单细胞凝胶电泳技术
有关中性单细胞凝胶电泳的总结要点
1、辐射生物剂量：此法适于照后短期内的剂量评价，中性条件优于碱性条件；旁观效应：查阅了许多国外文献，尚无此方法观察旁观效应的研究报道，所以我采用此方法观察了1Gy照后的旁观效应，试验今天上午刚刚结束，结果待分析，粗略看，此法对于旁观效应还是很敏感的，此法的优势在于成本低，操作比较简单。
低剂量照射的适应性反映：本实验室的一个相关课题刚刚结提，论文在法医学与特种医学版的军事医学子版已有上传，感兴趣的可以去看。
凋亡细胞的观察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮，用CASP软件分析后，其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。
我的一些教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低，否则，凋亡细胞中的DNA片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。
注：我用的是中性条件，20V，200mA,20min, 凋亡细胞观察宜选用10V,100mA,10min。
2、中性单细胞凝胶电泳步骤：（以淋巴细胞为例）1) 淋巴细胞的提取①取各组荷瘤鼠外周血0.2ml,肝素抗凝,加入到等体积淋巴细胞分离液上,3500r/min离心4min。
②取中间层淋巴细胞并加入PBS至5 ml, 1500r/min离心8min。
③重复洗涤细胞两次。
2) 琼脂糖玻片的制备①制好微型电泳槽。
②使用两层凝胶法,第一层为100μl 0.75%正常熔点琼脂糖凝胶, 第二层为75μl 0.75%低熔点琼脂糖凝胶和25μl淋巴细胞的混合液。
3) 细胞裂解、电泳①好的玻片浸入新配的预冷的(4ºC)中性裂解液中裂解1.5h。
②取出玻片,用双蒸水浸没漂洗。
③将玻片置于0.5%电泳液中先解旋20分钟，然后电泳20min,电压20V，电流200毫安。
4) 染色用溴化乙啶(2μg/ml)染色。
用双蒸水冲去多余染液，滤纸洗去多余水分。
5)读片和分析①用荧光显微镜(激发波长515-560nm)观察玻片,每张胶随机抓取100个慧星图像并用数码相机拍照后输入计算机储存。
单细胞凝胶电泳技术应用进展
又被称为“ 彗星电泳” ］ 细胞的生物膜在细胞裂解液的作用下被破坏， ［． ７ 使细胞内的 Ｄ Ａ 蛋白质及其 Ｎ 、 他成分进入凝胶， 继而扩散到裂解液中， 惟有核 Ｄ Ａ仍 附着在剩余的核骨架上而 留在原位 ． Ｎ 如果细胞 未受损伤， 电泳中核 Ｄ Ａ停留在核基质中， Ｎ 经荧光染色后呈现 圆形 的荧光团， 无拖尾现象 ． 若细胞受
到损伤， 在碱性电泳液（Ｈ＞１） Ｄ Ａ双链解螺旋且碱变性为单链， ｐ ３ 中， Ｎ 单链断裂的碎片离开核 Ｄ Ａ向 Ｎ 阳极迁移， 形成拖尾 ． 细胞核 Ｄ Ａ受损伤越严重， Ｎ 产生的断链或碱变性碎片就越多， 片断也越小， 电泳 表现为彗星尾越长和彗尾越亮［ ． ８ 通过荧光显微镜观察有无彗星及彗尾的长度、 】 亮度、 出尾率等， 判断
以研究活细胞 Ｄ Ａ的损伤， Ｎ 还可以研究死细胞的 Ｄ Ａ损伤， Ｎ 从而避免了只能用活细胞 （ 如染色体畸 变、 微核、 姐妹染色单体互换等） 的限制， 因而其对于建立动物模型深入探讨运动性氧应激与 Ｄ Ａ损伤 Ｎ 的分子生物学机制仍不失为一种优越的研究方法 ． 同时，Ｃ Ｅ技术也将为运动性疾病和运动性疲劳的早期诊断提供更有效 的实验方法和手段 ． ＳＧ 在 使用单细胞凝胶电泳技术在运动医学中的应用得 出结论 ：Ｃ Ｅ技术 由于需样品量少， Ｄ Ａ损伤检 ＳＧ 对 Ｎ 出的灵敏性高， 无需同位素标记， 技术简单、 费用低， 能够快速、 准确检测有害物质存在场所中各类人群 的 Ｄ Ａ损伤及筛检对 Ｄ Ａ损伤因素敏感的高危人群 ． Ｎ Ｎ
