洗方案进行清洗，通过对清洗后的微粒污染指数、清洗介质的残留量、初始污染菌、PH值、电导率进行测定与未清洗配件本身的污染程度、清洗难易程度对比，以此验证原配件清洗工艺方案的可行性。
四.参加人员五、清洗工艺验证报告一、验证项目配件清洗的方法和清洗时间。
二、验证时间三、验证条件1、生产设备超声波清洗机、盛水容具（水盆）。
2、生产地点二楼净化车间初洗间、精洗间。
3、产品配件：因公司配件种类繁多，根据配件的清洗特点分以下几类,并根据每类配件选出最复杂清洗的代表配件）（详见附件“待清洗产品配件分类表”）A类：与血液、药液直接接触的塑料配件；（选做试验代表配件：输注泵套管）B类：与血液、药液非直接接触的塑料配件；（选做试验代表配件：高压泵螺纹接头）C类：与血液、药液直接接触的金属配件；（选做试验代表配件：穿刺针管）D类：与血液、药液非直接接触的金属配件；（选做试验代表配件：铜帽）4、检验设备：微粒检测仪、。
四、验证方案分别对每类选出的代表配件分别列出以下四种方案，先行设定清洗方法和清洗时间等进行操作。
1．方案12．方案23．方案34．方案4五、操作步骤1、按正常生产流程选取做试验配件生产500件。
2、取400件配件，用上述4种方案分别清洗配件100件，烘干后送检。
3、取100件未洗的同批配件，按正常步骤检验，以最后的检验结果做清洗效果参照。
六、检验方法1、将不同方案的100件配件分别分为3个检验组，每组33件（其中3组34件）。
2、取样方法：根据末道清洗用水分别取适量的纯化水或注射用水，按试验项目特点逐组、逐支或随机抽取5件缓缓冲洗内壁或内侧。
3、按相应试验方法对供试液进行检验，每批供试液做5次，求平均数为检验结果。
包装验证试验方法
消毒技术规范 Technical Standard For disinfection (2002年版) 中华人民共和国卫生部 二○○二 灭菌医疗用品包装材料鉴定试验 2.1.7.1 理化性能鉴定 2.1.7.1.1一般检查 （1）在日光或良好的人工光源下检查，包 装应无削弱其功能的洞孔、裂缝、撕裂、 皱痕或会影响其功能的局部加厚或变薄。 • （2）包装内医疗用品应无未经保护的，可 能会破坏包装的尖锐边缘或突出物。
老化天数
29天 58天 87天
无菌医疗器械包装验证试验方法
无菌医疗器械包装验证试验方法
•
• • • •
• 按下式计算加速老化因子(AAF)的估计值： AAF= Q10［（TAA-TRT）/10］ 式中：TAA=加速老化温度(℃)； TRT=环境温度(℃)。 需建立的等同于实际老化时间的加速老化时间(AAT)用预期的(或要 求的)实际时间除以AAF来建立。按下式计算： 加速老化时间(AAT)＝预期的(RT)／AAF
F
G
C
D E
H
I
J
无菌医疗器械包装验证试验方法
• ASTM F 1140
• 胀破/蠕变试验 • 最终包装压力试验是通过向整个包装内加 压至破裂点（胀破）或加压至一巳知的临 界值并保持一段时间（蠕变）来评价包装 的总体最小密封强度。
无菌医疗器械包装验证试验方法
• ASTM F 1140 • 试验方法
包装材料的多样性决定了检测方法的多样性。
无菌医疗器械包装验证试验方法
• 检测标准 目力检验 ASTM F1886-1998 包装完整性检验 ASTM F1929-1998 密封强度试验 ASTM F 88-2007 透气性试验 ISO5636-3-1992 加速老化试验ASTM F 1980-07 微生物屏障试验ASTM F 1608-04 ASTM F 2368-07 DIN 58953 Part 6-2010 气泡试验ASTM F 2096-04 胀破/蠕变试验ASTM F 1140-07
医疗器械产品辐照灭菌剂量验证方案与报告
