碱性单细胞凝胶电泳铺胶技术的改进
D-S电泳跑胶太慢,或带弥散的解决方案
DS电泳太慢和带弥散的改进措施建议改进措施:1.可以适当进一步地拉开浓缩胶和分离胶之间的pH值，比如浓缩胶为pH=6.6，分离胶为pH=8.9。
2.可以考虑加高电泳时，浓缩胶的电压为90-100 V，分离胶的电压到120V-200V，；浓缩胶和分离胶有时候可能都设成150 V也能电泳成功。
3.使用全新配置的缓冲溶液。
4.适当该种胶浓度下使用分离效果明显的Marker。
5.保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解不掉的颗粒就去掉。
6.适当调整聚丙烯酰胺的凝胶浓度。
7. 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。
建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。
忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。
一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
8.样品缓冲溶液用：Tris-HCl缓冲溶液，电泳缓冲溶液用:Tris–Gly缓冲溶液。
9.分离胶的浓度应高于浓缩胶，但是胶浓度高会引起电泳时间变长，电泳时间会引起电泳带弥散。
具体的参考的凝胶浓度参见附录。
控制好电泳时间，别把样品跑出了胶外。
附录：1.样品处理（充分溶解样品）：根据样品分离目的不同，在上样前对样品进行的溶解处理主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
（1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。
一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
（2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。
100μl 样品缓冲液中10μl 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
应用碱性单细胞凝胶电泳技术(SCGE)检测镉致鸡脾淋巴细胞DNA的损伤效应
刀 片 将 平 铺 薄 厚 均 匀 的 胶 片 修 成 ２ ５ｃ ． ｍ× ２５ｃ 的 正 方 形 ， ． ｍ
即 第 １层 胶 。 处 理 后 细 胞 悬 液 ｌ Ｌ， ３ 与 ８ Ｌ用 取 Ｏ 在 ７ Ｃ下 Ｏ
ｂｒ ｅｇ等 ［ 报 道 的 无 电泳 单 细 胞 凝 胶 分 析 技 术 。在 此 基 础 上 ， １
将 １０ Ｌ ９８ Ｌ ０ ． ＭＰ滴 在 第 ２层 胶 上 ， 盖 玻 片使 －ＭＰ均 Ａ ０ 加 Ｌ 匀 平 铺 ， 固化 １ ｎ 即 第 ３层 胶 。 ４ Ｃ下 ０ｍｉ， １３ ２ 细 胞 裂 解 ．． 移 去第 ３ 胶 上 的盖 玻 片 ， 即 将 凝 胶 载 层 立 玻 片浸没于 ４ 冷 的 新 鲜 配 制 的 裂 解 液 中 （． ｌＬ Ｎ — Ｃ预 ２ ５ｍｏ／ ａ
的 鸡 脾 脏 淋 巴 细 胞 ＤＮ 的 损 伤 效 应 。 结 果 表 明 ， 浓度 在 Ｏ ３ ｍｏ／ 范 围 内 ， 着 镉 浓 度 的 增 加 ， 鸡 脾 脏 淋 巴 Ａ 镉 ～ ０￣ ｌＬ 随 对
细 胞 ＤＮＡ 的 损 伤 作 用 逐 渐 增 强 ， 呈现 显著 的剂 量 效 应 （ 一 ０ ９ ３ Ｐ一 ０ ０４ 。 果提 示 ， 致 鸡 脾 脏 淋 巴 细胞 ＤＮ ｒ ．８， ．０ ） 结 镉 Ａ 损伤是镉对禽类免疫毒性的重要机制之一。 关 键 词 ： ； 脾 脏 淋 巴细 胞 ； 细胞 凝 胶 电泳 ； ＮＡ 损 伤 镉 鸡 单 Ｄ
黑龙江 哈尔滨 １００） ５ ０ １
摘 要 ： 用碱 性 单 细 胞 凝 胶 电 泳技 术 （ｉｇｅｃｌｇ ｌ ｌ ｔｏ ｈ ｒｓ ， Ｃ ） 测 了 Ｏ Ｏ／ ｌ ． ２ 体 外培 养 应 ｓ ｌ ｅｌ ｅ ｅ ｃｒｐ ｏｅｉ Ｓ ＧＥ 检 ｎ ｅ ｓ ～３ ￣ ／ Ｃ ＣＩ对 ｍｏ Ｌ ｄ
