单细胞凝胶电泳试验
单细胞凝胶电泳试验
（一）原理
单细胞凝胶电泳试验（single cell gel electrophoresis，SCGE）是近年来经过不断完善逐步发展起来的一种快速检测单细胞水平DNA损伤的新技术。
有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，SCGE 分析技术是先用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液的作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分外泄到凝胶中，随后扩散到细胞裂解液中，但核DNA仍保持缠绕的环区附着在剩余的核骨架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳时，核DNA因其分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。若细胞受损，在中性电泳液（pH=8.0）中，核DNA仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有当DNA双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。如果在碱性电泳液（pH>13）中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎片离开核DNA向阳性迁移，形成拖尾。细胞DNA受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量也就越多，迁移的距离越长，表现为尾长的增加和尾部荧光强度的增强。因此，通过测定DNA 迁移部分的光密度或迁移长度可定量地测定单个细胞的DNA损伤程度。
（二）仪器
1．全磨砂载玻片
2．1号盖玻片
3．微量吸管和吸头
4．冰盒
5．电泳仪
6．荧光显微镜
（三）试剂
1．正常熔点及低熔点琼脂糖。
EDTA，10mmol/L Tris-HCl，1％2．细胞裂解液：2.5mol/L NaCl，100mmol/L Na
2
肌氨酸钠，用NaOH调 pH值到10。用前加1％Triton X-100和10％DMSO。
3．碱性电泳液：1mmol/L Na
EDTA，300mmol/L NaOH 调pH到13。
2
4．0.4mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH=7.5）。
5．荧光染料：2.5μg/ml的溴乙锭，也可用8.5μg/ml的吖啶橙或2.5μg/ml的碘丙锭等。
（四）方法
1.制备细胞悬液
单细胞来自人、动物(小鼠、大鼠、狗、鱼、鸡等)和植物的组织或培养的细胞系，或从活体组织分离出的原代细胞等。动物体内测试可以根据靶器官适当选择有针对性的原代细胞进行测试。选择合适的培养基和缓冲液，分离纯化制成单细胞悬液，用台盼蓝法测定细胞存活率>95%，细胞密度为(1～5)×105/mL 备用。
2. 凝胶制片
为了加强凝胶对玻片的附着力，在载玻片上先铺一基底层：在磨砂面上滴加45℃水浴后的0.5％～1.0％正常熔点琼脂糖50 μl。然后再铺胶2层。第1层：取密度为3×105/ml的细胞悬液，以体积比为1：9的比例与预热到37℃的0.5％低熔点琼脂糖混匀，取50μl加到第1层胶上，铺匀凝固；第2层：以0.5％低熔点琼脂糖覆盖中层细胞，这样制成细胞“三明治”。
3.细胞裂解
将细胞“三明治”载玻片浸入新配制的预冷4℃的裂解液中，保持4℃1-2 h。
4.DNA解旋
细胞裂解后，将载玻片置于水平电泳槽内，用新配制的碱性电泳液盖过胶面约2～3mm，加盖避光，置于4℃20～40min。使DNA充分解旋。碱性条件下（pH>13）可使DNA 展开、解旋为单链，碱性易变性区段(ALS) 变为单链断片( SSB) 。5.电泳
DNA解旋结束后，通电电泳。电泳条件为25V和300mA，电泳10～30min。或按0.7～0.9V/cm确定电压。最适条件实验者可自行选择。最好能使阴性对照有部分细胞出现短拖尾，以保证试验有足够的敏感性并减少实验室间差异。
6.中和与染色
电泳后取出载玻片，在0.4mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH=7.5）中浸没15 min 或漂洗3次，每次5min。每张胶板上滴加20～100μl荧光染色剂，后用蒸馏水洗涤。以上各步骤应在黄或红光下操作。中和后的凝胶片应在24h内染色，以免DNA过多
扩散。否则应将之浸入无水乙醇或无水甲醇中脱水5min左右，或在室温中晾干。对于干燥的凝胶片，使用中性缓冲的甲醛处理数分钟，将有利于长期保存。
7.结果观察
结果观察有肉眼观察测量和图像分析两种方式。在荧光显微镜下，观察单细胞电泳图像(放大200～400倍)，每片记数25～50个细胞，每个剂量组检查100个细胞。无DNA损伤的细胞表现为一圆形荧光细胞核。DNA受损的细胞所产生的DNA断片游动移出细胞核之外，向阳极伸延而形成“慧头”带“慧尾”的慧星现象。
镜下观察时，首先应记录出现拖尾的细胞数，计算拖尾细胞率。同时用目镜测量拖尾细胞的尾长，统计各试验（剂量）组的平均尾长。尾长是指DNA断片从其主核向电泳正极迁移的距离，而不同的实验室尾长测定方法有所不同。但并不妨碍将各剂量组平均尾长与阴性对照组进行比较。
图象分析需有相应的设备和专门的分析软件。使用电脑逐个对细胞进行图像分析。应用图像分析系统可得到更多的分析参数。目前主要观察指标有尾长（tail length）、慧尾DNA的百分含量、尾距（tail moment）、尾块(tail local)和尾惯量（tail inertia）等。尾长(tail length)即DNA 迁移的长度，在低损伤剂量范围内与DNA 损伤呈线性关系；尾矩是尾长与慧尾DNA百分含量之乘积，在高损伤剂量下与损伤程度呈线性关系；尾块(tail local)即彗星尾部分散的大小不一的DNA 断片组成，与损伤程度有关；尾惯量是与每个尾块的面积、平均荧光强度、在X 轴上与彗核中心距离有关的综合性指标。目前通常选用DNA 迁移细胞率、尾长、尾矩作为检测指标。