速、 低耗 等优 点 ， 因此被 广泛应 用在 Ｄ ＮＡ的损 伤与 修复 、 传 毒理 、 境监 测 以及氧 化 应 激和 细胞 凋亡 遗 环
等研 究中［１ ６．
１ 单细胞凝胶电泳技术原理
单细胞凝胶电泳技术在环境毒理学实验教学中的应用
由 于 碱 性 电 泳 液 腐 蚀 性 极 高 （ Ｈ＞ ３ ． 记 号 ｐ １ ）用
本 次 改 良 ， 最 常 用 的还 是 碱 性 Ｓ 但 ＣＧＥ 方 法 。 年 来 ， 笔 等 工 具 标 记 组 别 又 极 易 脱 落 。 课 题 组 成 员 研 究 近 若 Ｓ ＧＥ 技 术 也 逐 步 推 广 到 真 核 单 细 胞 微 生 物 和 植 发 现 ． 用 解 剖 针 等 锋 利 工 具 在 玻 片 的 磨 砂 端 或 非 Ｃ 如 ． ２ 物 细 胞 核 ＤＮＡ 损 伤 的 研 究 ｆ 调 然 而 ． 于 植 物 细 磨 砂 玻 片 的 手 持 端 刻 下 处 理 组 组 别 ， Ａ一１ Ａ一 … １ ｏ 由
Ｄ ＮＡ 损 伤 检 测 方 法 相 比 ， 有 简 便 、 速 、 敏 、 具 快 灵 样
和 动 物 细 胞 核 ＤＮＡ 损 伤 和 修 复 的 研 究 ｐ 虽 经 多
． 品 量 少 、 需 放 射 性 标 记 等 优 点 ， 广 泛 ， 用 于 人 １２ 栽 玻 片 的 编 号 无 已 应
１ ８ 年 ， ｔｎ ９４ Ｏｓｌ ｇ等 Ⅲ 次 提 出 了 单 细 胞 凝 胶 电 点 琼 脂 糖 （Ｏ ｉ 首 １ Ｏ ｍＬ 比 较 适 宜 １ 加 热 完 全 溶 解 后 置 于 ．
泳 （ｉｇｅ ｃ ｉ ｇ ｌｅｅ ｔ ｐ ｏｅ ｉ， ＣＧ 技 术 ， 利 ５ － ０Ｃ 浴 锅 中 恒 温 保 存 。 手 持 预 冷 后 的 载 玻 片 ｓｎ ｌ ｅｌ ｅ ｌｃｒ ｈ ｒｓｓ Ｓ Ｅ） ｏ 并 ０ ６ ｏ水
编 号 、 胞 核 的 分 离 、 埋 、 旋 、 泳 、 和 、 水 、 色 、 像 及 其 结 果 的 软 件 分 析 等 过 程 。 并 应 用 该 方 细 包 解 电 中 脱 染 摄
凋亡细胞单细胞凝胶电泳结果 -回复
凋亡细胞单细胞凝胶电泳结果-回复什么是细胞凝胶电泳？细胞凝胶电泳是一种常用的生物物理实验技术，用于分离和检测DNA和RNA的大小、形状和电荷。
凝胶电泳通过将DNA或RNA分子放置在电泳凝胶中，并施加电场，使分子按照大小和电荷移动，从而分离这些分子。
细胞凝胶电泳则是将细胞以其整体形态进行电泳分析。
凋亡细胞单细胞凝胶电泳是一种特殊的细胞凝胶电泳技术。
凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，与细胞自我消亡的生理活动相关。
在这种电泳实验中，我们将关注凋亡细胞的特征和分子差异。
实验步骤：第一步：样本准备首先，我们需要收集含有凋亡细胞的样品。
这些样品可以是从细胞培养基中恢复的细胞，也可以是从生物组织中提取的细胞。
确保样品含有足够数量的凋亡细胞，以便能够得到可靠的结果。
第二步：制备细胞凝胶接下来，我们需要制备细胞凝胶。
通常使用琼脂糖凝胶，如琼脂糖-磷酸盐凝胶。
根据实验需求，还可以添加DNA标记物或染料，以便更好地观察凋亡细胞。
第三步：细胞孵育将样品中的凋亡细胞混合到凝胶中，并进行细胞孵育。
在适宜的环境条件下，凋亡细胞会进一步分解和分离，使得分析结果更加准确。
第四步：电泳在孵育过程结束后，将凝胶放置于电泳槽中，并施加电场。
通常选择连续电场或脉冲电场来实现凋亡细胞的分离。
电场可以使凋亡细胞根据大小和电荷向阳极或阴极移动。
第五步：分析结果根据凋亡细胞在凝胶中的移动情况，可以分析并评估这些细胞的大小和电荷差异。
通过测量移动距离和形成的能带图案，我们可以定量地描述凋亡细胞群体的特征。