大学物理化学实验“胶体电泳”的改进研究
大学物理化学实验“胶体电泳”的改进研究作者：韩锡光，李秋艳来源：《大学教育》 2017年第11期［摘要］Fe（OH）3胶体电泳是物理化学电学部分的一个重要实验，本文针对该实验耗时长、电泳实验现象不明显等问题，给出了适当的修改建议，即重新调整实验步骤和时间分配；稍提高渗析温度、延长单次渗析时间、减少渗析次数对胶体进行纯化；改用最后的渗析液作辅助液；选用较粗的电泳U型管和较粗的石墨电极，根据电极距离确定合适的外加电压值，经以上措施，较成功地完成了电泳实验。
［关键词］物理化学实验；胶体电泳；实验改进［中图分类号］Ｇ６４２.0 ［文献标识码］ A ［文章编号］2095-3437（2017）11-0084-03物理化学是从物质的物理现象和化学现象的联系入手，来探求化学变化基本规律的一门科学。
物理化学实验则借用物理和数学的方法来完成化学测试表征任务，是一门多学科交叉的实验科学。
[1]物理化学实验作为一门独立的基础实验课，是学生学习和研究物理化学的重要手段和途径，是物理化学教学的重要组成部分，在物理化学教学中起着举足轻重的作用。
[2]胶体电泳实验是物理化学实验电学部分的一个重要实验，该实验的目的是使学生掌握Fe （OH）3溶胶的制备和纯化方法，掌握电泳法测定胶粒的电泳速度和ζ电位的方法，它对于学生理解胶体的电学性质、电泳情况以及电动电势概念具有重要的意义。
[3]但是现实中，学生在做此实验时成功率不高，主要存在以下问题：（1）实验操作步骤繁琐，胶体制备纯化耗时长，时间分配不合理，学生缺少耐心，经常在实验等待期无所事事。
（2）电泳实验现象不明显，界面不迁移或界面模糊迁，移速度慢。
第二个问题的出现将直接导致实验的失败。
针对以上两个主要问题，各种文献报道中亦有很多改进措施。
高明国等针对Fe（OH）3胶体纯化时间长的问题，利用电渗析法代替传统渗析法来纯化胶体，缩短了纯化时间，节省了蒸馏水。
[4]董家新等将传统火棉胶渗析袋换为硫酸纸半透膜材料，采用热渗析和大接触面积，提高了胶体的渗析效率。
@单细胞凝胶电泳
将混有待测细胞的琼脂糖铺于载玻片上，凝固后浸入冷溶解液中使细胞裂解，在电泳液中解链后水平电泳，洗涤后用DNA 结合荧光染料染色，在荧光显微镜下观察玻片上细胞的荧光图像，评价DNA 的损伤程度。
3.1 形状指标这是一类比较粗略的指标。
根据细胞荧光图像是否象慧星一样头尾分明将其分为慧星一样细胞和非慧星样细胞，计数一定量细胞中慧星样细胞所占的比例，即慧星样细胞发生率，估计DNA 的损伤程度。
这种指标可通过镜下观察直接得到，方便实用。
3.2 距离指标直接在显微镜下或在照片上测出慧星的一些长度数值，如尾长，即沿电泳方向“慧星”尾部最远端与头部中心间接的距离；总慧星长度，即“慧星”电泳方向上的最大长度；尾长与头部直径比值等，以评价DNA损伤程度。
这些指标描述电泳中DNA泳动的距离，易于测量，无需复杂的仪器设备及图像处理软件，而且在损伤因素剂量较大时，这些数值的大小与作用剂量之间有较为良好的线性关系。
3.3 强度指标Ostling等人最初用SCGE 技术检测射线对DNA损伤时用“慧星”头部中心处荧光强度与电泳方向上一定距离处荧光强度的比值来描述DNA 的损伤。
PoI1er 等人用“慧星”尾部总荧光强度同“慧星”头部总荧光强度的比值来表示DNA 的损伤程度。
新近有报道根据“ 星”尾部荧光强度将细胞分为五类，由弱到强分别计为0、1、2、3、4，将100 个细胞的分值加在一起表示DNA 的损伤程度，并证明该数值与总慧星长度有较好的相关性。
这些指标都不同程度地反映了电泳中泳动DNA 的量。
3.4 “矩”类指标为反映DNA 损伤，上述距离类指标和强度类指标均不全面，有实验证明损伤因素作用剂量增大时，DNA 损伤程度明显增加而尾长基本不变。
为将二者结合起来，更全面反映DNA 损伤程度，Olive 等人于1990 年首次描述了“尾矩”（tail moment ，TM ）的概念，定义为尾部DNA 占总DNA 的百分比与头、尾部中心间距的乘积。
单细胞凝胶电泳技术在临床兽医学中的应用