目前，国外彗星电脑分析软件主要有英国Kinetic Imaging 公司的KOMET 、美国LAI公司的LAI Comet Analysis System(LACAS)、德国Zeiss 公司的KS400分析系统、捷克LIM公司的Lucia彗星图像分析系统等，这些软件能定量测定尾部长度、尾部面积、尾部力矩、尾部力矩臂、尾部力矩惯性、细胞密集程度、尾部的DNA百分比、碎片等。但这些软件均需与其相应的仪器设备配套使用，价格十分昂贵。国内也正在开发一些分析系统。
除了昂贵的商业软件外，也有一些免费的彗星分析软件。如Helma 等所设计的分析软件(Sicion Image) 能测量彗星强度、尾长、头面积、尾面积、尾部DNA 含量、尾矩等多项参数。Konca 等在Helma的基础上研制了另一软件(CASP)，
该软件可在多种硬件及软件平台上运行，所测量的彗星参数中增加了Olive 尾矩，而且用户界面更友好。这2 个免费软件的一个特点是，它们的源代码是公开的，人们可以看到每一个彗星参数的运算方法和编写程序。因此，软件使用者可以根据实验目的的不同来改变这些参数的运算方法和计算程序，从而建立一个新的测量遗传损伤的参数。这些源代码文件很简单，可以自行改写，以便使之适用于分析要求，如计算Ames 试验菌落数以及电泳凝胶的分析等。Helma2000年建立了免费下载系统，其网址为：https://www.360docs.net/doc/966213995.html,/nih-image/ 和http://mailbox.univie.ac.at/christoph.helma/comet。近年来使用较多的国外免费分析软件见以下网址：
https://www.360docs.net/doc/966213995.html,/project/showfiles.php；
https://www.360docs.net/doc/966213995.html,/index.htm。随着彗星试验的发展，在资源共享的网络空间里，会有更完善更方便的彗星分析软件出现。
（五）注意事项
虽然SCGE 具有简便、快速等特点，但在整个实验过程中可能会受到诸多因素的影响而难以得到理想的实验结果。下面是几点注意事项。
1.单细胞悬浮液的制备：最好将细胞数目调至约3.0×105个/ml。如果细胞数目过高，位于凝胶不同层面的细胞可能会发生相互重叠，难以对其结果进行分析；如果细胞数目过低，则很难对实验结果进行统计学分析。
2.制片：目前制片的方法主要有三种:“三明治”凝胶、双层凝胶和单层凝胶。制片总的原则是: 获得牢固稳定凝胶的同时，避免额外DNA的损伤与修复。
3.电泳条件：SCGE 一般选用低电压和短时间。电压过高、电泳时间过长虽然能够提高检测的灵敏度，但也会使正常的细胞形成拖尾而出现假阳性结果；反之，电压过低、电泳时间过短，受损细胞不会形成拖尾而出现假阴性结果。
4.实验条件：整个实验过程需在低温(约4℃) 和暗光下进行，避免额外DNA 的损伤和修复，防止假阳性和假阴性结果的产生。
5.与凋亡细胞DNA断片的区分：由于试验剂量过大或细胞保存不当及某些不适的试验条件的影响，会出现细胞坏死和凋亡，坏死和凋亡细胞会产生大量DNA 断片，也会在电泳以后出现拖尾。由于它们与常见DNA断裂剂诱导的DNA损伤在形成机制、生物学和毒理学上的意义迥然不同，应对它们进行区分，排除对实验结果的干扰。在碱性彗星试验中，凋亡细胞与普通DNA链断裂损伤细胞的差异主
要是：①在彗星形态上，凋亡细胞的DNA断片彗星头很小，头长不超过5μm，仅由核内不能裂解的与蛋白质框架相连的DNA片段组成，亮度高，慧尾近似椭圆形，纵径与横径的比值小，彗星头与慧尾之间往往有一分离带。而普通DNA链断裂，彗星头直径一般都大于10μm，尾纵径明显大于横径，同时彗星头与慧尾之间没有明显界限，因为一部分慧尾是由单个链断端的延伸形成，它的另一端仍与主核相连。②无论在低剂量组还是在高剂量组，凋亡细胞的DNA断片形态基本一致，尾长也基本相同，其剂量-反应关系表现为凋亡指数增加，而不是尾长增加。而DNA链断裂损伤的剂量-反应关系表现为彗星尾长的增加。
（沈孝兵，浦跃朴）
有关中性单细胞凝胶电泳的总结要点
1、辐射生物剂量：此法适于照后短期内的剂量评价，中性条件优于碱性条件； 旁观效应：查阅了许多国外文献，尚无此方法观察旁观效应的研究报道，所以我采用此方法观察了1Gy照后的旁观效应，试验今天上午刚刚结束，结果待分析，粗略看，此法对于旁观效应还是很敏感的，此法的优势在于成本低，操作比较简单。 低剂量照射的适应性反映：本实验室的一个相关课题刚刚结提，论文在法医学与特种医学版的军事医学子版已有上传，感兴趣的可以去看。 凋亡细胞的观察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮，用CASP软件分析后，其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。我的一些教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低，否则，凋亡细胞中的DNA片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。 注：我用的是中性条件，20V，200mA,20min, 凋亡细胞观察宜选用10V,100mA,10min。 2、中性单细胞凝胶电泳步骤：（以淋巴细胞为例） 1) 淋巴细胞的提取 ①取各组荷瘤鼠外周血0.2ml,肝素抗凝,加入到等体积淋巴细胞分离液上,3500r/min离心4min。 ②取中间层淋巴细胞并加入PBS至5 ml, 1500r/min离心8min。 ③重复洗涤细胞两次。 2) 琼脂糖玻片的制备 ①制好微型电泳槽。 ②使用两层凝胶法,第一层为100μl 0.75%正常熔点琼脂糖凝胶, 第二层为75μl 0.75%低熔点琼脂糖凝胶和25μl淋巴细胞的混合液。 3) 细胞裂解、电泳 ①好的玻片浸入新配的预冷的(4oC)中性裂解液中裂解1.5h。 ②取出玻片,用双蒸水浸没漂洗。 ③将玻片置于0.5%电泳液中先解旋20分钟，然后电泳20min,电压20V，电流200毫安。 4) 染色 用溴化乙啶(2μg/ml)染色。 用双蒸水冲去多余染液，滤纸洗去多余水分。 5)读片和分析 ①用荧光显微镜(激发波长515-560nm)观察玻片,每张胶随机抓 取100个慧星图像并用数码相机拍照后输入计算机储存。 ②用CASP软件分析系统分析慧星图像。 