Primer3Plus--一个增强的web借口--primer3
生物技术 5-3
由于三磷酸脱氧核苷能与Mg++定量结合，反应中 dNTP的量决定了游离Mg++的浓度，在标准反应中，四 种三磷酸脱氧核苷被加至0.8mmol/L终浓度，使原来 1.5mol/L MgCl2中有0.7mmol/L与dNTP结合。 如显著改变dNTP，的浓度，则MgCl2浓度也必须作相应 的调节。
H2 O
pH值适当
避免污染
PCR的反应条件
退火温度 时间 循环次数
温度与时间的设臵 标准反应中采用三温度，双链DNA在90～95℃变性，再 迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然 后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下， 使引物链沿模板延伸； 对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温 度， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性， 65℃左右退火与延伸
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时，DNA合成几乎不能进行
延伸温度：一般选择在70～75℃之间
特异性不好或引物质量不高会在EB染色的琼脂糖凝胶上 可见到非特异性PCR条带； 扩增效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与
理论上成倍增长量的程度接近。
•引物设计原则
1. 碱基分布的均衡性 同一碱基连续出现不应超过5个； GC含量一般40-60%，GC含量太低导致引物Tm值较低，
太少扩增效果不佳，也易于引发非特异扩增。
专一性 复制酶体外反应
嗜热菌中分离到 DNA聚合酶使PCR 设计成为适用的技 术
PCR反应包括三个步骤 双链DNA在高温下形成单链(变性); 低温下引物与单链DNA互补配对(退火); 在适宜温度下Taq DNA聚合酶催化引物沿模板延伸。
PCR说明书-天根
反应举例
注意：以下举例仅供参考，实际反应条件因模 板、引物等的结构不同而各异，需根据实际情 况，设定最佳反应条件。 1. 用2×Taq Plus PCR MasterMix产品，以人基
因组DNA为模板，扩增1 kb的片段，反应体系 为25 µl（如反应体系不同，可按此比例增加 或减少用量）。
组成成份
版本号: KT121221
2×Taq Plus PCR MasterMix
目 录 号：KT205 储存条件: -20℃可长期保存，多次冻融不会影响
活性。如需经常使用，可存放于4℃。 产品内容：
产品组成
2×Taq Plus PCR MasterMix ddH2O Loading dye in MasterMix
产品组成（2×）
0.1 U Taq Plus Polymerase/µl 500 µM dNTP each 20 mM Tris-HCl (pH8.3) 100 mM KCl 3 mM MgCl2 其它稳定剂和增强剂
质量控制
经检测无外源核酸酶活性；能有效地扩增人基因 组中的单拷贝基因；室温(15-25℃)存放一周，无明 显活性改变。
适用范围
基因检测：本产品不同批次之间误差很小，特别 适合大规模基因检测，半定量PCR实验和微量DNA 的检测。
保真度较高的DNA扩增和一些有特殊结构的复 杂模板如GC含量高（>60%），有二级结构等的扩 增：DNA片段的PCR扩增、DNA标记、引物延伸、 序列测定等。PCR产物如需克隆，纯化后可直接进行 T/A载体克隆，如需提高克隆效率，建议加A后再进 行T/A载体克隆。
体积
Template
< 1 µg
Primer 1(10 µM)
takara反转录试剂盒说明书
Code No. RR047A 研究用PrimeScript™RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书目录内容页码●制品说明1●制品内容 1 ●试剂盒外必备材料 1 ●保存 1 ●特长 2 ●使用注意 2 ●操作方法 2 ● Real Time PCR 4 ●实验例 6 ●附录7 ●关联产品8●制品说明为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但Total RNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。
为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组DNA得不到扩增。
但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。
在这种情况下，我们常常需要对Total RNA样品进行DNase I处理，以除去残存的基因组DNA。
而DNase I处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组DNA进行Real Time RT-PCR反应的专用反转录试剂。
Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNA Eraser，通过42℃，2 min即可除去基因组DNA。
同时由于反转录试剂中含有抑制DNA分解酶活性的组分，经过gDNA Eraser处理后的样品可以直接进行15 min的反转录反应合成cDNA，因此，20 min内即可迅速完成从基因组DNA去除到cDNA合成的全过程。
使用本制品合成的cDNA适用于SYBR® Green分析法和TaqMan®探针分析法，可以根据实验目的，选择与SYBR Premix Ex Taq™ II（Tli RNaseH Plus）（Code No. RR820Q/A/B）、Probe qPCR Mix（Code No. RR391S/A/B）组合使用。
pep-3评估手册
pep-3评估手册PEP 3是Python Enhancement Proposal（Python增强提案）的一部分，它是用于评估和审核PEP的手册。
PEP是Python社区用于提出和讨论新特性、改进和标准的文档。
PEP 3提供了一套准则和流程，以确保PEP被充分评估和审查，从而促进Python语言的发展和改进。
