有关中性单细胞凝胶电泳的总结要点
单细胞凝胶电泳技术应用进展
又被称为“ 彗星电泳” ］ 细胞的生物膜在细胞裂解液的作用下被破坏， ［． ７ 使细胞内的 Ｄ Ａ 蛋白质及其 Ｎ 、 他成分进入凝胶， 继而扩散到裂解液中， 惟有核 Ｄ Ａ仍 附着在剩余的核骨架上而 留在原位 ． Ｎ 如果细胞 未受损伤， 电泳中核 Ｄ Ａ停留在核基质中， Ｎ 经荧光染色后呈现 圆形 的荧光团， 无拖尾现象 ． 若细胞受
到损伤， 在碱性电泳液（Ｈ＞１） Ｄ Ａ双链解螺旋且碱变性为单链， ｐ ３ 中， Ｎ 单链断裂的碎片离开核 Ｄ Ａ向 Ｎ 阳极迁移， 形成拖尾 ． 细胞核 Ｄ Ａ受损伤越严重， Ｎ 产生的断链或碱变性碎片就越多， 片断也越小， 电泳 表现为彗星尾越长和彗尾越亮［ ． ８ 通过荧光显微镜观察有无彗星及彗尾的长度、 】 亮度、 出尾率等， 判断
以研究活细胞 Ｄ Ａ的损伤， Ｎ 还可以研究死细胞的 Ｄ Ａ损伤， Ｎ 从而避免了只能用活细胞 （ 如染色体畸 变、 微核、 姐妹染色单体互换等） 的限制， 因而其对于建立动物模型深入探讨运动性氧应激与 Ｄ Ａ损伤 Ｎ 的分子生物学机制仍不失为一种优越的研究方法 ． 同时，Ｃ Ｅ技术也将为运动性疾病和运动性疲劳的早期诊断提供更有效 的实验方法和手段 ． ＳＧ 在 使用单细胞凝胶电泳技术在运动医学中的应用得 出结论 ：Ｃ Ｅ技术 由于需样品量少， Ｄ Ａ损伤检 ＳＧ 对 Ｎ 出的灵敏性高， 无需同位素标记， 技术简单、 费用低， 能够快速、 准确检测有害物质存在场所中各类人群 的 Ｄ Ａ损伤及筛检对 Ｄ Ａ损伤因素敏感的高危人群 ． Ｎ Ｎ
速、 低耗 等优 点 ， 因此被 广泛应 用在 Ｄ ＮＡ的损 伤与 修复 、 传 毒理 、 境监 测 以及氧 化 应 激和 细胞 凋亡 遗 环
等研 究中［１ ６．
１ 单细胞凝胶电泳技术原理
单细胞凝胶电泳检测外照射诱导DNA单链断裂和双链断裂
参 照 Ｂ ｎｔ ａａｈ等 的 方 法 ， 述 如 下 ： １ 正 常 熔 点 琼 脂 （ ． ％ ） ５ 简 （） ０ ５ ８ Ｌ均 匀 铺 在 磨 砂 载 玻 片 上 ， 取 ７ Ｌ含 约 １ 个 细 胞 的低 熔 点 琼 脂 （ ． ％ ） 匀 铺 在 正 常 熔 点 凝 胶 层 上 ， 于其 吸 ５ ０ ０７ 均 再 上铺 一 层 低 熔 点 琼 脂 凝 胶 ；２） 玻 片 浸 人 新 配 的 中性 裂 解 液 （ ｍｏ ＬＮａ Ｉ３ ｍｍｏ ＬＥ Ｔ （ 将 ２ ｌ Ｃ ，０ ／ ｌ Ｄ Ａ， ／
１ 材 料 和 方 法
１ １ 主 要 试 剂 和药 品 ．
正 常熔 点 琼 脂 糖 （ ＮＭＡ） 低 熔 点 琼 脂 糖 （ ＭＡ） ＤＭＳ Ｔ ｔｎｘ一 １ｏ及 溴 化 乙 锭 均 为 、 Ｌ 、 Ｏ、 ｒｏ ｉ ０ ＡＭＲ Ｓ Ｏ公 司 产 品 （ ＥＣ 由华 美 生物 工 程 公 司分 装 ） 。
１２ 重 要 仪 器 ．
Ｏ ＹＭＰ ＳＢ ６ Ｌ Ｕ Ｘ ０型 荧 光 显 微 镜 为 １本 株 式 会 社 产 品 ； Ｙ 一 Ⅱ型 电 泳 仪 （ 京 大 学 产 品 ）， ３ Ｄ 南 水 平 电泳 槽 （ 京 大 学 产 品 ） 南 。
１ ３ 实 验 动 物 ．
雄 性 昆 明 系 小 鼠购 于 苏 州 医 学 院 动 物 部 ， ６
细 胞 ， 射 线 照 射
中 图分 类 号 Ｒ８ １５ １ ．
Ｄ Ａ的损伤与修 复是放射生物 学 的重要研 究课 题 ， 其是 电离辐 射 所致 Ｄ Ａ单链 断裂 Ｎ 尤 Ｎ 和双链 断裂是决定受 照射细胞命 运 的关键 因素 之一 。早期 建 立 的检测 Ｄ Ａ单链 断裂 和双链 Ｎ 断 裂 方 法 灵 敏 度 较 低 ， 作 条 件 不 易 控 制 ， 获得 的结 果 反 映 了 群体 细 胞 ＤＮ 操 所 Ａ损 伤 效 应 ， 能 不 对 单 个 细胞 进 行 分 析 … 。近 年 来 由 Ｏｉ ｌ 等建 立 的 测 定 Ｄ Ａ 双链 断 裂 的 中性 微 凝 胶 电泳 技 ｌ ｅ２ ｖ Ｎ
单细胞凝胶电泳技术检测DNA损伤的方法及进展