否具 有基 因毒性 的最佳 方 法［ 。本 文就 该技 术 的原 此 ， 过测 定 核 Ｄ ６ ］ 通 ＮＡ 迁 移 部分 的光 密 度或 迁 移 长
维普资讯
动物 医学 进展 。０ ７ ２ （ ２ ：７８ ２ ０ ，８ １ ） ７ —Ｏ
Ｐｒ ｇ ｅ ｓｉ ｔ ｒｎ ｒ ｅ ｉｉ ｅ ｏ ｒ ｓ ｎ Ｖｅ ｅ ｉ ａ ｙ Ｍ ｄ ｃｎ
单 细胞 凝胶 电泳 技术 在 临床 兽 医学 中的 应 用
． 琼 脂糖凝胶将 细胞包 埋 在 载 玻 片 上 ， 细 胞 裂解 液 ２ １ 细 胞 处 理 在
作用下 ， 细胞 膜 、 核膜 及 其 他 生 物 膜 破 坏 ， 细胞 内 使
的Ｒ ＮＡ、 白质 及其 他 成 分 进 入 凝 胶 ， 而 扩 散 到 蛋 继 裂解液 中 ， 独核 Ｄ 惟 ＮＡ 仍 保 持 缠 绕 的环 区 （ ｏ ｐ Ｌ ｏ） 附着在剩余 的核 骨架上 ， 留在原 位 。 并
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
善的一种在 单细胞 水 平 上检 测 ＤＮＡ 损 伤 与修 复 的
时断 片 向阳极 迁 移 ， 成 荧 光 拖 尾 现象 ， 似 彗星 。 形 形
方法 。因其 细胞 电泳 形 状 颇 似 彗 星 ， 又称 慧 星试 验 如果在 碱性 电泳 液 （ Ｈ＞ １ ） ， ｐ ３ 中 先是 ＤＮ 双链 解 Ａ 单链 断 裂 的碎 片 分 子量 小 即 （ｏ ｔａｓｙ 。 它 是 一 种 测 定 和 研 究 单 个 细 胞 螺旋且 碱变性 为 单 链 ， ｃｍｅ ｓａ ） Ｄ ＮＡ链 断裂 的新 电泳 技 术 ， 与传 统 方 法 相 比， 简 其
单细胞凝胶电泳试剂盒（彗星实验）说明书
单细胞凝胶电泳试剂盒（彗星实验）使用说明书一 单细胞凝胶电泳实验介绍单细胞凝胶电泳( Single Cell Gel Electrophoresis, SCGE) 又名彗星试验(comet assay)， 1984 年起用于检测的真核细胞的DNA 断裂和修复，具有方法灵敏、快速优点，同时既可以定性又可以定量，目前DNA 损伤检测的其他方法（Giemsa 染色法,TUNUL 法、DNA 电泳梯度法、流式细胞检测法）是无法比拟的。
彗星实验是检测DNA 微损伤和修复的新方法，得到国际遗传毒性检测程序工作会议认可。
彗星实验是简单、快捷检测DNA 微损伤的方法，被广泛应用于遗传毒理、放射生物学、生物监测、癌症化疗和细胞凋亡、衰老等领域。
是一个十分成熟的技术，逐渐成为快速检测DNA损伤的一种方法，尤其应用于新药开发、保健品开发、化妆品开发、环境监测和毒理学研究等领域。
彗星实验具有以下优点：1 适用范围广，不仅适用于静止状态的细胞，且对T 和B 淋巴细胞敏感；2 所需实验器材较少，一台荧光显微镜和一套电泳装置即可完成彗星实验；3 实验流程短，一天可完成一个实验流程，且图像获取和数据分析可隔日完成；4 安全性好，避免了同位素的使用；5 在单细胞水平上对DNA 损伤进行可视性检测；6 准确性好、灵敏度高；7 属于新技术，客观实际，国际遗传毒性学术委员会认可。
二、试剂盒组成（见试剂盒内）三、试剂使用说明（见试剂盒内）四、操作步骤1.各种细胞用冰冷的PBS 洗一次，离心收集，用PBS 重悬，密度为1×104-5个/ml。
2.铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS 配制。
3.第1 层凝胶的制备：将加热熔解的正常熔点琼脂糖(NMA)，冷至45-60℃，取适量铺于载玻片CometSlide上，再置4℃下10min 使NMA 凝固。
也可以先铺胶，晾干后无尘存放，1周内使用（据经验，此法较优）。
4.第2 层凝胶的制备：低熔点琼脂糖LMA在60-70℃水浴加热至少20min 使之完全溶化，冷至37℃（可以放置于细胞培养箱中或水浴箱冷却至37℃，低熔点琼脂糖LMA在37℃可维持3小时）。
凝胶电泳实验中的关键步骤与优化策略
凝胶电泳实验中的关键步骤与优化策略凝胶电泳是一种常用的生物分析技术，广泛应用于DNA、RNA和蛋白质等生物大分子的分离和检测。
在凝胶电泳实验中，关键步骤的正确操作和优化策略的选择对实验结果的准确性和可重复性起着至关重要的作用。