3、biomed96 ：lq6688你好，本人也正要做这个实验，预实验做了两次，但什么都没看到，也不知道是什么问题，望指教。 铺3层胶，第一层100ul1％regular胶，50度烤干，第二层50000个细胞100ul0.5％低熔点胶，第三层100ul 0.5％低熔点胶。 裂解液：EDTA 100mM Nacl 2.5M Tris(10mM)pH10 1%TritonX-100 裂解1小时 解旋液：EDTA1mM NaoH 300mM Ph>13 孵育20分钟。电泳40分钟。 染色：PI 50ug/ml染色15分钟。 结果是什么都看不到，好像一点都没染色。 lq6688：首先，此试验的生物学原理目前还不是很清楚，Sighn和Olive这两个单细胞凝胶电泳的鼻祖首先提出的中性和碱性条件，中性条件检测双链断裂，而碱性条件检测单链断裂，有人曾提出这是为什么，我查阅了大量文献，国外文献没有具体的说明，国内文献更是人云亦云，所以，目前只能按照大家比较默认的：中性－－双链，碱性－－单链，这不是用软件来区分的，而是你的试验条件决定的，我看了您的裂解
实验二 琼脂糖凝胶电泳实验知识交流
实验二琼脂糖凝胶电 泳实验
实验二琼脂糖凝胶电泳实验 【实验目的】 （1）学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理； （2）掌握使用水平式电泳仪的方法； （3）学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。 【实验原理】 琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为 pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定： （1）DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。 （2）DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。 （3）电源电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。
彗星试验步骤
彗星试验步骤 1.5.4 彗星试验（单细胞凝胶电泳试验）：参照文献[i]，略加改动，进行碱性单细胞凝胶电泳，具体如下。 1.5.4.1 制片 将0.6%的NMPA（用PBS配制）于微波炉中加热融化后，浸泡磨砂玻片，用吸水纸将玻片滑面及四周吸干，自然晾干备用。 1.5.4.2 铺胶 取1.5.3中所备细胞悬液10μl，向其中加入70μl 37℃0.7%LMPA（用PBS配制），混匀后迅速滴于37℃预热的玻片上，立即盖上盖玻片，4℃固化10min。 1.5.4.3 裂解 轻轻取下盖玻片，将玻片浸于新鲜配制并预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解1h。 1.5.4.4 解旋 从裂解液中取出载玻片，用PBS浸泡玻片3×3min。用纸巾吸去玻片上残留的液体，置于水平电泳槽中，加新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm 以上，避光解旋30min。 1.5.4.5 电泳 电压25V，调整液面高度使电流达到300mA，电泳25min。 1.5.4.6 漂洗及染色 电泳完毕，取出玻片，用PBS浸泡2×15min，以中和强碱。用纸巾吸去玻片上残留的液体，然后滴加20μg/ml的EB20μl，盖上盖玻片，立即置荧光显微镜下观察。 以上步骤尽量在黄光下或暗处进行，避免其他原因所致的DNA损伤。每一剂量水平制片2张。 1.5.4.7 结果观察 荧光显微镜下200倍观察，激发波长515~560nm，发射波长590nm。每一剂量水平随机观察100个细胞，记录拖尾细胞数。计算拖尾细胞率（以下简称拖尾率），拖尾率＝(拖尾细胞数/100)×100%。每一剂量水平用目镜测微尺测量30个拖尾细胞的全长和头长，拖尾细胞尾长（以下简称尾长，tail length，TL）＝全
单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA
单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA1 陆彩玲，郭松超，鲁力，陈维平，邝晓聪 广西医科大学公共卫生学院，广西南宁（530021） E-mail：lcling78@https://www.360docs.net/doc/966213995.html, 摘要：目的建立体外染锰细胞模型，探讨锰神经毒性的作用机制。方法：以原代培养的成熟皮层神经元为靶，据本室前期试验结果确定低中高不同浓度的锰液（分别为0.2mmol/L,0.6mmol/L,1.0mmol/L），与神经细胞共孵育。显微镜观察各组神经细胞形态学的变化，用单细胞凝胶电泳试验（SCGE）检测神经细胞的DNA损伤，以彗星细胞尾长及彗星样细胞百分率为评价损伤的指标。结果：光镜下可见不同浓度锰孵育后神经细胞形态学发生改变，单细胞凝胶电泳试验显示神经细胞DNA出现不同程度的损伤，彗星尾长及彗星样细胞百分率较对照组明显增加（P＜0.01）。尤以高浓度锰组损伤组严重，显著高于中低浓度组（P＜0.01）。结论：锰不但能引起体外培养的神经细胞外在的形态学损伤，还可导致神经细胞DNA的损伤。 关键词：锰，单细胞凝胶电泳 (SCGE)，DNA损伤 目前，随着生产工艺的改进和预防措施的加强，严重的职业性锰中毒已很少发生，但长期低剂量的锰暴露依然存在，并对接触者的潜在影响仍不可低估。慢性锰中毒是进行性的、不可逆的病变，并且锰对接触者的危害正由临床型向亚临床型转变，因而更为敏感、特异的效应指标，以早期筛检出亚临床中毒者及高危人群，是今后锰神经毒性研究中重点解决的问题。 DNA损伤是遗传毒理学的一个重要研究领域，长期不可逆转的DNA损伤累积可诱导细胞突变、畸变。单细胞凝胶电泳(Singl cells gel eletrophoresis,SCGE)又称彗星试验（comet assay），由Ostling等（1984）首创，后经Singh等（1988）进一步完善并逐渐发展起来的一种快速检测单细胞 DNA损伤的实验方法，适用于多种细胞，广泛应用于检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面，具有经济、简捷、灵敏等优点，日益广泛地应用在各种诱变剂的遗传毒性检测上。