XXXXX公司建立医用产品灭菌剂量验证报告送检单位：公司日期：年月日目录序言 (1)试验前准备工作 (2)方法 (3)实施内容 (4)结果 (5)结论 (6)附注 (6)参考资料 (6)初始污染菌检测规范 (6)确定灭菌剂量 (8)无菌检查 (9)序言本实验是对医用产品公司的一次性医疗用品进行了辐射灭菌剂量设定和验证。
实验原理是基于ISO11137-2：2006的方法，即先对辐照前产品的初始污染菌进行测定，然后选择验证剂量。
再用验证剂量对产品进行辐照，并测定辐照后存活微生物的样品件数，以此来确定所确定的验证剂量能够满足10-6的灭菌保证水平。
本实验从年月日开始至年月日结束。
试验前准备工作一、样品1样品：医用产品，三个批号：生产企业：公司。
2器具及试剂2.1器材试管容量瓶三角烧瓶酒精灯灭菌剪刀、镊子灭菌平皿（9cm）75％乙醇棉灭菌刻度吸管(1ml、5ml)紫外可见分光光度计立式压力蒸汽灭菌器电热鼓风干燥箱酸度计恒温培养箱电热恒温水浴锅生化培养箱电热恒温干燥箱2.2培养基及试剂：a)流体硫乙醇酸盐培养基b)改良马丁培养基c)营养琼脂培养基2.3稀释液、冲洗液及其制备方法a)质量浓度为9g/L的无菌氯化钠溶液b)0.1％蛋白胨水溶液取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，调节pH值至7.1±0.2，分装，灭菌。
c)pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。
二、实验前准备2.1培养基要求：用于培养需（厌）气菌和真菌的培养基的制备、培养基灵敏度检查及其他各项要求应符合《中国药典（二部）》附录中《无菌检查法》的规定。
培养基使用按中国药典方生产的符合规定的脱水培养基。
制备后采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基保存在2～25℃、避光的环境。
2.2器具灭菌：与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸气灭菌器内121℃30min，或置电热干燥箱内160℃2h。
北京市医疗器械无菌检验检查要点指南(2023版)
检查人员应在充分了解生产企业无菌检验活动的情况下，对其无菌检验过程的控制情况进行全面的检查并对其 控制水平作出客观的评价。
一般情况下，检查人员可按照以下顺序开展检查工作，并适时做好相关记录：
.了解产品特性及生产企业选择的无菌检验方法。常见的产品无菌检验方法包括直接接种法和薄膜过滤法。当建 立产品的无菌检验方法时，生产企业应进行方法适用性试验，以证明所采用的方法能够给出正确的结果。若检验程 序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。方法适用性试验应按供试品无菌检验的规定 及有关要求进行操作，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性和对微生物无毒性。应对药
.现场查看无菌检验所需的设备和器具。其中，主要设备包括：恒温培养箱（真菌、细菌）和（或）恒温水浴箱 、压力蒸汽灭菌器和(或)电热干燥箱、电子天平、光学显微镜、集菌仪、过滤装置(无油真空泵、滤杯、滤头、滤瓶 、微孔滤膜、夹子)等；从试验安全性考虑，建议阳性对照试验使用生物安全柜。
主要器具有：试管及试管架、酒精灯、75%乙醇棉、灭菌刻度吸管(InIL)、灭菌平皿(9cm),锥形瓶、三角烧瓶、 灭菌剪刀、镶子等。
本指南中涉及或引用的国家相关法律、法规、规章、标准、检查指南等发生内容或效力变化时，要以当时执行 的最新版为准。必要时，北京市药品监督管理局应重新研究修订，以确保本指南持续符合要求。
一、适用范围
本检查指南可作为北京市药品监督管理局组织、实施医疗器械注册质量管理体系现场核查、医疗器械生产许可 现场核查、医疗器械生产监督检查等涉及无菌检验检查的参考资料。
培养基的制备
