单细胞凝胶电泳(SCGE)技术

单细胞凝胶电泳（Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE）技术

单细胞凝胶电泳（SCGE），因其细胞电泳形状颇似彗星，又称彗星试验（Comet Assay）。它用于检测单个哺乳动物细胞DNA的损伤，与传统方法相比，因其快捷，灵敏，样品消耗少，费用较低，时至今日已广泛应用于各种有核细胞经受试因子作用后诱导出现的DNA损伤和修复的实验，成为遗传毒理学、氧化损伤、DNA交联损伤、放射生物学等领域中一项重要的研究工具。【1，2】近年来，国内关于这一方法的应用的报道日益增多【3～5】，可以预见，SCGE技术随着其方法的逐渐标准化，定将在今后得到更加广泛的应用。因此，本文拟就有关SCGE方法的产生、操作程序、影响因素等作一综述。

1.SCGE的诞生（DNA损伤检测方法的研究）

DNA损伤与修复是遗传毒理学及分子流行病学研究的一个重要目标，很久以前人们就在寻求一种合适的检测这一效应的方法。从使用DNA材料上分可将各种方法归为两类：（1）以裸DNA为材料检测，即通过去污剂、蛋白水解等方法去除附着于DNA上的其他细胞组分，分离出DNA；（2）以拟核为材料，即DNA构型（环区）保留于核骨架上，超螺旋结构不变。SCGE技术属于第二种方法，显然，拟核成分的检测较裸DNA要方便得多【6】。在此基础之上，早期的同位素示踪法因需提供同位素标记的样品，并预先确定合适的标记部位。为解决此不便，目前多采用直接检出DNA损伤后直接生成的单链断裂【7】。最初，Lett等应用碱性蔗糖梯度离心法测定DNA单链分子量，用于研究哺乳动物细胞的DNA损伤【8】。不久Kohn等又将其改进为更为灵敏的碱性洗脱法，成为一种较稳定的检测方法【9】。但是这些技术的灵敏度仍不能满足现在研究的要求，干扰因素多，同时要有放射性同位素示踪。1984年由Ostling和Johanson首先介绍的SCGE技术在这些方面得到了显著改善，特别在1988年经Singh等完善的单细胞碱性微板电泳技术后，本方法已成为检测单个细胞DNA单链断裂的首选方法【2】。

2.原理介绍

有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着于核基质中,当细胞被琼脂糖包埋时，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其他生物膜破坏，细胞内的RNA、蛋白质及其它成分即进入凝胶，继而扩散到裂解液中，唯独核DNA仍维持其环区附着于核骨架上，位置未发生迁移。当细胞为受损伤时，核DNA因分子量大，荧光染色后可呈现圆形荧光团，无拖尾现象。但在DNA单链有断裂时，由于碱性电泳液可使DNA双链解螺旋并碱变性为单链，此时单链断裂的碎片由于分子量小，即可进入凝胶中，在电泳时离开核基质向阳极迁移形成拖尾，形似彗尾。且拖尾愈长，在相同电泳条件下，表示受损的断片越多，断片也愈小，即为核DNA受损越重【13】。通过测定DNA迁移的部分的光密度或迁移长度就可以测定DNA损伤程度，从而确定作用因素的剂量与损伤效应间的关系。

3.操作程序【10】

3.1 凝胶的制备：准备0.5%的低融点琼脂糖和0.5%的正常融点琼脂糖（以无Ca2＋、Mg2＋的PBS溶液配制）。将90ul的正常融点的琼脂糖加到4℃的载玻片上，并立即加盖玻片，待胶凝固后，移下盖玻片，加入75ul混有1000个/10ul细胞的低融点琼脂糖，盖上盖玻片，将玻片放入4℃冰箱内使胶迅速凝固，取下盖玻片，加上75ul低融点的琼脂糖作为第三层。再盖上盖玻片，放入冰箱中，以上操作均在黄光下进行，以防止DNA损伤。