单细胞凝胶电泳技术检测DNA损伤的方法及进展赵琳娜;陈薛钗;钟儒刚【摘要】The single cell gel electrophoresis is a common technology for the detection of DNA damage.It has the advantages of high sensitivity,economic,easy and fast.Nearly three decades,this technology is widely used in genetic toxicology,environmental monitoring,medical diagnostics and nutrition research.The single cell gel electrophoresis technique not only is capable of detecting DNA damage but also can detect DNA crosslinks,UV-induced pyrimidine dimers,oxidized bases and alkylation damage after joined fragmenting agent or specific endonuclease.Recently,single-cell gel was widely used in many fields by combining with fluorescence in situ hybridization.This article reviewed the conventional and unconventional single cell gel electrophoresis methods,and the prospects were also discussed.%单细胞凝胶电泳技术是一种常见的检测DNA损伤的技术,它具有灵敏度高、经济、简便、快速等优点.近30年来,这种技术被广泛地应用于遗传毒理、环境监测、医学诊断、营养研究上.单细胞凝胶电泳技术不单单能检测DNA断裂损伤,在加入断裂剂或者特异性内切酶后,可以检测到DNA交联和紫外线诱导的嘧啶二聚体,氧化碱基和烷基化损伤.近些年单细胞凝胶电泳与荧光原位杂交技术相结合后更是拓宽了它的应用范围,对常规和非常规的单细胞凝胶电泳技术及其操作方法进行了归纳总结,并讨论了它的发展前景.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2013(030)003【总页数】5页(P85-88,71)【关键词】单细胞凝胶电泳;DNA损伤;彗星电泳和荧光原位杂交技术联用【作者】赵琳娜;陈薛钗;钟儒刚【作者单位】北京工业大学生命科学与生物工程学院,北京100124;北京工业大学生命科学与生物工程学院,北京100124;北京工业大学生命科学与生物工程学院,北京100124【正文语种】中文【中图分类】Q503单细胞凝胶电泳技术( single cell gel electrophoresis， SCGE)又称“彗星电泳”(comet assay)，是一种常用的检测DNA损伤的技术。
单细胞凝胶电泳技术
单细胞凝胶电泳技术的试验步骤试剂及材料：1）0.01M PBS pH7.3：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.3，最后加蒸馏水定容至1L即可。
保存存于室温或4℃冰箱中。
2）0.8%正常熔点凝胶（PBS配制）3）0.6％低熔点凝胶（PBS配制）4）毛玻璃片5）盖玻片6）碱性裂解液（2.5mol/L NaCl;100mmol/L Na2EDTA;10mmol/L Tris;1%肌氨酸钠），临用前加10％DNMSO，1％Triton X-1007）电泳缓冲液（1mmol/L Na2EDTA;300mmol/L NaOH；Tris.Cl，pH7.5）8）EB（2ug/ml）步骤：1.制备第一层胶：100ml 0.8％正常熔点胶，加盖盖玻片，4℃固化10min；2.制备第二层胶：轻轻地去除盖玻片，在第一层胶上滴加75ul含1×10000个细胞的0.6％低熔点胶（cell 与凝胶比例为1：5），加盖盖玻片，4℃固化10min；3.裂解：去掉盖玻片，将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液内（临用前加10％DMAO，1％Triton X-100），4℃裂解1h；4.取出玻片，用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内，加入pH13的电泳缓冲液（没过玻片2-3min），放置20min（黑闭）。