PEP 3评估手册包含以下内容：1. 摘要，PEP的摘要部分提供了对该提案的简要描述，包括提案的目的、背景和预期的结果。
摘要应该清晰明确，以便读者能够快速了解提案的核心内容。
2. 动机，这一部分解释了为什么需要这个提案，它解决了什么问题，以及它对Python社区和用户的好处。
动机的清晰性和充分性对于评估提案的重要性和可行性非常重要。
3. 详细描述，在这一部分，提案的作者提供了对提案的详细描述。
这包括提案的技术细节、语法和语义变化、示例代码等。
详细描述应该尽可能地清晰、准确地描述提案的内容，以便读者能够全面理解提案。
4. 示例，提案的作者可以提供示例代码来说明提案的用法和效果。
这些示例代码有助于读者更好地理解提案，并评估提案的实用性和可行性。
5. 兼容性，这一部分讨论了提案对现有代码和库的兼容性影响。
如果提案引入了不兼容的变化，应该解释如何处理这些变化，以确保平滑过渡。
6. 安全性，如果提案涉及安全性问题，这一部分应该提供相关的讨论和解决方案。
安全性对于Python的使用非常重要，因此提案的作者需要充分考虑潜在的安全风险和漏洞。
7. 参考资料，提案的作者应该提供相关的参考资料和链接，以便读者进一步了解提案的背景和相关工作。
PEP 3评估手册确保了PEP的质量和可行性，同时也为Python社区的成员提供了一个评估和审查提案的标准和流程。
这有助于确保Python语言的发展是经过充分讨论和评估的，从而使Python社区能够更好地满足用户的需求和改进语言的功能。
pMD18-T使用说明书(附序列)
1. Solution I 请于冰中融解。 2. 克隆时使用的 Insert DNA 片段（PCR 产物）建议进行切胶回收纯化，否则 PCR 产物中的短片段
DNA（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质都会影响 TA 克隆效率。 3. 按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过 20 μl。当要转化的 DNA 量较大或
4）全量（10 μl）加入至 100 μl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。 5）42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。 6）加入 890 μl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟。 7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8）挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。
40.4
0
* 效率是指白色菌落中的目的 DNA Insert 片段的连入效率。
■一般 DNA 片段的克隆实验
1）在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 5 μl。
pMD®18-T Vector*1
1 μl
Insert DNA*3
0.1 pmol～0.3 pmol
dH2O
up to 5 μl
-2-
准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化 DNA 后再进行转化。进行乙醇沉淀时使用核酸 共沉剂（TaKaRa Code：D605A）可以提高 DNA 的回收率。 4. 连接反应请在 25℃以下进行，温度升高（>26℃）较难形成环状 DNA。连接效率偏低时，可适当 延长连接反应时间至数小时。 5. 本制品来源于 pUC18 载体，因此，适合 pUC18 载体的感受态细胞都可以使用，如：JM109 等。
pEASY-Blunt Cloning Kit使用说明书
● 快速克隆基因，仅需要5分钟反应时间。
● 提供氨苄青霉素和卡那霉素两种筛选标记。
● 对照插入片段克隆效率可达85% 以上。
● 包含LacZ 基因，在含有IPTG，X-gal 的平板培养基
上，可进行蓝白斑筛选。
PCR 产物的制备
(1) 引物要求：引物不能磷酸化。
(2) 酶的选择： Pfu系列的DNA 聚合酶。
M13F (10 μM)，M13R (10 μM)，Trans1-T1 Phage
Resistant Chemically Competent Cell。Expected PCR
product size： 700 bp。 产品说明 pEASY®- Blunt Cloning Vector 适用于平端克隆。
to 50 μl
Final Concentration as required 0.2 μM 1× 0.2 mM 2.5 units
Not applicable
PCR
94℃ 94℃ 50-60℃ 72℃ 72℃
2-5 min 30 sec 30 sec 1kb/min 10 min
30 cycles
本产品仅供研究，不用于临床诊断。
目录号：CB101 保存:Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent
Cell-70℃保存六个月，其它-20℃保存六个月。 试剂盒组成 pEASY®- Blunt Cloning Vector (10 ng/μl)，Control
Template (5 ng/μl)，Control Primers (10 μM)，
EcoR V
BstX I
Not I
Xho I
Primavera Project Planner(P3)教程
1. 流程图2.启动P3应用程序：2.1 启动P3Primarera PrimareraProjectplannerusernamepassword2.2 文件菜单打开现有工程File Openprives c:\p3win\projectsexclusive)3. 建立工程和编码结构3.1 工程组：是它自己的作业和若干个子工程的集合工程，也叫主工程。
使用工程组可简化多个工程的管理；便于不同工程级别汇总和数据组织数据。