培养应注意培养条件：硫乙醇酸盐流体培养基（30〜35）。C14天；胰酪大豆腺液体培养基（20〜25）。（ 214天。选择培养条件需考虑的因素：产品的性质、制造方法、潜在的微生物污染来源、可能遇到的微生物
医疗器械产品无菌检验操作规程
医疗器械产品无菌检验操作规程1 目的通过无菌检验，确保灭菌后产品能够达到无菌的要求。
2 适用范围适用于灭菌后医疗器械产品（列举）的无菌检验。
3 检验依据本厂产品注册标准（编号）EN1174-1996 医疗器械灭菌产品中微生物数量的评估《中国药典》（2005年版）GB14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分：生物试验方法GB15980-1995 一次性使用医疗用品卫生标准4 仪器、设备百级层流超净工作台、电热干燥箱、电热恒温培养箱、霉菌培养箱、压力蒸汽灭菌器、集菌仪（器）、电子天平、PH 计、冰箱、恒温水浴锅、酒精灯、三角烧瓶，接种环、无菌棉签、镊子，试管架，大试管若干等。
5 无菌检验室的环境要求5.1 无菌检验应在环境洁净度10000级下的局部百级的单向流空气区域内进行。
5.2 缓冲区与外界环境、无菌检验室与缓冲区之间空气应保持正压，阳性对照室与缓冲区之间空气应保持负压。
无菌检验室与室外大气之间静压差应大于10Pa。
无菌检验室的室温应保持18～26℃，相对湿度：45～65%。
5.3 无菌检验室的单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的监测。
每年至少检测一次。
5.4 无菌检验过程中应同时检查超净工作台单向流空气中的菌落数：每次操作时在层流空气所及台面的左中右置3个营养琼脂平板，暴露30min，于30～35℃培养48小时，菌落数平均应不超过1CFU/平板。
6 无菌检验前的准备6.1 器具灭菌、消毒6.1.1 灭菌：试验过程中与供试品接触的所有器具必须采用可靠方法灭菌。
可经电热干燥箱160℃以上干烤2小时，或置压力蒸汽灭菌器内121℃蒸汽灭菌30分钟后使用（根据灭菌效果验证决定灭菌参数）。
所有的灭菌物品不应超过2周即用毕，否则应重新灭菌。
6.1.2 消毒：凡检验中使用的器材无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处理。
医疗器械生产质量管理规范无菌医疗器械实施细则无菌医疗器械过程确认或验证项目清单
医疗器械生产质量管理规范无菌医疗器械实施细则无菌医疗器械过程确认或验证项目清单第一章总则第一条为规范无菌医疗器械的生产管理，保证产品的无菌性和质量安全，制定本细则。
第二条本细则适用于无菌医疗器械的生产过程和验证活动。
第三条无菌医疗器械的生产过程应符合相关的法律法规和技术要求，确保产品的无菌性和安全性。
第四条无菌医疗器械生产过程应根据产品的特点和风险评估结果，设计医疗器械无菌生产线和相应的工艺流程。
第五条生产过程确认或验证活动包括验证计划的制定、验证方案的编制、验证实施和验证结果的评估等步骤。
第二章生产过程确认或验证计划的制定第六条生产过程确认或验证计划应根据相关法律法规和技术要求的要求进行制定，含括以下内容：（一）验证目标和范围：明确验证的目标和验证活动的范围。
（二）验证方法和方案：确定验证的方法和方案，包括实验室测试、实际运行验证等。
（三）验证时间和周期：确定验证活动的时间和周期，确保验证活动的顺利进行。
（四）验证资源：确定所需验证资源，包括人员、设备、维修等。
（五）验证文件：制定验证所需的文档和记录。
第三章生产过程确认或验证方案的编制第七条生产过程确认或验证方案应根据验证计划的要求进行制定，含括以下内容：（一）验证范围和目标：明确验证的范围和验证活动的目标。
（二）验证方法和步骤：确定验证的方法和步骤，包括实验室测试、实际运行验证等。
（三）验证样本的选择和来源：确定验证样本的选择和来源，确保验证样本具有代表性。
（四）验证参数和指标：确定验证的参数和指标，保证验证结果的准确性。