鉴于此，本研究以此法检测染锰后对神经细胞遗传物质的影响，探讨锰神经毒性的机制，为锰中毒的防治提供研究基础。 1. 材料与方法 1.1 试剂 MnCl2·4H2O(购自上海生化试剂公司, AR级), Dulbcco's Modifed Eagle 培基(DMEM,高糖)及新生小牛血清购自Gibco公司(美国)，L-谷氨酰胺与多聚赖氨酸 (PL YS)购自生物工程产品公司（上海）.低熔点凝胶(LMPA)及正常熔点凝胶(NMPA)、TritonX-100、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、Tris-HCl、溴乙锭(EB) 购自Sigma 公司（美国）其他所有试剂都达试验用的分析纯级 1.2 皮层神经元的原代培养 制备原代皮层神经元方法参照方法所述[1]. 取新生24小时内Wistar 乳大鼠，消毒后冰层上剥离大脑皮层，解剖显微镜下剔除血管、脑膜及海马组织后转入盛D-Hank’s液的玻璃瓶，机械法分离神经细胞。200um稠布筛网过滤神经细胞悬液，滤后悬液800转/分离心5 1本课题得到国家自然科学基金资助项目（项目批准号：30260095）的资助。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳 脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。电泳结果通常是条带图谱。该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。通过分型可以鉴定比较菌株是否一致，对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA分子经凝胶的分子筛作用负极移向正极。而PFGE采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随着电
场的变化而改变。正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA得以分离。图l是根据Carle和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1 field gel electrophoresis，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。A、B代表两个交替开启和关闭的电场。当A电场开启时，B电场关闭，DNA分子从A电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B电场开启时，DNA分子改变原来的运行方向，随B电场负极向正极移动。这样，随着电场方向的交替变化DNA分子图1 PGE的原理(OFAGE系统) A、B代表两电场即呈“Z” 字形向前移动。目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。如果电场方向改变DNA分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA分子必须相应地变化移动方向。可以想象，较小的分子能相当快
琼脂糖凝胶电泳标准操作流程
琼脂糖凝胶电泳操作标准流程 一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本铜人阵学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，此关为能力考核，通关成功后，代表具备操作琼脂糖电泳的能力。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA 影响核酸分子泳动率的因素主要还是：1、DNA分子大小；2、琼脂糖浓度； 3、DNA构想； 4、所用的电压； 5、琼脂糖种类； 6、电泳缓冲液 核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物时，出现不同的效应。254nm的紫外线照射时，灵敏度最高，但对DNA损伤严重；360nm紫外线照射时，虽然灵敏度较低，但对DNA损伤小，所以适合
对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高，且对DNA 损伤不是很大，所以也比较适用。 三、材料、试剂及器具 1、材料 不同大小的基因组片段； 2、试剂 Hind III digest DNA Marker（分子量标准）(TaKaRa)；D2000(TianGen)；BIOWESTAGAROSE（西班牙琼脂糖）；加样缓冲液（6x）：溴酚黄；电泳缓冲液（1×TAE）；溴化乙锭（EB）； 3、仪器及器具 （1）移液器、吸头、锥形瓶 （2）电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、托盘、胶托、梳子等。 （3）紫外透射仪、微波炉、电子天平 四、操作步骤 1.器具清洗：首先将配胶、电泳、染胶所需要的器具清洗干净，包括托盘、胶托、梳子、电泳槽、染胶盘（EB污染，需独立清洗）。清洗流程为：先用自来水冲洗三次，然后用纯水冲洗三次，最后用纸巾或医用纱布擦干。若需对电泳产物进行胶回收，则还需用75%酒精对器具进行消毒。 2.配胶：根据基因组片段大小，配置相应浓度的琼脂糖凝胶。首先将锥形瓶洗干净并加入少量纯水煮沸，然后量取一定量的电泳缓冲液（1×TAE）至锥形瓶中，再称取相应量的BIOWESTAGAROSE（西班牙琼脂糖）倒入锥形瓶中，摇匀并
毒性试验整理