为了确保工程组之间数据保持一致性，需要统一以下数据：日历作业分类码WBS资源费用科目自定义数据项目3.1创建工程File New c:\prwin\projectsprives 工程代码project name):四位字母备注（humber/version):版本号公司名称：（project litle)计划单位：（planning unit)时/天/周/月开工时间：（project start)工作日（workdays)选择5天/七天将新工程加到工程组，同时写上工程识别码（project id):两位字母图一3.2工程备份：工具¡¡工程操作¡¡备份（备份前应在指定的盘内新建文件夹）图二备份设置4. WBS4.1 WBS设置定义¡¡WBS设置图三说明：进行结构设置，计划中涉及到的结构，提前有个结构框架，主要标题结构及分类，P3中共有10级可以设置。
WBS的划分，通常按照工程实体和项目阶段分两种方式，每个项目可以依据项目具体情况进行划分，但是只有标准统一，就有利于汇总承包商的数据和相关信息。
WBS编码还可以从其它项目中转载，如果项目比较相似，可以直接转载。
图四工作结构设置图五计划标题说明：一级标题：01 6月份电气安装进度计划二级标题：01.01 GIS设备安装三级标题：01.01.01 GIS抽真空4.2 数据组织选择数据组织¡¡工作分解¡¡选择显示空的工作分解层¡¡排序¡¡选中后在下拉菜单中选择工作编码¡¡立即重组数据组织数据组织选择重组后重组后其中项目在计划中暂时不需要，可以通过栏位设置删除。
3'RACE说明
TaKaRa Code：D3143’-Full RACE Core Set Ver.2.0(20 RT Reactions)目录内 容页 码●制品说明 1●制品内容 1●保存 2●试剂盒原理 2●特异性引物设计的注意事项 3●试剂盒特点 3●RNA样品制备 3●试剂盒使用注意事项 4●使用Control RNA时的实验操作 4●使用实验样品RNA时的实验操作 6●实验例 8●Q&A8●参考文献 9●制品说明本试剂盒是高灵敏度、高特异性扩增cDNA 3′末端全长的试剂盒。
对RNA结构进行分析时，一般先通过RT-PCR反应扩增目的区域，然后再对扩增出的目的DNA片段进行克隆、序列分析等。
一般的RT-PCR 反应很难得到全长的cDNA片段，然而在基因工程研究中，分析遗传基因的全长cDNA序列又是十分重要的。
RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）法能有效地解决这一问题。
TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0能够通过已知的cDNA序列，高灵敏度、高特异性地扩增cDNA的3′末端的全长序列。
本试剂盒中含有完成3′-RACE操作的主要试剂。
试剂盒中使用的Reverse Transcriptase M-MLV （RNase H-）经过了本公司的特殊改良，反转录性能良好，无RNase H活性，大大增加了反转录性能。
结合使用TaKaRa LA Taq®（TaKaRa Code：DRR02AM）进行PCR扩增时，其3′RACE的扩增性能大大优于其他同类产品。
本试剂盒应用了套式PCR原理，增加了PCR扩增的特异性与灵敏度，可以对少量样品或低丰度的基因进行3′RACE实验，并且对长片段的3′RACE扩增具有明显优势，我们曾经使用本试剂盒成功扩增了8 kbp 的3′RACE DNA片段。
使用TaKaRa LA Taq®扩增得到的PCR产物3′端附有一个“A”碱基，其产物可直接克隆于T-Vector中。
C++ Primer Plus 勘误(第六版)
删分号 加冒号 变小写 变小写 拼写错 加* 地址错 加d
所有权转让给 pu3 后就会被销毁。 变量错 -改_ 改小写 改小写 删掉 p 加叹号 加分号
W 为 0 表明， 默认的字段宽度为 0。 w 为 0 表明， 默认的字段宽度为 0。 改小写 拼写错 out 改为 in out 改为 in 改小写
P511 / F5 P536 / 图 14.1 / B5 P536 / B2 P536 / B1 P622 / F8 P667 / 16.2 / F7 P668 / 图 16.2-demo2-#2 / B2 P669 / 16.2.1 / B2 P673 / 16.2.3 / F14 P692 / 16.4.4-2 / F3 P708 / F10 P708 / F12 P721 / B7 P738 / 图 17.4-最 下面的图 P741 / 17.2.3 / B2 P744 / B1 P762 / B12 P755 / 表 17.8 / F5 P755 / 表 17.8 / F6 P782 / B9
Fn：正数第 n 行，Bn：倒数第 n 行
4
修改为 程序清单 2.2 carrots.cpp int、unsigned int、long、… unsigned int 转义序列\n 表示换行符 8.33E-4 表示 8.33/10 9.11e-31 kg 表示… d.dddE-n 指的是… perks 类型的变量—perks mr_blug; 程序需要 strlen(temp)+1 个字符 则 strcmp()将返回一个正数值 声明为 unsigned int 类型 rodents address = 0x0065fd44 我 们 使 用 “ coordin.h ” 而 不 是 ， <coordin.h>。 Embarcadero C++ Builder 从而跳到#endif 后面的一行上 int *pin = new int {6}; cout << bozetta.Retort(); #define STOCK10_H_ Bozo fufu{“Fufu”, “O’Dweeb”}; // C++11 编译器将用 12 来替换它 随便说一句，程序清单 12.1… Klunk() { klunk_ct = 0; } 则 operator<()函数返回 true。 使用标准的 strcmp()函数 delete [] c_pointer; Show (&player1); Show (&rplayer1); void Move(int nx, int ny) { x = nx; y = ny; } void Move(int nx, int ny) { x = nx; y = ny; } void Move(int nx, int ny) { x = nx; y = ny; } 派生出 Ellipse 类和 Circle 类
引物设计操作-常用软件