5.电泳：电压20V，300mA，30min6.取出玻片，用PBS或Tris.Cl，pH7.5漂洗3次，每次3min；或双蒸水漂洗2次，每次5～15min，7.染色：胶上滴加3ulEB，加盖盖玻片，24h检测。
或者4℃，潮湿，闭光的条件下保有胶片，观察时再染色，镜检。
1.2.5 改良彗星试验操作步骤为节省实验时间，本研究将铺三层胶法改为铺一层胶法，同时在中和及染色等步骤进行了改良，具体操作如下:将已染毒的淋巴细胞悬液与40℃的1%低溶点琼脂糖等浓度混匀后，取70μl混合液直接滴加在磨毛玻片上，加盖玻片，4℃冷凝，20min后揭盖片;4℃于碱性裂解液中裂解1h;解旋20min;4℃电泳（25V，300mA）30min;中和5min;加碘化丙啶，暗处染色10min，加盖片;于莹光显微镜下镜检，照像。
单细胞凝胶电泳技术应用范围
单细胞凝胶电泳技术应用范围一、单细胞凝胶电泳技术简介单细胞凝胶电泳，也被称为SCGE或者彗星实验，是一种用于分析单个细胞DNA损伤的方法。
其基本原理是：当DNA在受到损伤时，其迁移率会增加，因此可以通过电泳检测其迁移距离。
这是一种灵敏的检测DNA损伤和DNA修复的生物技术。
二、应用领域1.生物学：在生物学研究中，单细胞凝胶电泳技术被广泛应用于研究DNA损伤和修复机制。
彗星实验能有效地检测细胞在受到环境压力或遗传影响下所受到的DNA损伤。
例如，研究者可以通过分析细胞受到紫外线和化学物质等诱导剂处理后的DNA损伤程度，来研究这些因素对细胞的影响。
2.生物医学：在生物医学领域，单细胞凝胶电泳技术被用于检测和诊断各种疾病，包括癌症和神经退行性疾病。
由于这些疾病的发生和发展常常伴随着DNA的损伤和突变，因此通过单细胞凝胶电泳技术可以有效地检测出这些变化。
3.基础生物学研究：基础生物学研究中，单细胞凝胶电泳技术用于揭示基因突变、DNA损伤修复、细胞凋亡等基础生物学过程。
例如，通过比较不同处理条件下细胞的DNA损伤程度，可以研究各种因素对细胞生存和死亡的影响。
三、技术优势与局限性单细胞凝胶电泳技术的优势在于其高灵敏度和特异性，可以检测单个细胞的DNA损伤。
然而，该技术也有一些局限性，例如对细胞的破坏性、实验操作复杂和结果解释主观等。
四、操作技巧与实验条件在进行单细胞凝胶电泳实验时，需要注意的关键技巧包括：选择合适的细胞、优化细胞裂解和电泳条件、准确测量和解释结果。
具体的实验条件包括细胞浓度、缓冲液成分、pH值、离子强度、温度等，这些都会影响实验结果。
对于具体的实验条件，可以参考相关文献或专业书籍进行设定。
五、数据处理与分析方法处理和分析单细胞凝胶电泳数据需要使用特定的软件和统计学方法。
通过分析DNA迁移的长度和形状，可以推断出DNA的损伤类型和程度。
同时，通过比较不同处理或不同种类的细胞之间的数据，可以深入了解各种因素对DNA 的影响。
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。
它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。
当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。
在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。
由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。
DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。
