水中大肠杆菌的检测方法(清晰整齐)

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水中大肠杆菌群检测方法－多管发酵法

NIEA E201.54B 一、方法概要

本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ± 1 ℃、

48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水样所

产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。二、适用范围

本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样中大肠杆菌群之检验。

三、干扰

(一) 水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。

(二) 检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。

四、设备

(一) 量筒：100至1000 mL之量筒。

(二) 吸管：有0.1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。

(三) 试管：大小约150 × 15 mm之试管或有盖螺旋试管。

(四) 发酵管（fermentation tube）：大小约22 × 9 mm之玻璃管。

(五) 稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。

(六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。

(七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。

(八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。

(九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0.01 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至0.001 g。

(十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。

(十一) 高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2或 1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。

(十二) 高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在160℃达2小时或170℃达1小时以上者。(十三) 接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。

(十四) pH计：精确度达0.1 pH单位。

五、试剂

(一) 试剂水：蒸馏水或去离子水，导电度在25 ℃时小于2 μ mho / cm（μS / cm）。

(二) 培养基，应使用市售商品化培养基。

１、硫酸月桂酸胰化蛋白胨培养基（Lauryl sulfate tryptose broth，简称LST）

1倍浓度LST培养基含有下列成份：

胰化蛋白胨（Tryptose）20.0g

乳糖（Lactose） 5.0g

氯化钠（NaCl）

5.0g

磷酸氢二钾（K2HPO4）

2.75g

磷酸二氢钾（KH2PO4）

2.75g

硫酸月桂酸钠（Sodium lauryl sulfate）0.1g

试剂水1L

配成2倍浓度（取71.2 g LST培养基粉末溶于1 L试剂水），完全溶解后，分取10 mL注入装有倒置发酵管之试管内，经121℃灭菌15分钟，冷却后备用，灭菌后培养基之pH值应在 6.8 ± 0.2。灭

菌后培养基若未当日使用，应保存在4 ± 2℃，保存期限为14天。可根据检验需求量，依配方配制培

养基。

２、煌绿乳糖胆汁培养基（Brilliant green lactose bile broth，简称BGLB）

1公升的BGLB 培养基中含有下列成份：

蛋白胨（Peptone）10.0g

乳糖（Lactose）10.0g

牛胆粉（Oxgall Powder）20.0g

煌绿色试剂（Brilliant Green）

0.0133g

试剂水

1L

取40 g BGLB培养基粉末溶于1 L试剂水，完全溶解后，分取5至10 mL注入装有倒置发酵管之试管内，经121℃灭菌15分钟，冷却后备用，其pH值应在7.2 ± 0.2。灭菌后培养基若未当日使用，

应保存在4 ± 2℃，保存期限为14天。可根据检验需求量，依配方配制培养基。

(三) 无菌稀释液

１、磷酸二氢钾储备溶液

取3.4 g磷酸二氢钾（KH2PO4）溶于50 mL的试剂水中，俟完全溶解后，以1.0 N NaOH 溶液调节其pH值为7.2 ±0.1，然后加试剂水至100 mL，灭菌（过滤灭菌或121 ℃高温高压灭菌15分钟）后储

存于冰箱中备用。4 ± 2 ℃下保存期限为3个月。

２、氯化镁储备溶液

取8.1 g氯化镁（MgCl2‧6H2O），先溶于少量试剂水，俟完全溶解后，再加试剂水至全量为100 mL，灭菌（过滤灭菌或121℃高温高压灭菌15分钟）后，储存于冰箱中备用。4 ± 2 ℃下保存期限为3

个月。

３、无菌稀释液

分别取10 mL氯化镁储备溶液和2.5 mL磷酸二氢钾储备溶液再加入试剂水至2,000 mL，混摇均匀后，分装于稀释瓶中，经121℃灭菌15分钟，作为无菌稀释液备用。如欲用于水样稀释，分装之无菌

稀释液灭菌后体积须为90 ± 2.0 mL。4 ± 2 ℃下保存期限为3个月。

六、采样与保存

(一) 盛装水样检验微生物之容器，应使用清洁并经灭菌之玻璃瓶或无菌塑料容器或市售无菌采样袋，且于采

样时应避免受到污染。水样若含有余氯时，无菌容器中应加入适量之无菌硫代硫酸钠（采取加氯之废水时，每100 mL水样中加入0.1 mL、10%硫代硫酸钠可还原15 mg/L余氯。采取含氯之饮用水水样时，每100 mL之水样如加入0.1 mL之3%硫代硫酸钠，可中和之余氯量约为5 mg / L。）。

(二) 采样前应清洁手部，再行采水样，所采水样应具有代表性。

(三) 运送时水样温度应维持在小于10 ℃且不得冻结，而实验室内保存温度应维持在4 ± 2 ℃。

(四) 水样应于采样后24小时内完成推定实验之水样添加步骤（七、步骤(一)４、），并置入培养箱中培养。

(五) 水样量须以能做完所需检验为度，但不得少于120 mL。

七、步骤

试验分两阶段进行。首先进行推定试验，若推定试验结果为阳性反应，则继续进行第二阶段之确定试验，如结果仍是阳性反应则显示有大肠杆菌群存在。各试验步骤如下述：

(一) 推定试验

１、慎选发酵管中没有气泡且未污染之10 mL、2倍浓度LST试管。

２、水样在进行检测或稀释之前必须剧烈摇晃25次以上，以使样品充分混摇均匀。

３、视水样中微生物可能浓度范围进行水样稀释步骤，使用无菌吸管吸取10 mL水样至90 mL无菌稀释液中，形成10倍稀释度水样，混合均匀，而后自10倍稀释度水样以相同操作方式进行一系列适当之100、1000、10000倍等稀释水样，进行稀释步骤时，均需更换无菌稀释吸管，水样稀释步骤如图一所示（注

1）。

４、以无菌吸管分别取各稀释度10 mL水样至内含10 mL 2倍浓度的LST试管中，每一稀释度各作5支，小心混合均匀，混合后发酵管内不可产生气泡。

５、在35 ± 1℃培养箱中培养48 ± 3小时，观察并记录发酵情形，若有气体产生则推定试验为阳性反应，若无气体产生则推定试验为阴性反应，但若培养液呈混浊状态，虽无产气，亦应进行确定试验。

(二) 确定试验

若推定试验之发酵管中有气体或混浊产生时，则使用BGLB进行确定试验：

１、慎选发酵管中没有气泡且未污染之BGLB试管。