这些特征可以帮助我们了解凋亡过程中的细胞变化及其相关的生物学特性。
实验应用：凋亡细胞单细胞凝胶电泳在细胞生物学和医学研究中具有广泛应用。
通过观察凋亡细胞的大小、形状和电荷变化，我们可以了解细胞死亡过程中发生的分子事件，并研究其与疾病和病理过程之间的关系。
这项技术有助于揭示细胞凋亡的机制、筛选和评估新型药物，以及检测病理样本中的细胞凋亡情况。
总结：凋亡细胞单细胞凝胶电泳是一种用于分析凋亡细胞特征和分子差异的重要技术。
单细胞凝胶电泳技术在临床兽医学中的应用
否具 有基 因毒性 的最佳 方 法［ 。本 文就 该技 术 的原 此 ， 过测 定 核 Ｄ ６ ］ 通 ＮＡ 迁 移 部分 的光 密 度或 迁 移 长
维普资讯
动物 医学 进展 。０ ７ ２ （ ２ ：７８ ２ ０ ，８ １ ） ７ —Ｏ
Ｐｒ ｇ ｅ ｓｉ ｔ ｒｎ ｒ ｅ ｉｉ ｅ ｏ ｒ ｓ ｎ Ｖｅ ｅ ｉ ａ ｙ Ｍ ｄ ｃｎ
单 细胞 凝胶 电泳 技术 在 临床 兽 医学 中的 应 用
． 琼 脂糖凝胶将 细胞包 埋 在 载 玻 片 上 ， 细 胞 裂解 液 ２ １ 细 胞 处 理 在
作用下 ， 细胞 膜 、 核膜 及 其 他 生 物 膜 破 坏 ， 细胞 内 使
的Ｒ ＮＡ、 白质 及其 他 成 分 进 入 凝 胶 ， 而 扩 散 到 蛋 继 裂解液 中 ， 独核 Ｄ 惟 ＮＡ 仍 保 持 缠 绕 的环 区 （ ｏ ｐ Ｌ ｏ） 附着在剩余 的核 骨架上 ， 留在原 位 。 并
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
善的一种在 单细胞 水 平 上检 测 ＤＮＡ 损 伤 与修 复 的
时断 片 向阳极 迁 移 ， 成 荧 光 拖 尾 现象 ， 似 彗星 。 形 形
方法 。因其 细胞 电泳 形 状 颇 似 彗 星 ， 又称 慧 星试 验 如果在 碱性 电泳 液 （ Ｈ＞ １ ） ， ｐ ３ 中 先是 ＤＮ 双链 解 Ａ 单链 断 裂 的碎 片 分 子量 小 即 （ｏ ｔａｓｙ 。 它 是 一 种 测 定 和 研 究 单 个 细 胞 螺旋且 碱变性 为 单 链 ， ｃｍｅ ｓａ ） Ｄ ＮＡ链 断裂 的新 电泳 技 术 ， 与传 统 方 法 相 比， 简 其
单细胞凝胶电泳试验
单细胞凝胶电泳试验（一）原理单细胞凝胶电泳试验（single cell gel electrophoresis，SCGE）是近年来经过不断完善逐步发展起来的一种快速检测单细胞水平DNA损伤的新技术。
有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，SCGE 分析技术是先用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液的作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分外泄到凝胶中，随后扩散到细胞裂解液中，但核DNA仍保持缠绕的环区附着在剩余的核骨架上，并留在原位。
如果细胞未受损伤，电泳时，核DNA因其分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。
若细胞受损，在中性电泳液（pH=8.0）中，核DNA仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。
只有当DNA双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。
如果在碱性电泳液（pH>13）中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎片离开核DNA向阳性迁移，形成拖尾。