通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。
该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。
同时，这种技术只需要少量细胞。
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。
它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。
当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。
在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。
由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。
电泳知识点总结
电泳知识点总结一、电泳的原理电泳是利用带电粒子在电场中受到电场力的作用而运动的原理进行物质分离的技术。
电泳技术最基本的核心原理是利用生物分子（如DNA、RNA、蛋白质等）在电场中的电荷性质和电场力的作用而运动的原理进行物质分离。
当生物分子处于电场中时，带电粒子将受到电场力的作用，移动速度与带电粒子的电荷量和电场强度成正比，与溶液的粘度成反比。
电泳的原理可以简单概括为：根据生物分子（如DNA、RNA、蛋白质等）在电场中受到的电场力的作用而运动的速度不同而进行分离的原理。
常见的电泳分离包括凝胶电泳、毛细管电泳、等温点电泳等。
二、电泳的分类根据所使用的分离介质的不同，电泳可以分为凝胶电泳和毛细管电泳等不同类型。
1. 凝胶电泳凝胶电泳是指在凝胶（如琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中进行电泳分离的技术。
凝胶电泳通常用于对DNA、RNA、蛋白质等大分子生物分子进行分离和检测，其分辨率高、操作简便等特点。
凝胶电泳根据凝胶的性质和用途，可以分为琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖-聚丙烯酰胺双杂交凝胶电泳等多种类型。
2. 毛细管电泳毛细管电泳是指利用毛细管进行电泳分离的技术。
毛细管电泳通常用于对小分子药物、多肽、核酸等进行分离和检测，具有分辨率高、分析速度快、用样品量少等优点。
毛细管电泳根据毛细管的类型和使用的分析方法，可以分为毛细管凝胶电泳、毛细管等温点电泳、毛细管毛细管电泳、毛细管毛细管电泳等多种类型。
三、电泳的应用电泳技术广泛应用于生物学、生物化学、医学、食品安全等领域，是实验室中常用的分离和检测技术。
电泳技术的主要应用包括：1. 生物分子分离和检测电泳技术被广泛应用于对DNA、RNA、蛋白质等生物分子的分离和检测。
在分子生物学和生物化学实验室中，凝胶电泳被用于对DNA片段、PCR产物、蛋白质等的分离和检测，毛细管电泳被用于对小分子药物、多肽、核酸等的分离和检测。
2. 波谱分析电泳技术被用于质谱、荧光、放射性同位素等多种检测方法的联用，用于对生物分子的分离和检测。
单细胞凝胶电泳试验
单细胞凝胶电泳试验（一）原理单细胞凝胶电泳试验（single cell gel electrophoresis，SCGE）是近年来经过不断完善逐步发展起来的一种快速检测单细胞水平DNA损伤的新技术。
有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，SCGE 分析技术是先用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液的作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分外泄到凝胶中，随后扩散到细胞裂解液中，但核DNA仍保持缠绕的环区附着在剩余的核骨架上，并留在原位。
如果细胞未受损伤，电泳时，核DNA因其分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。