有关凝胶的制备在不同文献中方法有所差异，Schmezer【11】等曾有报道在玻片上预铺0.5ml 正常融点的琼脂后再待其凝固，刮净后进行以上操作可增强第二、三层胶的附着性。另外在

琼脂糖的加入量上个实验室亦有所不同，有待统一化。

3.2 细胞的处理

实验所需细胞悬液可由细胞培养或组织活检样品中获得，在加到凝胶中应达到（1～5）×10（4～6）/ml的细胞密度。通常以胎盼蓝拒染法测定。细胞存活率在95%以上者留用。由于胰酶消化及刮片等机械性分离亦有可能引起DNA损伤，故Singh【12】等推荐在玻片上贴壁培养单层细胞直接供测试用。根据不同实验目的，加受试物于培养液中。

3.3细胞的裂解

移去3.1 中的盖玻片，将胶板浸于新配制的预冷的4℃细胞裂解液中至少1h（宜放于4℃冰箱中，裂解液成分为2.5mol/L NaCl, 100mmol/L NaEDTA, 10mmol/L Tris－HCl,pH 10.0和1%肌氨酸钠，用前加1%Triton 和10%的DMSO）.

3.4DNA展开、电泳

轻轻取出裂解后玻片置于水平电泳槽内阳极端附近，玻片间不留空隙，用新配制的电泳液（含300mmol/L NaOH和1mmol/L Na2EDTA）完全盖过胶面。勿在凝胶上产生气泡。静置20min，待DNA充分展开后电泳（25V, 300mA）, 时间约20min。

3.5 中和、染色

电泳后取出玻片，用缓冲液（0.4mol/L Tris－HCl, pH7.5）将胶板浸没15min（以防碱液或去污剂干扰染色）或滴洗3次，每次5min。然后染色2～20min，以蒸馏水洗涤后尽快阅片（此步以上在黄光下进行，宜24h内阅片）。

3.5阅片、分析

放大250×于荧光显微镜下观察电泳图像，每片计数50个细胞，每组5张玻片。

4.影响SCGE结果的试验因素

4.1 染毒方式

对于DNA的损伤，有时需区分其为直接的DNA损伤及所致还是由在体内代谢活化后形成的间接损伤剂造成，Kasamatsu【14】提出一个SCGE的改进方案，使细胞在玻片上裂解后再行染毒，与常规方法相比，即可有效实现上述目的。另一方面，传统染毒方式对培养瓶的细胞而言，一个培养瓶的细胞只能做一个染毒浓度，造成大规模检测时的不便。因此，近年来又提出采用玻片上染毒的改良彗星试验，据称对SCGE的灵敏度有很大提高（约10倍），同时节约人力、时间等【15】。

4.2 裂解时间

如前所述，裂解时间目前至少应为1h，为探讨能否通过延长裂解时间已解决诸如因停电而被迫终止裂解等问题，有人通过平行对照分析了裂解时间的影响后发现，低于0.5h裂解时间时，低剂量DNA损伤剂即不能很好检出；而裂解时间超过24h，高剂量组DNA迁移不再增加而对照组细胞却出现明显迁移【16】。可见，裂解时间在1h以上是合适的。

4.3 电泳液成分

由SCGE的原理可知，电泳的同时，还需将双链DNA解螺旋变性，因此电泳液的PH 值对SCGE的结果影甚大，Klaude[17]等，曾对不同浓度NaOH的电泳液进行研究发现，为提高SCGE的灵敏度，可以提高电泳液NaOH的浓度，也可以通过加入NaCL以加速DNA 碎片的分离。适宜的NaOH浓度应在0.03mol/L左右，并加0.27mol/L NaCL。

4.4 电泳时间

电泳时间对DNA迁移影响也较大，Vijayalxmi[18]等研究发现，电泳时间在30分时，对照组基本不发生迁移，而受试组均有明显DNA迁移并有较好的剂量-效应关系，电泳时间延长时，DNA迁移的增加在低剂量组更明显，导致对照组均出现迁移同时受试物组DNA 迁移长度亦渐趋稳定而无法辨别。

5.前景展望