首先，凝胶制备是凝胶电泳实验中的第一步，也是至关重要的一步。
凝胶的选择和制备条件直接影响到分离效果和分辨率。
常用的凝胶有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
琼脂糖凝胶适用于较大分子量的核酸和蛋白质分离，而聚丙烯酰胺凝胶适用于较小分子量的核酸和蛋白质分离。
在制备凝胶时，需要控制好凝胶浓度、聚合物交联程度和凝胶孔径大小，以达到最佳的分离效果。
其次，样品处理是凝胶电泳实验中的另一个关键步骤。
样品的处理包括DNA 或蛋白质的提取、纯化和浓缩等过程。
对于DNA样品，可以通过酚/氯仿提取或商用提取试剂盒进行提取。
对于蛋白质样品，可以通过离心、超滤或电泳浓缩等方法进行浓缩。
样品处理的关键是要避免污染和损失，确保样品的完整性和稳定性。
然后，样品加载是凝胶电泳实验中的重要步骤之一。
样品加载的目的是将样品均匀地加载到凝胶孔中，以便进行分离和检测。
在加载样品时，应该控制好样品的体积和浓度，避免过多或过少的样品导致分离效果不佳。
此外，还可以使用DNA 或蛋白质标记物来确定加载位置和分子量。
最后，电泳条件的选择和优化是凝胶电泳实验中的关键策略。
电泳条件包括电泳缓冲液的选择、电场强度的控制和电泳时间的设定等。
电泳缓冲液的选择应根据实验需要来确定，常用的缓冲液有TAE缓冲液和TBE缓冲液。
电场强度的控制要根据样品的大小和分离要求来确定，一般情况下，较大分子量的样品需要较低的电场强度，而较小分子量的样品需要较高的电场强度。
电泳时间的设定要根据实验目的和样品的分离情况来确定，一般情况下，电泳时间越长，分离效果越好。
综上所述，凝胶电泳实验中的关键步骤包括凝胶制备、样品处理、样品加载和电泳条件的选择和优化。
正确操作这些步骤并选择合适的优化策略，可以提高实验结果的准确性和可重复性，从而为生物学研究和临床诊断提供可靠的数据支持。
凝胶电泳与蛋白质印迹技术实验方法的改进和探索
凝胶电泳与蛋白质印迹技术实验方法的改进和探索
廖志银;霍朝霞;翁登坡;赵鲁杭;于晓虹
【期刊名称】《现代盐化工》
【年(卷),期】2022(49)6
【摘要】凝胶电泳与蛋白质印迹技术是生命医学研究领域的常用技术,但因此项技术步骤较多、操作复杂,学生在实验过程中出现的问题较多,结果不稳定,重复性差。
为使学生能熟练且稳定地掌握该技术,对十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白质印迹技术进行了长期的实践和探索,通过改进凝胶各成分配比方案,不断完善和优化实验条件,有效增强了凝胶配制的时效性,大大提高了凝胶电泳后续实验的稳定性和成功率。
通过优化蛋白印迹过程中抗体的使用浓度,印记杂交结果目标蛋白质条带更加清晰可见,易分析,重复性好。
【总页数】4页(P22-25)
【作者】廖志银;霍朝霞;翁登坡;赵鲁杭;于晓虹
【作者单位】浙江大学医学院基础医学实验教学中心
【正文语种】中文
【中图分类】G63
【相关文献】
1.蛋白质凝胶电泳及染色方法的几点改进
2.黒腹果蝇黑条体突变型蛋白质组分析中二维凝胶电泳技术的改进
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4.应用聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹技术分析弓形虫蛋白质与抗原的研究
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3复旦大学985项目基金资助碱性单细胞凝胶电泳铺胶技术的改进3高建军 丰盛梅 金慰芳(复旦大学放射医学研究所骨代谢研究室上海 200032)
【摘要】 目的 聚苯乙烯孔槽单层铺胶技术在碱性单细胞凝胶电泳中的可行性研究。方法 自制聚苯乙烯孔槽的载胶片,将1%低熔点凝胶与淋巴细胞混合后单层铺胶,经6Gyγ射线照射后进行碱性单细胞凝胶电泳,观察胶面和淋巴细胞的DNA损伤情况。结果 载胶片孔槽单层灌胶后胶面平整,操作过程无脱落;淋巴细胞DNA电泳图像清晰,6Gy照射产生的“彗星”形态特征明显。结论 采用聚苯乙烯孔槽进行单层铺胶的技术,可以克服碱性单细胞凝胶电泳中的胶板脱落等问题。【关键词】 碱性单细胞凝胶电泳; 聚苯乙烯孔槽; 琼脂糖; γ射线照射【中国图书馆分类法分类号】 R811.5