（五）验证设备和条件：确定所需的验证设备和条件，确保验证活动的顺利进行。
第四章生产过程确认或验证的实施第八条生产过程确认或验证应根据验证方案进行实施，确保验证的准确性和可靠性。
（一）样本采集：按照验证方案的要求进行样本的采集。
（二）实验室测试：对样本进行实验室测试，确保测试结果的准确性。
（三）实际运行验证：对生产过程进行实际运行验证，确保生产过程的稳定性。
医疗器械无菌检验
供试品无菌检验
结果判断 试验若经确认无效，应重试。
重试时，重新取同量供试品，依法检查， 若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌 生长，判供试品不符合规定。
实验试液
稀释剂 1.0.9%氯化钠溶液 2.0.1%蛋白胨水溶液 3. pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液：调解pH至 近中性，其中蛋白胨对菌细胞有保护作用， 有利于菌数及控制菌测定 表面活性剂与中和剂
培养基
硫乙醇酸盐流体培养基(用于培养需氧菌、厌氧 菌)，置30℃ ~35℃培养； 其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养 基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。 在供试品接种前, 培养基氧化层的高度 不得超过培养基深度的1/5，否则,须经 100℃水浴加热至粉红色消失（不超过 20分钟）迅速冷却, 只限加热一次，并 应防止被污染。
培养基灵敏度检查
培养基接种
金黄色葡萄球菌2支 铜绿假单胞菌2支 枯草芽孢杆菌2支 生孢梭菌2支 空白对照1支
硫乙醇酸盐流体培养基
每管小于100cfu，培养3天。
培养基灵敏度检查
培养基接种
白色念株菌2支
改良马丁培养基
黑曲霉2支
空白对照1支 每管小于100cfu，培养5天。
培养基灵敏度检查
供试品无菌检验
细菌检测管：硫乙醇酸盐流体培养基+供试品 真菌检测管：改良马丁培养基+供试品 阳性对照管：对应阳性菌+对应培养基+供试品 阴性对照管：培养基
供试品无菌检验
检验数量：是指一次试验所用供试品最小 包装容器的数量。
一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜 过滤法，应增加最小检验数量的1/2作阳性 对照用；若采用直接接种法，应增加供试 品无菌检查时每个培养基容器接种的样品 量作阳性对照用。
灭菌柜验证方案
灭菌柜验证方案灭菌柜在医疗、实验室等领域起到了至关重要的作用，保证了实验物品及医疗器械的无菌状态。
为了确保灭菌柜的有效性和安全性，验证灭菌柜的性能成为不可或缺的步骤。
本文将介绍灭菌柜验证的方案，并详细阐述每个步骤的操作方法。
一、验证目的和范围灭菌柜验证旨在验证灭菌柜的性能是否符合规定要求，具体验证内容包括：1. 温度和压力控制系统是否准确可靠。
2. 灭菌效果是否达到预设要求。
3. 灭菌时间是否符合规范。
4. 灭菌柜是否能有效消除空气中的微生物。
二、验证前准备工作1. 清洁灭菌柜：彻底清洁灭菌柜，包括内部和外部，确保洁净度满足要求。
2. 准备验证工具和试剂：包括温度计、压力计、生物指示剂等。
三、温度和压力控制系统验证1. 温度验证：a. 放置温度计于灭菌柜中，检测温度传感器与温度计的差异。
b. 分别将灭菌柜设置为低温、常温、高温，验证温度控制系统的准确性和稳定性。
2. 压力验证：a. 使用压力计测量灭菌柜内外的压力差异。
b. 调整灭菌柜的排风和进风口，确保系统良好的气流。
四、灭菌效果验证1. 选择适当的生物指示剂，如生物指示纸或生物监测器，放置于灭菌柜内。
2. 进行标准的灭菌程序，确保灭菌时间、温度、压力等参数符合要求。
3. 拿出生物指示剂，送至专业实验室进行培养检测，验证灭菌效果。
五、灭菌时间验证1. 将特定数量的指示物放置于灭菌柜中，设置不同的灭菌时间。