实验一发光细菌的急性毒性评价试验 一、实验器材 1.菌株 明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum） 2.培养基 酵母膏0.5%，胰蛋白胨或多聚蛋白胨（Polypetone）0.5%，甘油0.3%，NaCl 3%，Na2HPO4 0.5%, KH2PO4 0.1%，pH6.5。固体培养基再加琼脂2%。 3.溶液、试剂及待测物质 酵母粉，蛋白胨，NaCl（AR），Na2HPO4（AR），KH2PO4（AR），甘油（AR），二甲基亚砜（AR），乙酸乙酯（AR），HCl（1M），去离子水。 4.仪器及其他用品 生物毒性测试仪；电热恒温鼓风干燥箱；振荡培养箱；DELTA 320pH计；氮吹仪；镊子，移液枪，三角锥形瓶等。 二、目的要求 1.学习了解发光细菌的急性毒性评价试验的基本原理。 2.掌握发光细菌的急性毒性评价试验的操作要领和评价方法。 三、基本原理 发光细菌是指在正常的生理条件下能够发射肉眼可见的蓝绿色荧光的细菌，这种可见荧光波长在450-490 nm之间，在黑暗处肉眼可见。不同种类发光细菌的发光机理是相同的，都是由特异性的荧光酶(LE)，还原性的黄素(FMNH2)，八碳以上长链脂肪醛(RCHO)，氧分子(O2)所参与的复杂反应，大致历程如下： FMNH2+LE→FMNH2·LE+O2→LE·FMNH2·O2+RCH→LE·FMNH2·O2·RCHO→LE+FMN+ H2O+RCOOH+光 具体来说，生物发光反应由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为 407-409 nm处的蓝绿光。 发光细菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响。发光细菌含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要素，在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。当细胞活性升高，处于积极分裂状态时，其ATP含量高，发光强度增强。发光细菌在毒物作用下，细胞活性下降，ATP含量水平下降，导致发光细菌发光强度的降低。实验显示，毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系，因而，可以根据发光细菌发光强度判断毒物毒性大小，用发光度表征毒物所在环境的急性毒性。
双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法
ISS N 100727626 C N 1123870ΠQ 中国生物化学与分子生物学报 Chinese Journal of Biochemistry and M olecular Biology 2005年10月 21(5):691～694 ?技术与方法? 双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法 翁 瑜1),2), 曾群力2),3), 姜 槐2), 许正平2),3)3 (1)浙江大学生命科学学院;2)浙江大学医学院浙江省生物电磁学重点研究实验室;3)浙江大学医学院环境基因组学研究中心,杭州 310031) 摘要 组织(或细胞)的蛋白质提取效率直接影响蛋白质双向凝胶电泳(22DE)的分辨率.为探索建立适用于人乳腺癌细胞株MCF27蛋白质提取的最佳条件,比较目前在双向凝胶电泳中常用的3种蛋白质提取方法对MCF27细胞总蛋白的提取效率.MCF27细胞经培养后,分别采用M2PER试剂、标准裂解液或含硫脲裂解液提取其总蛋白质,然后进行双向凝胶电泳,并根据凝胶上蛋白质斑点的丰度和分布特点判断所得双向电泳图谱的质量,以确定MCF27细胞蛋白质提取的相对最佳方法.结果显示,M2PER试剂法得到的图谱分辨率较低,蛋白质主要集中分布在分子量15～70kD,pH417～613的范围内;标准裂解液法得到的图谱分辨率有所提高,蛋白质分布比M2PER试剂法得到的图谱广;硫脲裂解液法得到的图谱是三者中分辨率最高的,尤其是高丰度蛋白和高分子量蛋白分离效果比前两者好.结果表明,在3种常用的蛋白质提取方法中,硫脲裂解液对细胞蛋白质的溶解性最佳,相对更适合于提取MCF27细胞的蛋白质,并与双向凝胶电泳条件更兼容. 关键词 蛋白质提取,双向凝胶电泳,MCF27,条件优化 中图分类号 Q503 Comparison of Three Protein Extraction Methods by Tw o2 Dimensional E lectrophoresis WE NG Y u1),2),ZE NG Qun2Li2),3),J I ANG Huai2),X U Zheng2Ping2),3)3 (1)College o f Life Sciences,2)Bioelectromagnetics Laboratory,3)Research Center for Environmental G enomics, Zhejiang Univer sity School o f Medicine,Hangzhou 310031,China) Abstract Protein extraction from tissue or cells is a key step to achieve high2res olution protein separation in tw o dimensional electrophoresis(22DE).Three routine cellular total protein extraction methods were com pared in order to determine an optimal one for human breast cancer cell line MCF27.The cultured MCF27cells were lysed by M2PER kit,standard lysis buffer or im proved lysis buffer,respectively.Then the extracted total proteins were subjected to22DE,and the best extraction method was determined by the indexes of protein distribution and abundance on corresponding silver2stained gel.Data showed that use of M2PER kit gave the lowest res olution,in which m ost proteins were distributed in the