ImprovementofGelPreparationonAlkaliSingleCellGelElectrophoresisGAOJian2jun,FENGSheng2mei,JINWei2fang(BoneMetabolismDepartment,InstituteofRadiationMedicine,FudanUniversity,Shanghai200032,China)
【Abstract】 Purpose Todeterminethepossibilityofthemono2layergelonploystyrenepondsusedinalkali
singlecellgelelectrophoresis(ASCGE). Methods Thecarriedslicewaspreparedwiththecoveroftis2sue2cultureplate.Themono2layergelplatesweremadebyfillingthepolystyrenepondswith1%LMAem2beddedlymphocytesandexposedto6Gyγraysirradiation,thenanalysiswereperformedbycometassayinalkalinesolution. Results Thegelsurfacewassmoothandglossyandtherewasnogeldepartureordriftintheoperateprocess.TheDNAimageswereclearandthecometmorphologicalcharacterwasshowedobvi2ouslyinthecellsexposedto6Gyγraysirradiation. Conclusions Themono2layergelonpolystyrenepondscanavoidthegeldepartureanddriftinASCGE.【Keywords】 alkalisinglecellgelelectrophoresis; polystyrenepond; agarose; γraysirradiation
碱性单细胞凝胶电泳(alkalinesinglecellgelelectrophoresis,ASCGE)技术,是单细胞凝胶电泳,又称彗星分析技术(cometassay)中的一种技术,可于单细胞水平快速灵敏检测DNA单链断裂而得到广泛应用。但其制胶步骤多、时间长,胶板易损坏和胶落的问题没有很好解决,给该技术的规范和推广带来一定困难。因此,我们尝试采用聚苯乙烯孔槽进行铺胶,简化操作步骤。材料和方法载胶片准备 取96孔细胞培养板(NUNC)盖,用美工刀裁成25mm×68mm大小载胶片(共16孔)若干,蒸馏水冲洗,置清洁处晾干。铺胶 取淋巴细胞悬液(肝素抗凝,淋巴细胞分离液分离,锥虫蓝排斥试验存活率大于95%),PBS稀释为4×10
4
/mL后与1%低熔点凝胶(LMA,
SIGMA)按体积1∶3混合,平铺在预温的载胶片孔槽内(18μL/孔),即转移至4℃暗盒。照射 将铺胶的载胶片置4℃湿盒内于137Cs放
射源(剂量率为0.9Gy/min,GammaCell40)接受单次6Gy照射。对照组带入准备室,不受照。裂解、解旋和电泳 将受照后的载胶片小心浸入裂解液(2.5mol/LNaCl,100mmol/LNa
2
2ED2
TA,100mmol/LTirs,pH10;临用前加入1%Tri2tonX-100和10%DMSO)于4℃暗盒进行细胞裂解1h20min。经0.4mol/LTris缓冲液漂洗后浸入电泳液(30mmol/LNaOH,1mmol/LNa
2
2ED2
TA,pH13)于4℃暗盒进行DNA双链解旋20min,电泳(18V,70mA)30min。阅片 经0.4mol/LTris缓冲液中和后,在胶
113
复旦学报(医学版)