2. 分别取出指示物，在培养基上进行培养，观察是否生长出细菌。
3. 验证出可行的最短灭菌时间并记录。
六、微生物消除验证1. 在灭菌柜内放置灭菌板或生物指示剂。
2. 进行标准的灭菌程序，验证灭菌柜对空气中微生物的消除效果。
3. 将灭菌板或生物指示剂送至专业实验室进行检测，观察是否有微生物生长。
七、验证结果记录与分析1. 按照验证过程中的操作记录，整理验证结果。
2. 分析验证结果，判断灭菌柜是否符合要求。
3. 如验证结果有问题，则需要进行调整、维修或更换设备。
医疗器械的常用灭菌方法及验证
医疗器械的常用灭菌方法及验证医疗器械产品灭菌的目的，是使产品无任何类型的存活微生物，在灭菌过程中，微生物的死亡规律是用指数函数表示的。
因此任何单位产品上微生物的存在可用概率表示，概率可以减少到很低，但不可能为零。
该概率可用无菌保障水平(SAL) 表示，通常无菌概念是指无保障水平(SAL) 达到10-6。
医疗器械灭菌验证一般分为安装确认(IQ)、操作确认(OQ) 和性能确认(PQ)。
安装确认是指：获得证据并用文件证明灭菌设备及其附属设施，已按照规定的要求被提供和安装。
操作确认是指：当设备按程序运行时，获得证据并用文件来证明已安装的设备，有能力在指定的允差范围内提供特定的过程。
性能确认是指：获得证据并用文件证明设备能够在预先设定的参数下持续运行，且这个过程加工后的产品是无菌的。
性能确认一般包括物理性能确认和微生物性能确认，器械所使用的材料对灭菌方法的适用性，也是性能验证中的重点。
本文结合国际上最新的灭菌相关标准，介绍了无菌医疗器械生产的几种常用的灭菌方法及其验证要点，如环氧乙烷灭菌(EO 灭菌)、辐照灭菌、高压蒸汽灭菌和甲醛蒸汽灭菌等，以供医疗器械研究和生产单位参考。
1. 环氧乙烷灭菌20 世纪50 年代起环氧乙烷(ethylene oxide, EO)开始用于医院灭菌。
经过众多科学家的研究证明，环氧乙烷被认为是一种灭菌效果较好的低温化学灭菌剂，在常温下即有良好的穿透作用，对物品无损害，而被广泛用于畏热、畏湿的医疗器械产品灭菌中。
1.1 灭菌原理EO 是一种简单的环氧化合物，遇水可形成乙二醇，具有较大的蒸汽压，对物品的穿透性较强。
据报道，EO5min 能穿透0.1mm 厚的尼龙薄膜，26min 能穿透0.3mm 的氯丁胶布，41min 能穿透0.39mm 厚的丁基橡胶布。
如果要达到一定的灭菌效果，灭菌剂必须充分接触物品的各个表面，EO 的这种高穿透性大大提高了其灭菌效果。
EO 对细菌、芽孢、真菌、立克次体和病毒等各种微生物具有杀灭作用，属于光谱杀菌剂，其灭菌机理是与细菌蛋白质分子、酶、核酸中的氨基、羟基、羧基相结合，产生烷基化作用，对菌体细胞的代谢产生不可逆的破坏，从而达到灭菌作用。
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- 1 - **********有限公司 无菌检验方法 验证方案
验证方案申请人: 日期: 年 月 日 验证方案审核人: 日期: 年 月 日 验证方案审批人: 日期: 年 月 日 - 2 -
1. 概述： 无菌检查法是为了检查药典要求无菌的医疗器械产品是否无菌而建立的检查法， 是作为批准无菌产品放行的检验或监督部门对无菌产品质量监督中的一个重要项目。它是根据用于实验的培养基中是否有微生物生长来判定样品的无菌性 ， 液体培养基变浑浊一般表明样品受微生物的污染。基于微生物污染的不均匀性，使无菌检查法结果的可信度受许多因素制约， 如抑菌因素、检查法、检验量、检查用的培养基质量、操作环境、无菌技术等。检验方法的验证是现代质量保证体系中关系到质控技术、方法、手段的科学性、准确性的重要组成部分 ，是保证检验结果的公正、 科学、准确的基础。
2. 验证目的： 验证所采用的方法和条件是否适合于供试品的无菌检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。