pI ranging from417to613with m olecular weight between15kD and70kD.Standard lysis bu ffer im proved protein res olution with broader protein distribution pattern.Im proved lysis bu ffer generated the best res olution am ong these three methods,especially for the high2abundance and high m olecular weight proteins.Based on above results,we concluded that the im proved lysis bu ffer has the best protein s olubilization ability,which renders it much m ore suitable for cellular protein extraction from MCF27,and is m ore com patible with the conditions of22DE. K ey w ords protein extraction,tw o dimensional electrophoresis,MCF27,optimization 收稿日期:2004212203,接收日期:2005203221 国家自然科学基金项目(N o.50137030,30170792),浙江省自然科学基金项目(N o.301524)和浙江省卫生厅重点项目(N o.2004Z D006)资助 3联系人 T el:0571287217386,Fax:0571287217410,E2mail:zpxu@https://www.360docs.net/doc/966213995.html, Received:December3,2004;Accepted:M arch21,2005 Supported by National Natural Science F oundation of China(N o.50137030,30170792),and Natural Science F oundation of Zhejiang Province(N o.301524),and K ey Program of Health Bureau of Zhejiang Province(N o.2004Z D006) 3C orresponding author T el:0571287217386,Fax:0571287217410,E2mail:zpxu@https://www.360docs.net/doc/966213995.html,
RNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和步骤
RNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和步骤 关键词：RNA琼脂糖电泳2012-03-09 00:00 来源：互联网点击次数：38148 一、实验目的 掌握植物总RNA非变性胶电泳的原理和方法。 二、实验原理 RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。
三、实验材料、器具及药品 蘑菇的总RNA溶液。电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5μg/ml溴化乙锭（EB）10X载样缓冲液。 四、实验步骤 （1）用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。 （2）在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。在实验台上再加入5μl 1×TAE电泳缓冲液及1μl 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。 （3）打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min 后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。
RNA的变性琼脂糖凝胶检测 试剂： （1）MOPS缓冲液（10*）:0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS）(Ph7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。 （2）上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。（3）甲醛。 （4）去离子甲酰胺。v电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——0.1%DEPC水冲洗。 操作：
单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用
陕西师范大学 硕士学位论文 单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用 姓名：罗明志 申请学位级别：硕士 专业：动物学 指导教师：齐浩 20050501