引物设计的原理和程序一、设计原理1、选择合适的靶序列：设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。
2、长度：一般来说，寡核苷酸引物长度为15-25bp。
3、Tm值：引物的Tm值一般控制在55-65℃，尽可能保证上下游引物的Tm值一致。
若G+C含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退货温度。
4、G+C含量：有效引物中的G+C含量一般为40%-60%。
5、碱基的随机分布：引物中四种碱基的分布最好是随机的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的3’端不应超过3个连续的G或C。
6、引物末端：只有引物的3’端与模板结合，PCR才能进行，所以3’端最好是G或C。
7、引物自身：引物自身不存在连续4个碱基以上的互补序列，否则会影响到引物与模板之间的结合，尤其避免3’端的互补。
8、引物之间：上下游引物之间尽量少的存在互补序列，否则上下游引物退火结合，将影响到PCR的扩增效率。
二、序列查找根据所需检测的待检定基因，在/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide&itool=toolbar网址查询有关序列。
三、引物设计与筛选分别以Primer Premier 5.0和Beacon Designer 5.1软件为例，进行引物设计和筛选。
（一）、Primer Premier 5.0软件1、打开软件，调入序列2、选择序列文件名，加入右框3、序列显示如图，4、点击“Primer”，按照引物设计的原理，设定引物的各种参数，点击“OK”进行引物搜寻5、等待引物搜寻，显示结束后，点击“OK”，进入下一页，6、按照搜寻结果显示，逐条分析，在主窗口中检查该引物对的二级结构，依次筛选（二）、Beacon Designer 5.1软件1、打开软件，调入序列2、选择序列文件名，加入右框3、序列显示如图，4、选择引物设计方式5、点击“Primer Search（图标）”，按照引物设计的原理，设定引物的各种参数，点击“Search”进行引物搜寻6、等待引物搜寻，显示结束后，点击“OK”，进入下一页，7、按照搜寻结果显示，逐条分析，点击“All Structures”，检查该引物对的二级结构，依次筛选四、引物比对比对设计的引物是否满足需要和引物的特异性，在/BLAST/ 网址进行比对1、输入所需比对的序列，选择数据库“nr”2、点击“Blast”，进入下一页3、点击“Format”，进入比对结果引物和探针设计软件Primer Express操作步骤(2009-06-13 23:43:40)标签：杂谈分类：专业1. 软件登录双击Primer Express软件的图标，登录软件，显示主页面。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
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- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
NucleicAcidsResearch,2007,Vol.35,WebServerissueW71–W74doi:10.1093/nar/gkm306
Primer3Plus,anenhancedwebinterfacetoPrimer3
AndreasUntergasser1,*,HarmNijveen2,XiangyuRao2,TonBisseling1,Rene´Geurts1andJackA.M.Leunissen2
1LaboratoryofMolecularBiologyand2LaboratoryofBioinformatics,DepartmentofPlantScience,
WageningenUniversity,Dreijenlaan3,6703HA,Wageningen,TheNetherlands
ReceivedJanuary31,2007;RevisedApril2,2007;AcceptedApril4,2007
ABSTRACTHerewepresentPrimer3Plus,anewwebinterfacetothepopularPrimer3primerdesignprogramasanenhancedalternativefortheCGI-scriptsthatcomewithPrimer3.Primer3consistsofacommandlineprogramandawebinterface.Thewebinterfaceisonelargeformshowingallofthepossibleoptions.Thismakestheinterfacepowerful,butatthesametimeconfusingforoccasionalusers.Primer3Plusprovidesanintuitiveuserinterfaceusingpresent-daywebtechnologiesandhasbeendevelopedinclosecollaborationwithmolecularbiologistsandtechniciansregularlydesigningprimers.Itfocusesonthetaskathand,andhidesdetailedsettingsfromtheuseruntiltheseareneeded.Wealsoaddedfunctionalitytoautomatespecifictaskslikedesign-ingprimersforcloningorstep-wisesequencing.Settingsanddesignedprimersequencescanbestoredlocallyforlateruse.Primer3Plussupportsarangeofcommonsequenceformats,suchasFASTA.Finally,primersselectedbyPrimer3Pluscanbesenttoanorderform,allowingtightintegrationintolaboratoryorderingsystems.Moreover,theopenarchitectureofPrimer3Plusallowseasyexpansionorintegrationofexternalsoftwarepack-ages.ThePrimer3PlusPerlsourcecodeisavailableunderGPLlicensefromSourceForge.Primer3Plusisavailableathttp://www.bioinformatics.nl/primer3plus.