3. 验证范围： 适用于医用纱布无菌检查法的验证。 4. 验证人员及职责 姓名 职务 职责
负责验证方案的批准实施、验证报告的批准 验证方案、验证报告的起草并负责验证过程中现场的监控及取样 负责按制订无菌检验规程实施检验和验证实验
5. 文件准备和培训 检查验证所需的各类文件资料，应齐全；相关的文件草案是否已具备。 文件编码 文件名称 存放部门
6. 验证条件 6.1. 仪表量器经过校验合格，且在有效期内。 6.2. 供试品：随机抽取*******医药有司生产的3个批次医用无菌医用纱布 - 3 -
6.3. 培养基及试剂： 6.3.1. 试剂试液： 0.9%氯化钠、氯化钠—蛋白胨缓冲液，配制记录见附件1 6.3.2. 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基 生产厂家： 批号： 改良马丁培养基 生产厂家： 批号： 营养琼脂培养基 生产厂家： 批号： 改良马丁琼脂培养基 生产厂家： 批号： 蛋白胨 生产厂家： 批号： 培养基配制记录见附件2。 6.4. 验证用菌株： 金黄色葡萄球菌 【CMCC（B）26003】 铜绿假单胞菌 【CMCC（B）10104】 枯草芽孢杆菌 【CMCC（B）63501】 生孢梭菌 【CMCC（B）64941】 白色念珠菌 【CMCC（F）98001】 黑曲霉 【CMCC（F）98003】 标准菌株购自：浙江省食品药品检验研究中心 各验证用菌种传代记录见附件3。 6.5. 无菌检验仪器及相关设备： 压力蒸汽灭菌器 型 号： 生产厂家： 校验日期： 有效期： 生化培养箱（细菌培养） 型 号： 生产厂家： 校验日期： 有效期： 生化培养箱（霉菌培养） 型 号： 生产厂家： 校验日期： 有效期： - 4 -
7. 验证内容： 7.1. 培养基无菌性检查： 每批培养基随机取不少于5支，培养14天，应无菌生长。 培养基无菌性检查记录 日期： 硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基
1 2 3 4 5 6 结论 注备： 检测人/日期： 复核人/日期： 7.2供试品的制备 医用纱布供试品：将包装好的医用纱布打开，用剪刀将医用纱布剪碎，放入100ml pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液中浸泡1小时，取水层作为供试品。 7.3. 试验菌液的制备 7.3.1. 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基斜面中,置30－35℃培养18-24小时，分别取用3-5ml 0.9％的无菌氯化钠溶液，反复吹洗，冲下菌苔，震荡80次，用10倍递增稀释制成每1ml含菌数小于100 CFU的菌悬液。 7.3.2. 接种生孢梭菌的新鲜培养物至12ml硫乙醇酸盐流体培养基中,30～35℃培养18～24小时，取上述培养物1ml加9ml0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释制成每1ml含菌数小于100 CFU的菌悬液。 7.3.3. 接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，置23－28℃培养24-48小时，取上述培养物1ml加9ml 0.9％的无菌氯化钠溶液10倍递增稀释制成每1ml含菌数小于100CFU的