若细胞受损，在中性电泳液（pH=8.0）中，核DNA仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。
只有当DNA双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。
如果在碱性电泳液（pH>13）中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎片离开核DNA向阳性迁移，形成拖尾。
细胞DNA受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量也就越多，迁移的距离越长，表现为尾长的增加和尾部荧光强度的增强。
因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度可定量地测定单个细胞的DNA 损伤程度。
（二）仪器1．全磨砂载玻片2．1号盖玻片3．微量吸管和吸头4．冰盒5．电泳仪6．荧光显微镜（三）试剂1．正常熔点及低熔点琼脂糖。
2．细胞裂解液：2.5mol/L NaCl，100mmol/L NaEDTA，10mmol/L Tris-HCl，1％2肌氨酸钠，用NaOH调 pH值到10。
用前加1％Triton X-100和10％DMSO。
EDTA，300mmol/L NaOH 调pH到13。
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1、辐射生物剂量：此法适于照后短期内的剂量评价，中性条件优于碱性条件；旁观效应：查阅了许多国外文献，尚无此方法观察旁观效应的研究报道，所以我采用此方法观察了1Gy照后的旁观效应，试验今天上午刚刚结束，结果待分析，粗略看，此法对于旁观效应还是很敏感的，此法的优势在于成本低，操作比较简单。
低剂量照射的适应性反映：本实验室的一个相关课题刚刚结提，论文在法医学与特种医学版的军事医学子版已有上传，感兴趣的可以去看。
凋亡细胞的观察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮，用CASP软件分析后，其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。
我的一些教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低，否则，凋亡细胞中的DNA片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。
注：我用的是中性条件，20V，200mA,20min, 凋亡细胞观察宜选用10V,100mA,10min。
2、中性单细胞凝胶电泳步骤：（以淋巴细胞为例）1) 淋巴细胞的提取①取各组荷瘤鼠外周血0.2ml,肝素抗凝,加入到等体积淋巴细胞分离液上,3500r/min离心4min。
②取中间层淋巴细胞并加入PBS至5 ml, 1500r/min离心8min。
③重复洗涤细胞两次。
2) 琼脂糖玻片的制备①制好微型电泳槽。
②使用两层凝胶法,第一层为100μl 0.75%正常熔点琼脂糖凝胶, 第二层为75μl 0.75%低熔点琼脂糖凝胶和25μl淋巴细胞的混合液。
3) 细胞裂解、电泳①好的玻片浸入新配的预冷的(4ºC)中性裂解液中裂解1.5h。
②取出玻片,用双蒸水浸没漂洗。
③将玻片置于0.5%电泳液中先解旋20分钟，然后电泳20min,电压20V，电流200毫安。
4) 染色用溴化乙啶(2μg/ml)染色。
用双蒸水冲去多余染液，滤纸洗去多余水分。
5)读片和分析①用荧光显微镜(激发波长515-560nm)观察玻片,每张胶随机抓取100个慧星图像并用数码相机拍照后输入计算机储存。
②用CASP软件分析系统分析慧星图像。
3、biomed96 ：lq6688你好，本人也正要做这个实验，预实验做了两次，但什么都没看到，也不知道是什么问题，望指教。
铺3层胶，第一层100ul1％regular胶，50度烤干，第二层50000个细胞100ul0.5％低熔点胶，第三层100ul 0.5％低熔点胶。