细胞DNA受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量也就越多，迁移的距离越长，表现为尾长的增加和尾部荧光强度的增强。
因此，通过测定DNA 迁移部分的光密度或迁移长度可定量地测定单个细胞的DNA损伤程度。
（二）仪器1．全磨砂载玻片2．1号盖玻片3．微量吸管和吸头4．冰盒5．电泳仪6．荧光显微镜（三）试剂1．正常熔点及低熔点琼脂糖。
EDTA，10mmol/L Tris-HCl，1％2．细胞裂解液：2.5mol/L NaCl，100mmol/L Na2肌氨酸钠，用NaOH调 pH值到10。
用前加1％Triton X-100和10％DMSO。
3．碱性电泳液：1mmol/L NaEDTA，300mmol/L NaOH 调pH到13。
单细胞凝胶电泳技术在DNA损伤和细胞凋亡检测中的应用
关键词 ： Ｎ Ｄ Ａ损伤；细胞凋亡 ；单细胞凝胶 电泳 ；丝裂霉素；卡铂 ； ５一氟尿嘧 啶 中图分类号 ： ２ ５ Ｑ ３ Ｑ ５ ： ３ 文献标志码 ： Ａ
单 细胞凝 胶 电泳 （ｉｇｅｃｌｇｌ ｌ ｔｐ ｏｅｉ， ｓ ｌ ｅ ｅ ｅ ｃ ｏｈｒｓ ｎ ｌ ｅ ｒ ｓ ＳＧ ） Ｃ Ｅ 又称 为 彗 星 电 泳 （ｏ ｔ ｓａ） 是 一种 在 单 ｃｍｅ ａｓｙ ， 细胞水 平上 检测 真核 细胞 Ｄ Ａ损 伤 的方法 ． 据单 Ｎ 根 细胞在 凝胶 电泳 时 “ 彗星 ” 出现 的 多少 ， 尾 的荧 光 彗
量浓度 （ １ 用于本实验． 表 ）
１２２ 细胞 处 理 与 细胞 悬 液制 备 ． ． Ｈｌ ｅ ａ细胞 传代 培养至 约 ５ ％汇合后 ， ０ 分别用表 １中不 同质量浓度 的
抗肿瘤 药 物处 理 ２ ， ０ ２ ％胰 蛋 白酶 消 化 １— ４ｈ 经 ．５ ２ｍｉ ， 复 吹打 收集 细 胞 悬液 ， ２５ ０ｒｍ ｎ ｎ后 反 以 ０ ｉ离 ／
脱离 细胞 核 的“ 星” ， 此 可将 凋 亡 细胞 与正 常 彗 状 据 细胞 区分 开 ｊ ．
１２ １ 药物 质 量 浓度 设 计 根 据 前 期 实 验 （ 发 ． ． 未
表 资料 ） 确定 丝 裂霉 素 Ｃ、 ５一氟 尿 嘧 啶 和卡 铂 的 质
本 实 验 用 肿 瘤 治 疗 中常 用 化 疗 药 物 丝 裂 霉 素
文章 编 号 ： ００— ４ ３ ２ １ ） ３一 １３—０ １０ ５ ６ （０ １０ Ｏ １ ５
单 细胞 凝 胶 电泳 技 术 用
蔡 丽敏 ， 雪峰 李
（ 华南师范大学生命科学学 院， 广东广州 ５ ０ ３ ） １６ １
单细胞凝胶电泳技术
单细胞凝胶电泳技术的试验步骤试剂及材料：1）0.01M PBS pH7.3：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.3，最后加蒸馏水定容至1L即可。
保存存于室温或4℃冰箱中。
2）0.8%正常熔点凝胶（PBS配制）3）0.6％低熔点凝胶（PBS配制）4）毛玻璃片5）盖玻片6）碱性裂解液（2.5mol/L NaCl;100mmol/L Na2EDTA;10mmol/L Tris;1%肌氨酸钠），临用前加10％DNMSO，1％Triton X-1007）电泳缓冲液（1mmol/L Na2EDTA;300mmol/L NaOH；Tris.Cl，pH7.5）8）EB（2ug/ml）步骤：1.制备第一层胶：100ml 0.8％正常熔点胶，加盖盖玻片，4℃固化10min；2.制备第二层胶：轻轻地去除盖玻片，在第一层胶上滴加75ul含1×10000个细胞的0.6％低熔点胶（cell 与凝胶比例为1：5），加盖盖玻片，4℃固化10min；3.裂解：去掉盖玻片，将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液内（临用前加10％DMAO，1％Triton X-100），4℃裂解1h；4.取出玻片，用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内，加入pH13的电泳缓冲液（没过玻片2-3min），放置20min（黑闭）。