FudanUnivJMedSci2004May,31(3)上滴加溴化乙锭(EB,15μg/mL),每孔约5μL,于4℃暗盒染色10min。用滤纸吸去载胶片上过多液体后,置荧光显微镜下观察和图像采集(NikonDXM1200)。结 果载胶片上单层灌胶后产生的凝胶胶面平整,操作结束无胶落(图1)。DNA分子经EB染色后,在紫外线照射下呈红色。对照组DNA分子聚集在细胞核,电泳图像清晰,而6Gy照射后产生的DNA碎片经电泳扩散形成“彗星尾”状影像,形态特征明显(图2)。图1 聚苯乙烯孔槽上的凝胶胶面Fig1 Photographsofpolystyrenepondswithgel图2 碱性单细胞凝胶电泳Fig2 TypicalimagesofalkalisinglecellgelelectrophoresisA:Untreatedhumanbloodlymphocytes;B:Humanbloodlymphocytesexposedto6Gyofγrays 讨 论ASCGE技术自Singh等[1]建立以来,被广泛应用于电离辐射、紫外线和氧化以及化学药物引起的DNA损伤检测,其操作规范已引起广泛重视[2]。近年来尽管已在制胶等各方面进行不断改进[3,4],如由传统的磨毛载玻片上铺3层凝胶的“夹心法”改进为2层或单层灌胶法,但胶板易损坏和胶落的问题仍没有得到很好解决,并且操作步骤多、时间长,给该技术的规范和推广带来一定困难。实验失败的原因主要包括盖玻片揭取或推移时对凝胶板造成的撕裂或移动,强碱对玻璃表面的侵蚀作用和电泳过程产生的温度升高等,使胶与玻璃表面贴附不稳定,使之在随后的浸入或取出操作时脱落或漂浮。碱与玻璃的反应产物可能也是胶中颗粒性杂质的主要来源。因此选择在碱性溶液中稳定的材料,避免盖玻片推移和减低电泳时温度等是必要的。为此,我们根据聚苯乙烯材料性质稳定的特点,
用96孔培养板盖来裁制载胶片,利用孔凸边形成的圆形凹槽进行单层铺胶,基本克服以上缺点。胶片大小可根据需要来定,一般接近载玻片大小易于观察操作,如25mm×68mm或35mm×68mm大小,可有2或3列共16或24孔供分组选用,其中两端各1行不灌胶,更于夹取和标记。铺胶时将37℃保温的1%LMA凝胶按3∶1比例加入细胞悬液,轻轻打匀后平铺入孔内,每孔灌胶15～20μL,可形成直径9mm厚约0.2～0.3mm的0.75%胶板,一般灌胶18
μ
L形成的胶面较平整,载胶片预温有利于
胶板牢固贴附。我们采用该聚苯乙烯孔槽单层铺胶的制胶方法缩短了铺胶过程,制成的胶面平整,在随后的裂解、电泳和中和等操作过程中无脱落。观察时减少了杂质干扰,DNA电泳图像清晰。6Gy照射产生的“彗星”形态特征清楚典型,与传统方法一致[5,6]。同时铺制的胶板大小一致,裂解、电泳和中和等操作的条件相同,单片上分组选择多,从而提高了各组数据的可比性,尤其适合普查等多样品分析使用。
参 考 文 献1 SinghNP,MccoyMT,TiceRR,etal.Asimpletechniqueforquan2titationoflowlevelsofDNAdamageinindividualcells.ExpCell
Res,1988,175:1842 HartmannA,AgurellE,BeeversC,etal.Recommendationsforcon2ductingtheinvivoalkalineCometassay.4thInternationalCometAssayWorkshop.Mutagenesis,2003,18(1):453 张遵真,衡正昌,李蕊,等.单细胞凝胶电泳试验的最适条件研究.卫生毒理学杂志,1998,12(4):249
4 张建平,田源,陈道达.单细胞凝胶电泳制胶方法的改进.癌变畸变突变,1998,10(3):189
5 OlivePL,FrazerG,BanathJP.Radiation2inducedapoptosismeasuredinTK6humanBlymphoblastcellsusingthecometassay.Radiat
Res,1993,136:1306 张军宁,洪承皎,朱寿彭.单细胞凝胶电泳检测外照射诱导DNA单链断裂和双链断裂.辐射研究与辐射工艺学报,2002,20(3):
220
(收稿日期:2003-09-16)(编辑:张秀峰)
213复旦学报(医学版) 2004年5月,31(3)