INTRODUCTIONOligonucleotideprimersarewidelyusedinvariousmolecularbiologytechniqueslikeDNAsequencingandthepolymerasechainreaction(PCR).SinceaprimerservesasthestartingpointforDNAreplication,specificbindingoftheoligonucleotidetothetargetsequenceonthetemplatestrandisessentialforasuccessful
experiment.Thebindingspecificityofaprimerisdeterminedbyseveralofitsproperties,likethemeltingtemperature(Tm),GC-contentandselfcomplementarity.Designingprimersisusuallydonewiththehelpofcomputerprograms,amongwhichPrimer3ismostwidelyusedjudgingfromthehundredsofcitationsoftheprimarypublication(1).Primer3ispopularsincetheprogramcanbeusedonlineandisredistributedfreeofcharge.Recently,aSourceForgeprojectwasstartedforPrimer3inwhichseveralimprovementsarebeingdiscussedandimplemented.SubsequentlyPrimer3wasupdatedtoincludeanadditionalmethodforTmcalculation[SantaLuciamodel,(2)],sinceitwasarguedthatprimerdesignbasedontheBreslauermodelshowsvariationinthepredictedTm(3,4).Primer3consistsofacommandlineCprogram,andanHTMLwebinterfacewritteninPerl.Thewebinterfaceisonelargeformshowingallpossibleoptions.Thismakesitpowerful,butatthesametimeconfusingfortheoccasionaluser;withoutin-depthknowledgeitishardtotellwhichofthesettingsareimportantforaspecificdesigntask.Sometasks,likedesigningPCRprimersforpositionspecificcloning,arenoteasytoperformwiththecurrentwebinterface,sincethiswouldrequiremultiplerunsoftheprogramunderdifferentsettings.Becauseoftheseissueswiththecurrentwebinterfaceandfacilitatedbyitsliberallicense,severalacademicandcommercialpartieshavecreatedtheirowncommandlineand/orwebinterfacetoPrimer3,tailoredtotheirspecificneedsandaudience;e.g.EMBOSS’EPRIMER3andthePCRSuite(5,6).Wetookthiseffortonestepfurtheranddevelopedageneralpurpose,easytouseandpowerfulnewwebinterfaceforPrimer3,calledPrimer3Plusthatisavailableathttp://www.bioinformatics.nl/primer3plus.
WEBINTERFACEWeaimedtodesignthePrimer3Pluswebinterfaceinsuchawaythatitiscomprehensibleforoccasionalusers,andyetpowerfulfortheexperiencedusersthatneedtodomorecomplexorlaborioustasks.Wheretheoriginal
Theauthorswishittobeknownthat,intheiroption,thefirsttwoauthorsshouldberegardedasjointFirstAuthors*Towhomcorrespondenteshouldbeaddressed.Tel:þ31317482037;Fax:þ31317483584;Email:andreas@untergasser.de
ß2007TheAuthor(s)ThisisanOpenAccessarticledistributedunderthetermsoftheCreativeCommonsAttributionNon-CommercialLicense(http://creativecommons.org/licenses/by-nc/2.0/uk/)whichpermitsunrestrictednon-commercialuse,distribution,andreproductioninanymedium,providedtheoriginalworkisproperlycited.