5.电泳：电压20V，300mA，30min6.取出玻片，用PBS或Tris.Cl，pH7.5漂洗3次，每次3min；或双蒸水漂洗2次，每次5～15min，7.染色：胶上滴加3ulEB，加盖盖玻片，24h检测。
或者4℃，潮湿，闭光的条件下保有胶片，观察时再染色，镜检。
1.2.5 改良彗星试验操作步骤为节省实验时间，本研究将铺三层胶法改为铺一层胶法，同时在中和及染色等步骤进行了改良，具体操作如下:将已染毒的淋巴细胞悬液与40℃的1%低溶点琼脂糖等浓度混匀后，取70μl混合液直接滴加在磨毛玻片上，加盖玻片，4℃冷凝，20min后揭盖片;4℃于碱性裂解液中裂解1h;解旋20min;4℃电泳（25V，300mA）30min;中和5min;加碘化丙啶，暗处染色10min，加盖片;于莹光显微镜下镜检，照像。
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单细胞凝胶电泳技术的试验步骤试剂及材料：1）0.01M PBS pH7.3：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.3，最后加蒸馏水定容至1L即可。
保存存于室温或4℃冰箱中。
2）0.8%正常熔点凝胶（PBS配制）3）0.6％低熔点凝胶（PBS配制）4）毛玻璃片5）盖玻片6）碱性裂解液（2.5mol/L NaCl;100mmol/L Na2EDTA;10mmol/L Tris;1%肌氨酸钠），临用前加10％DNMSO，1％Triton X-1007）电泳缓冲液（1mmol/L Na2EDTA;300mmol/L NaOH；Tris.Cl，pH7.5）8）EB（2ug/ml）步骤：1.制备第一层胶：100ml 0.8％正常熔点胶，加盖盖玻片，4℃固化10min；2.制备第二层胶：轻轻地去除盖玻片，在第一层胶上滴加75ul含1×10000个细胞的0.6％低熔点胶（cell 与凝胶比例为1：5），加盖盖玻片，4℃固化10min；3.裂解：去掉盖玻片，将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液内（临用前加10％DMAO，1％Triton X-100），4℃裂解1h；4.取出玻片，用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内，加入pH13的电泳缓冲液（没过玻片2-3min），放置20min（黑闭）。
5.电泳：电压20V，300mA，30min6.取出玻片，用PBS或Tris.Cl，pH7.5漂洗3次，每次3min；或双蒸水漂洗2次，每次5～15min，7.染色：胶上滴加3ulEB，加盖盖玻片，24h检测。
或者4℃，潮湿，闭光的条件下保有胶片，观察时再染色，镜检。
1.2.5 改良彗星试验操作步骤为节省实验时间，本研究将铺三层胶法改为铺一层胶法，同时在中和及染色等步骤进行了改良，具体操作如下:将已染毒的淋巴细胞悬液与40℃的1%低溶点琼脂糖等浓度混匀后，取70μl混合液直接滴加在磨毛玻片上，加盖玻片，4℃冷凝，20min后揭盖片;4℃于碱性裂解液中裂解1h;解旋20min;4℃电泳（25V，300mA）30min;中和5min;加碘化丙啶，暗处染色10min，加盖片;于莹光显微镜下镜检，照像。
四、操作步骤1. 各种细胞用冰冷的PBS 洗一次，离心收集，用PBS重悬，密度为1×104-5 个/ml。
2. 铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS 配制。