裂解液：EDTA 100mM Nacl 2.5M Tris(10mM)pH10 1%TritonX-100 裂解1小时解旋液：EDTA1mM NaoH 300mM Ph>13 孵育20分钟。
电泳40分钟。
染色：PI 50ug/ml染色15分钟。
结果是什么都看不到，好像一点都没染色。
lq6688：首先，此试验的生物学原理目前还不是很清楚，Sighn和Olive这两个单细胞凝胶电泳的鼻祖首先提出的中性和碱性条件，中性条件检测双链断裂，而碱性条件检测单链断裂，有人曾提出这是为什么，我查阅了大量文献，国外文献没有具体的说明，国内文献更是人云亦云，所以，目前只能按照大家比较默认的：中性－－双链，碱性－－单链，这不是用软件来区分的，而是你的试验条件决定的，我看了您的裂解液ph10，所以检测结果应是单链断裂。
其次，您用的是三层三明治铺胶法，目前多数彗星试验已经少用此法，而是双层法甚至单层灌胶，有人担心双层或单层铺胶的脱胶问题，只要在凝胶的承载载体上做点文章，就解决了！我用的是双层铺胶法，我不知道您的第一层正常熔点胶为什么要烤干，是为了防治脱胶吗？我建议您采用双层法（卖瓜人不说自己的瓜苦，呵呵），这样在实验操作上可以节省时间，不必担心脱胶问题，我做了一年多了，自认为很成熟了，从来没有出现脱胶问题，（我不知道您用的凝胶承载体是什么？）。
第三，解旋20分钟应该没问题，但是我认为您的电泳时间过长，当然我不知道您的电泳条件（电压、电流、），我认为20分钟足够了，时间长了一是浪费时间，二是彗星图像不好，不利于分析。
第四，因为我用的EB染色，2ug/ml，效果很好，您用PI染色，我可能没有发言权，因为我不知道PI 的荧光激发光波长是多少，是否您的荧光条件不对？可以查查文献，这一点您对PI应该比我更了解吧。
第五，您的裂解时间有点短了，文献报道，最好不要少于1.5小时。
第六，我不知道您用的什么细胞，50000个细胞加入100ul0.5％低熔点胶，是不是细胞太多了，含细胞层的凝胶如果细胞密度过大，即使做出结果，彗星图像过于密集，头尾连接互相影响，无法分析。
一般100ul0.5％低熔点胶中含400个细胞就足够了。
还有一点，差点忘了，我刚刚做的时候，不会用荧光显微镜，大开了自然光源，其实荧光激发根本不用开自然光源，画蛇添足。
只要荧光光路通畅了，物镜会出现特殊的荧光，只要波片上有荧光染色的细胞，它肯定跑不了！biomed96：非常感谢lq6688 老师，您的建议很有用。
1.我用的是HepG2细胞，我是看了一篇文献，上面说最大可以达到50000个细胞，因为第一次做的时候一个细胞都没见到，我以为是细胞数过少，所以我就加大细胞：（根据您的指导，应该肯定可以排除这个可能性了。
2.关于电泳时间，我也是参考文献的，同时该篇文献上建议的电泳条件为15V 400mA,但我们实验室的电泳仪电流上不去，只能到100mA，不过参照您的成功经验，这样的条件已经是可以了的吧？3.我烤胶也是按照同一篇文献的：（主要也是为了防止脱胶的问题。
因为我开始也试过不烤胶，裂解后捞起来时确实出现了脱胶的问题，所以还得向您请教一下，每层胶铺上以后时怎么处理的？另外，我用的载体是普通的显微镜观察用的载玻片，不知道行不行？4.关于染色的问题，由于我们实验室这个实验做的不多，所以不敢用EB，怕污染了荧光显微镜，根据文献建议的几种燃料，我选择了PI，不过我现在想可能是浓度小了，昨天我上流式用PI单染时，用到了1mg/ml 出来结果很漂亮，下面我也会考虑加到PI浓度试一下。
不过也可能正如您的提示，我的裂解时间过短，我会首先拉长裂解时间看看的。
另外，我配的各种溶液成分是对的吧？5.关于单链，双链断裂的问题，因为我正是想通过这个实验看看我的样品对DNA的损伤情况，或者是说究竟有无损伤？（不知道我这要设计合不合理？敬请指正）如果这样可以的话，是不是我要分别做中性和碱性的实验，再进行判断？6.我观察细胞的时候是把自然光关掉的，所以应该不是这个问题。
关于数据分析的问题，是不是我用数码相机拍下了照片就可用CASP了？如果是就太好了，因为我正想去外边联系成像系统和分析软件呢。
所以还麻烦您提供下载的链接。