培养基 培养天数 支数 - 5 - 菌悬液。 7.3.4. 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中,置23-28℃培养5-7天，使大量孢子形成。用3-5ml0.9％的无菌氯化钠溶液将孢子洗脱并过滤孢子悬液至无菌试管内作为原液，取1m原液加9ml 0.9％的无菌氯化钠溶液10倍递增逐级稀释制成每1ml含孢子数小于100CFU的孢子悬液。 7.4. 培养基灵敏度检查 取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100 CFU的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌菌悬液各1ml，每种培养基各接种2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100 CFU的白色念珠菌、黑曲霉菌悬液各1ml，每种培养基各接种2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天，逐日观察结果。空白对照管无菌生长,加菌的培养基管均生长良好,判灵敏度检查合格。 硫乙醇酸盐流体培养基： 日期： 1 2 3
金黄色葡萄球菌 1 2
铜绿假单胞菌 1 2
枯草芽孢杆菌 1 2
生孢梭菌 1 2 空白对照 结论 检测人/日期： 复核人/日期： 改良马丁培养基： 日期 1 2 3 4 5 白色念珠菌 1
菌种 培养天数 支数
菌种 培养天数 支数 - 6 -
2 黑曲霉菌 1 2 空白对照 结论 注备：“+”表示长菌，“—”表示不长菌，“±”表示可疑长菌 检测人/日期： 复核人/日期： 7.5. 拟验证的医用纱布无菌检查试验方法 分别取医用纱布供试品，加入相应的硫乙醇酸盐流体培养基与改良马丁培养基各100ml，细菌于30～35℃培养14天， 真菌于23～28℃培养14天。同时每天观察并记录实验结果。 日期： 硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
培养基 培养天数 支数 - 7 -
结论 注备：“+”表示长菌，“—”表示不长菌，“±”表示可疑长菌 检测人/日期： 复核人/日期： 7.6. 验证试验的方法 7.6.1. 将医用纱布供试品分别人工污染小于100cfu的金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、黑曲霉、白色念株菌菌悬液后加入相应的硫乙醇酸盐流体培养基与改良马丁培养基各100ml，作为供试品阳性对照组；另分别取装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为阳性对照组；同时平行做缓冲液的阴性对照组。 7.6.2. 细菌于30～35℃培养5天， 真菌于23～28℃培养5天。每天观察并记录实验结果。 7.7. 可接受标准 阴性对照呈阴性，阳性对照呈阳性，供试品阳性对照组微生物生长情况与阳性对照组一致，说明医用纱布按照《无菌检查法标准操作规程》操作，供试品对微生物生长无不良影响，则医用纱布的无菌检查方法通过。 - 8 -
7.8. 试验记录 日期
菌株 次数 培养基 硫乙醇酸盐 改良马丁培养基 1 2 3 4 5 （d） 1 2 3 4 5
金黄色葡萄 球菌
阳性 供试品 阳性 对照
生孢梭菌 阳性 供试品 阳性 对照
枯草杆菌 阳性 供试品 阳性 对照
铜绿假单胞菌 阳性 供试品 阳性 对照 阴性对照
黑曲霉 阳性 供试品 阳性 对照
白色念株菌 阳性 供试品 阳性 对照 阴性对照 注备：“+”表示长菌，“—”表示不长菌，“±”表示可疑长菌 检测人/日期： 复核人/日期： - 9 -
日期 菌株 次数 培养基 硫乙醇酸盐 改良马丁培养基 1 2 3 4 5 （d） 1 2 3 4 5
金黄色葡萄 球菌
阳性 供试品 阳性 对照
生孢梭菌 阳性 供试品 阳性 对照
枯草杆菌 阳性 供试品 阳性 对照
铜绿假单胞菌 阳性 供试品 阳性 对照 阴性对照
黑曲霉 阳性 供试品 阳性 对照
白色念株菌 阳性 供试品 阳性 对照 阴性对照 注备：“+”表示长菌，“—”表示不长菌，“±”表示可疑长菌 检测人/日期： 复核人/日期：