单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用 罗明志 摘要单细胞凝胶电泳（ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｓｉｓ，ＳＣＧＥ），又称彗星实验（ｃｏｍｅｔａｓｓａｙ），是一种在单细胞水平进行ＤＮＡ损伤的检测方法，具有简便、灵敏、快捷、样品用量小等优点，广泛用于遗传毒性检测、环境毒性检测、分子流行病学和ＤＮＡ损伤与修复等研究领域。 我们在本实验室建立了单细胞凝胶电泳技术，并对部分操作流程进行了改良，包括（１）制胶方法改良；（２）增加水洗；（３）进行梯度酒精脱水。在上述改良过程中，我们用“灌胶”法在载玻片上制胶，替代了传统的使用磨砂载玻片上“三明治”制胶，解决了彗星实验中常见的脱胶现象，脱水后有利于获得平整胶面：在裂解后增加了水洗步骤，以消除裂解液中的高盐和去垢剂对后续实验操作的影响；采用直流稳压电源进行单细胞电泳，保证了实验结果的可重复性；对染色的条件进行了筛选，确定了使用ＥＢ作为细胞ＤＮＡ的荧光染料；以ＣＡＳＰ（免费）作为彗星图像的分析软件，建立了图像分析的方法。这些实验步骤的改良以及实验流程的优化或标准化．简化了操作程序，节省了时间，并使结果分析更加简便。 为了验证上述改良后的实验系统是否可靠，我们用紫外线作为损伤因子处理细胞，诱导细胞ＤＮＡ损伤，然后用彗星实验检测这一损伤。从这～阳性模型的结果分析来看，发现细胞损伤呈现出很好的时间依赖性，表明该实验系统的可靠性。我们同时筛选并评价了彗星实验中有关的ＤＮＡ损伤分析指标，发现ＴａｉｌＬｅｎｇｔｈ，ＣｏｍｅｔＬｅｎｇｔｈ，ＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ和ＯｌｉｖｅＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ作为ＤＮＡ损伤的评价指标比较可靠。 我们建立了肝细胞的组织块原代培养系统。在建立肝细胞组织块原代培养实验流程中，我们对实验的各个步骤，例如组织块贴壁需要的时间、细胞生长所需的培养基种类、培养基添加剂以及动物组织供体年龄等进行了筛选，建立了小鼠肝细胞组织块的原代培养系统。 我们用单细胞凝胶电泳方法对磁场和抗癌药物对人自血病细胞Ｋ５６２以及小鼠原代肝细胞的ＤＮＡ损伤进行了检测。结果发现，Ｋ５６２细胞在９ｍＴ稳恒磁场中处理１２ｈ即可引起细胞的ＤＮＡ损伤，这一损伤随处理时间的延长而增加，具有时间依赖效应；同样条件下对原代肝细胞的处理以及更长时间的处理（３６ｈ、４８ｈ、７２ｈ）均未发现细胞的ＤＮＡ损伤。在使用较低浓度紫杉醇（５０ｎｇ／ｍＬ）处理Ｋ５６２细胞１２ｈ后，即可导致细胞ＤＮＡ损伤，并表现出时间依赖效应，而仅在高浓度长时阳Ｊ的紫杉醇（８００ｎｇ／ｍＬ，２４ｈ）处理下才会引起肝细胞的ＤＮＡ损伤。８００９９／ｍＬ环磷酰胺处理Ｋ５６２细胞１２ｈ即可引起细胞的ＤＮＡ损伤，而在１２００９９／ｍＬ时方才引起肝细胞的ＤＮＡ损伤。 关键词：单细胞凝胶电泳；ＤＮＡ损伤：ＵＶ；细胞培养；磁场；抗癌药物
凝胶电泳实验报告模板
凝胶电泳实验报告模板
降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数，因此根据分子大小的不同、构成或形状的差异，以及所带的净电荷的多少，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基因呈离子状态从这种意义上讲，D N A 和RNA多核苷酸链可叫做多聚阴离子( Polyanions ) 。因此，当核酸分子被放置在电场中时，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖- 磷酸骨架结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型，分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA 分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。 聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 3.1 凝胶电泳的分类 按照分离物质来分凝胶电泳可以分为核酸凝胶电泳和蛋白质凝胶电泳；按照分离介质来分可以分为琼脂糖凝胶电泳技术和PAGE凝胶电泳。本次实验我们采用按介质的分类方法来学习的。 3.1.1琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他
凝胶电泳实验原理与步骤
一、实验目的 学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。 三、实验材料 实验14提取的DNA样品， 四、器具及药品 电泳仪，电泳槽，紫外透射反射仪，恒温水浴锅，微波炉，微量进样器，三羟甲基氨基甲烷，盐酸，醋酸钠，EDTA，琼脂糖，溴酚蓝，溴化乙锭。 五、实验步骤 1、安装电泳槽 将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。 2、琼脂糖凝胶的制备 称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，（按0.3-1.5%的琼脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝胶，20-100kb的DNA用0.5%的凝胶，200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶）置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化（不要加热至沸腾），取出摇匀。 3、灌胶 将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。 4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。 5、加样 将DNA样品与加样缓冲液按4：1混匀后，用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加10-20μl，记录样品的点样次序和加样量。 6、电泳 安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至3-5V/cm，电泳1-3hr，当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。 7、染色和观察 取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的位置，即为DNA条带，或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致癌剂，操作时要小心，必须戴手套。 附： ⑴5×TBE（tris-硼酸及EDTA）缓冲液的配制(1000ml)： Tris 54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA 20ml，将pH调到8.0，定容至1000ml，4℃冰箱保存，用时稀释10倍。 ⑵加样缓冲液的配制： 0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。 ⑶溴化乙锭的配制： 称取0.1g溴化乙锭，溶于10ml水，配成终浓度为10mg/ml的母液，4℃冰箱保存。染