再次感谢lq6688 老师，希望您能继续指导我的实验。
lq6688：SCGE的实验条件尚缺乏标准化，去年曾在美国召开专门会议讨论SCGE的标准化，这都是有文献可查的。
您的列解液应该不是问题，只要能够把细胞膜和核膜列解就可以了，1%TritonX-100 应该是临用时加的吧，另外我还加了DMSO，也是临用时加的。
我觉得您完全可以作中性和碱性两种，这样您的结果就更完美了。
三层铺胶法在铺胶后都要加盖片的，目的是使胶平整，凝胶固化后移去盖片，再铺另一层，普通波片表面比较光滑，容易脱胶，文献多用毛玻璃片，应该好一点，但也不能完全避免脱胶，我是将普通波片稍加改良，在波片上人为作出两个小电泳槽，是用很窄的玻璃条封上的，这就看你的功夫了，不过这可是一劳永逸的事，不会脱胶。
作出的彗星图像用数码相机拍摄后转入计算机，然后就可以用CASP了，我想你的数码相机已经准备好了吧，我用的是NIKON 4500，可以和荧光显微镜配套的。
注意，CASP只读.tif扩展名的图像，如果你的相机拍摄的图像可以有.tif格式，就更好了，如果是.jpg格式，那还要在计算机中转换一下，不过很简单。
目前国外有很多SCGE的自动成像分析系统，不过，价格也不菲，还是自己用相机拍的好。
另外，我还是为你担心一个问题，100ul胶含50000个细胞，出来的彗星图像可能密度太大，每个图像都互相影响，将来无法用CASP分析，除非您的胶铺的很薄，不过，就我的经验，不会很薄吧。
下面就是CASP的链接，可以免费下载，使用也很简单，看看说明就可以了，祝你成功！4、qyt：我现在想问的是1.彗星试验的重复性好吗？2.不太明白彗星和流式的组合可以检测到什么？3.我做的是碱性，是不是一定加肌氨酸钠，因为不是很好溶解？4.裂解液，电泳液，中和液有没有必要新鲜配置，因为我的裂解液在冰箱中放置3天后会有结晶，但是加热后会溶解5.我也是按照三层胶铺的，不过每次总是会有脱胶的现象，搞得挺难受的。
6.验证试验的阳性对照应该选什么啊？7.不同的细胞的裂解时间应该不同吧，想问的是假如想评价药物，（兽药）应该选什么细胞比较合适啊？我现在做的是vero，不过是看了别人的文献决定的，想听听大家的意见很多问题，3Qlq6688：qyt战友，就我的经验，SCGE的重复性还是不错的，但要做到所有的试剂要同批配制，存放时间不要过长，如我的试验，宁愿累几天，也不要把战线拉的太长，前期准备工作可以按部就班，如（肿瘤接种、给药等），一旦用SCGE的时候，一定在较短时间完成，记得我最累的一天从8点上班，到晚上11点半才回家，中间利用一点时间吃饭。
因为裂解液时间长了会结晶，（浓度太高了），正如您所说的。
加热磁力搅拌器搅拌后，还可以溶解，但是，还是不宜久存的。
电泳液和PBS相对好一点。
呵呵，SCGE是一个比较年轻的方法，潜力还没有完全发掘出来，与其它技术结合是必然趋势，就拿血液病来说吧，CD分子已经发现了很多了吧，给药后，用某种药物处理，然后用流式把细胞提取出来，再做SCGE，结果可以看到哪种细胞对该药物敏感，有助于发现该药对哪类白血病敏感裂解液药新鲜配制，SCGE中最难配的是裂解液，每次做的时候都要最先配制，而且用加热磁力搅拌器不停搅拌，同时就可以干别的，完全溶解后再放入冰箱预冷。
您的脱胶问题和biomed96 战友一样，可以该一下凝胶载体，磨砂玻璃或自制微电泳槽，我用的自制微电泳槽，其实很简单，从不脱胶，另外SCGE 最好在避光条件下操作，避免额外DNA损伤。
阴性对照不必说了，阳性对照可以旋已知的对所研究药物（或同类药物）极度敏感的细胞，如国外文献报道，用共济失调－毛细血管扩张症患者的淋巴细胞做阳性对照观察辐射或UV对正常人淋巴细胞DNA的损伤作用。
不同细胞到底裂解多长时间我还没有看见相关文献，但有文献报道，一般裂解1.5～2小时即可。
您用的vero我不知道是什么药物？所以我不便发表意见，不过我觉得先用淋巴细胞比较合适。
当然还要看药物的靶细胞是什么。
qyt：谢谢回答，你那是不是有comet－FISH的资料啊，你能大概给我解释一下不？比如说方向，检测的目标，还有啊我做的是一个兽药的毒性评价，不象你们做的是人医的，不象你们那么复杂，呵呵不过对我的水平也就比较麻烦了。