3. 第1 层凝胶的制备：将加热熔解的正常熔点琼脂糖(NMA)，冷至45-60℃，取适量铺于载玻片CometSlide上，再置4℃下10min 使NMA 凝固。
也可以先铺胶，晾干后无尘存放，1周内使用（据经验，此法较优）。
4. 第2 层凝胶的制备：低熔点琼脂糖LMA在60-70℃水浴加热至少20min 使之完全溶化，冷至37℃（可以放置于细胞培养箱中或水浴箱冷却至37℃，低熔点琼脂糖LMA在37℃可维持3小时）。
将20μL 细胞（约104个）和75μL的LMA 混合均匀。
然后，迅速将适量含细胞的LMA 滴到第1 层琼脂糖上，立即盖上另一干净盖玻片，置4℃10min 使第2 层LMA 凝固。
注意，使用盖玻片的目的是使琼脂糖平整显微镜下方便观察，经验丰富者，可以不用，也可以达到好效果。
5. 第3 层凝胶的铺制：:第2 层LMA 凝固后，在室温下小心移去盖玻片，重复第二层的步骤。
（此步可以不作，一般铺一层细胞就足够）6. 细胞裂解：移去盖玻片，将玻片置于平皿中，轻轻加入预冷的新鲜配置的细胞裂解混合液（配制见试剂使用说明的1，2）。
4℃下裂解1-3h。
取出载玻片用蒸馏水漂洗2次，要求动作轻柔，以免琼脂糖脱落。
7. DNA 碱解旋：将载玻片置于水平电泳槽。
倒入新配制的电泳缓冲液约覆过载玻片胶面0.25cm 左右，室温放置20min，以便使DNA 在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段，使DNA 断链在电场中易于迁移。
8. 细胞电泳：电压15-25V，电压、电流可用改变缓冲液面高低来调节，电泳时间为10-20min。
建议预实验，摸索最佳的电压、电流及时间。
9. 电泳后将载玻片置于平皿内。
加入蒸馏水，漂洗2次，每次5min，弃去蒸馏水，每载玻片加2-3滴染色剂，盖上盖玻片（也可以不盖上），避光染色10min。
盖上盖玻片的目的是可以隔日分析，或便于操作。
10. 观察、拍照和分析：荧光显微镜515-560nm （绿光）波长的激发光，可清楚地观察到核DNA 和迁移的DNA(即慧星尾)。
色泽和图像十分精美，每个样本随机选择20-100 个细胞，图片保存后，用相应的软件分析结果。
单细胞凝胶电泳（彗星实验）操作步骤1. 各种细胞用冰冷的PBS 洗1～2次，离心收集，用PBS 0.3 ml 重悬，密度为1×105-6个/ml。
2. 铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS 配制。
3. 第1层凝胶的制备：用微波炉加热溶解正常熔点琼脂糖(NMA)，再冷至45～60℃，取适量（100μL～1ml）铺于载玻片上，立即盖上干净盖玻片，再置4℃下至少30min 使NMA 凝固。
也可以先铺胶，晾干后无尘存放，1周内使用。
4. 第2层凝胶的制备: 低熔点琼脂糖LMA在微波炉中加热使之完全溶化，冷至37℃（可以放置于细胞培养箱中或水浴箱冷却至37℃，低熔点琼脂糖LMA在37℃可维持3小时）。
移去盖玻片，将20μL 细胞悬液和75μL的LMA 混合均匀,然后，迅速将适量含细胞的LMA 滴到第1 层琼脂糖上，立即盖上干净盖玻片，置4℃30min 使第2 层LMA 凝固。
注意，使用盖玻片的目的是使琼脂糖平整，显微镜下方便观察。
5. 细胞裂解：移去盖玻片，将载玻片置于平皿中，轻轻加入预冷的新鲜配置的细胞裂解混合液(PH 10.0)。
4℃下裂解1～3h或过夜。
取出载玻片用蒸馏水漂洗2次，要求动作轻柔，以免琼脂糖脱落。
6. DNA 碱解旋：将载玻片置于水平电泳槽正极端，并列放置，不留空隙。
倒入新配制的电泳缓冲液约覆过载玻片胶面0.25cm 左右，室温放置20～40min，以便使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段，使DNA 断链在电场中易于迁移。