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。 彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。 我最近做彗星实验，总是解决不了脱胶问题，要么是铺第二三层胶的时候第一层胶就松动，要么侥幸没动，在裂解、解旋、电泳、中和过程中都会出现胶脱落的现象，我愁死了，不知道是什么原因？我的步骤这样，请帮我分析分析好吗？ 1.5%正常熔点琼脂糖120微升乘热滴于磨砂载玻片上，盖玻片，4度20分钟，0.8%低熔点琼脂糖和 细胞混合液80微升，0.8%低熔点琼脂糖80微升铺第二、三层胶，裂解液和电泳液中和液都按配方来
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项 【实验原理】 大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显着地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。 【仪器、材料与试剂】 1. 制备DNA 样品所需材料 1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。 2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。 3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5% 4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。 5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。 6RNase(10mg/mL。
实验五--核酸琼脂糖凝胶电泳
实验五核酸琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本实验学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率也不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。但是EB具有致癌性，所以我们选用无毒，高灵敏度是Ex Green染料，。此核酸染料在紫外透照仪及可见光透射仪上均可使用。ExGreen外观呈红色，与核酸结合后，可用300 nm （紫外透射仪）激发。
三、材料、仪器和试剂 1、材料大肠杆菌中提取的质粒DNA 2、仪器电泳仪；台式离心机；恒温水浴锅；微波炉；紫外透射仪；照相机或者凝胶成像系统 3、试剂 （1）50×TAE电泳缓冲液：称取Tris 242g，EDTA 37.2g，加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解，加入57.1ml的醋酸，充分搅拌，加去离子水定容至1L，室温保存。 （2）6×电泳上样缓冲液：0.25%溴酚蓝、40%（W/V）蔗糖水溶液，贮存于4℃。 （3）溴化乙锭（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/mL。用铝箔或黑纸包裹容器，贮存于室温即可。 （4）分子量标准DNA：DNA Marker 四、操作步骤 1、制备1%琼脂糖凝胶(大胶用40ml，小胶用30ml)：称取0.7 g(0.5 g) 琼脂糖置于锥形瓶中，加入70 ml(50ml) 1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。 注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的 2、胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。在冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液中加入Ex Green染料（10ml:1ul），混匀后小
彗星实验
彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。 1 材料与方法 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；Triton X-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。其余生化试剂均为分析纯。电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.2，下载)；CO2培养箱：BB16HF型(上海力申科学仪器有限公司)；环地牌紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂)。 实验分组及UV处理 收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's 调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射 mW/cm2)。实验分为对照组和8个照射组，各照射组分别照射3、5、10、40，60、120、180、240 s，对照组不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。 细胞活性检测台盼蓝拒染法[10]即时检测经UV处理后K562细胞的活性。 彗星实验1988年Singh等[5]建立了碱性彗星实验，我们对该实验流程进行改良，首先改变了制胶方法，并在裂解后加入水洗的操作步骤，中和完成后