7. 细胞电泳：稳压25V，稳流300ｍＡ，电压、电流可用改变缓冲液面高低来调节，电泳时间为20～30min。
8. 电泳后将载玻片置于平皿内，缓缓沿壁加入0.4mmol/L Tris-HCl (pH7.5) 缓冲液或双蒸水，漂洗2次，每次5～15min，弃去Tris-HCl或双蒸水，使用PBS洗干净，并用滤纸吸干水分。
（再缓缓加入无水乙醇将凝胶浸埋脱水10 min ～1h之后, 吸去乙醇, 自然凉干或室温下过夜。
）9．染色：每张载玻片加2～3滴染色剂（常用30μg/μl 溴化乙锭溶液染色），盖上盖玻片（也可以不盖上），避光染色20min。
染色时应戴手套。
盖上盖玻片的目的是可以隔日分析，或便于操作。
10. 观察、拍照和分析：荧光显微镜515～560nm （绿光）波长的激发光，可清楚地观察到核DNA和迁移的DNA(即慧星尾)。
色泽和图像十分精美，每个样本随机选择20～100 个细胞，图片保存后，用相应的软件分析结果。
影响因素1．琼脂糖凝胶薄板的制备：该实验需要制备两层琼脂糖凝胶薄板，应注意琼脂糖的浓度、制备时间和温度。
第1层是紧贴冰冻玻片砂面的1%正常凝点(42±2)℃的琼脂糖凝胶，吸取85μl制成面积为18 mm×18 mm，厚度为0.25 mm的凝胶。
然后置4℃存放约20分钟，如时间过短，不能得到“老化”的凝胶与玻片粘合不紧,容易在液体浸泡处理和电泳过程中自然脱落，造成实验失败；反之，如果放置时间过长，凝胶极易干裂而脱落。
第2层凝胶是1%低凝点(26±2)℃琼脂糖液，与细胞混合时琼脂糖液的温度30～37℃，温度过高可引起细胞损伤，此操作过程力求快速，以免加速细胞DNA 的修复。
2．细胞数和实验温度的影响：（1）实验细胞数应调至约3.0×105，如果细胞数过低，一张片子中细胞数太少，很难完成100个彗星计数分析；反之细胞数过高，片中细胞过密，位于不同层面的细胞相互重叠，难以分析彗星DNA损伤。
(2)实验温度的控制。
样品应置4℃环境下进行，以抑制或降低核酸内切酶等活性，阻止DNA损伤的修复，从而达到准确地检测DNA初级损伤。
已有研究表明一些细胞DNA断裂损伤能在1小时内达到90%的修复，3小时达到97%［2］，因此，应严格控制细胞在分析过程中的温度。
3.碱化处理及电泳的条件:凝胶内的细胞需在碱性(pH值10)环境下进行处理，其作用一是去除细胞蛋白质，使DNA暴露出来；其次是碱化处理使DNA紧密螺旋结构解旋，DNA损伤片断及其极性端暴露出来［3］。
电泳条件：电压或电流过大，严重受损伤的细胞可能出现的拖尾过长，彗星消失而影响结果，其次是正常的细胞可能因电压或电流过大而形成少许拖尾的假阳性结果。
反之，电压或电流过小，受损伤的细胞不会出现拖尾，而出现假阴性结果。
电泳的电压多选用低电压，一般在18～50 v，在电泳过程中电泳液的温度应不超过15℃(应在4℃条件下进行)，电泳时间多在20～40分钟。
4.荧光染色及彗星图象分析：(1) 采用DAPI荧光剂染色，质量浓度在1～5 μg/ml，用量为10μl。
染色15分钟后即可观察，视野中明亮荧光的“彗星”被光照时间一般不易超过2分钟，以免荧光剂快速衰退而不宜继续观察和拍照。
(2) 彗星的图像分析主要靠肉眼显微镜读片，对DNA损伤程度标准的正确判断是非常重要的。
不同程度损伤可根据彗星的尾部与其头部的比率大小分为0、1、2、3、4五个等级。
0级无拖尾表明无损伤，当DNA损伤程度由轻到重，则彗星的尾部逐渐变长变大，头部逐渐变小荧光强度逐渐变弱。
用肉眼观察判断的分级需要通过计算机彗星图象分析加以确定，目前已有彗星电脑分析软件可供使用，如Komet3.0等［4］。
总之，严格控制SCGE的各种影响因素，使其真正成为一种可靠、易于掌握和有效的DNA断裂损伤和修复检测的新技术［5］。