生物制品复习资料

自然主动免疫指机体受到各种病原体隐性或显性感染后主动产生的特异性免疫。

自然被动免疫指机体经胎盘或初乳被动获得的特异性免疫。

根据作用分类

1、人工主动免疫用生物制品供预防用的疫苗、菌苗和类毒素。现在国际上把细菌、病毒、螺旋体、立克次体和类毒素等抗原性生物制品统称为疫苗。

2、人工被动免疫用生物制剂供治疗或紧急预防用的抗细菌、抗病毒、抗毒素血清及高免卵黄液。３、诊断液４、非特异性生物制剂及其它

免疫调节剂：（1）细胞因子：干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、红细胞生成素；（2）转移因子。

疫苗由病原微生物、寄生虫所制成的，用于人工自动免疫用的生物制品，接种机体后能产生自动免疫、预防疫病的一类生物制剂均称为疫苗。

单价苗：利用同一种微生物菌（毒）株或同一种微生物的单一血清型菌（毒）株的培养物所制备的疫苗。

多价疫苗：利用同一种微生物两种以上血清型菌（毒）株的培养物而制备的疫苗。多价苗能使免疫动物获得较为安全的保护，且可在不同地区使用。

多联苗：指利用不同种微生物的增殖培养物或其代谢产物，按免疫学原理、方法组合而成的疫苗。是一种一针防多病的生物制剂。

同源疫苗;指利用所要预防的传染病的病原体本身或其弱毒及无毒变种制成的疫苗，而又应用于同种类动物免疫预防的疫苗。如鸡瘟、猪瘟等。

异源疫苗;)利用具有共同性保护抗原的异种微生物所制成的疫苗。如

（3）基因工程苗①基因工程亚单位苗：指利用基因工程技术所构建的重组表达载体在高效表达系统中表达出来的强毒病原体的某种免疫原性成分而制成的疫苗。②基因缺失苗或突变苗) ：利用基因工程技术，在DNA水平上造成毒力有关基因的缺失或突变，即切去基因组中编码致病性物质的某一片段核苷酸序列或使其突变失活，使该微生物致病性丧失，但仍保持其免疫原性及复制能力。③基因工程活载体疫苗：将病原体的保护性Ag基因片段插入到活载体病毒或细菌的基因非必需区内而获得重组活载体疫苗。④DNA疫苗：又称核酸疫苗，是应用基因工程技术将编码某种抗原蛋白质的外源基因与载体重组后直接导入动物体内，利用免疫原基因在宿主体内表达出的抗原蛋白质引起机体的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。2、类毒素(：又称脱毒毒素，细胞在生长繁殖过程中所产生的外毒素，经化学药品（如0.3-0.4%甲醛）处理后，成为无毒性而保留其免疫原性的生物制剂。

3、诊断制品：利用微生物，寄生虫及其代谢产物或者含有特异性抗体的血清制成的生物制剂，用于传染病或寄生虫的诊断、群体检疫、检测免疫状态以病原体的鉴定。

诊断液包括两大类：(１)诊断抗原（２）诊断血清：是应用已知的Ab制剂去检测未知的Ag。包括一般的阳性血清、单克隆抗体、荧光抗体、酶标抗体及各种因子血清等诊断制剂。

4、抗病血清(antiserum): 又称高免血清，为含有高效价特异性抗体的血清制剂。

即动物经反复多次地免疫后，机体的体液尤其是血清中就产生大量抗此中抗原的抗体，采取次此种动物的血液分离所得血清，即为高免血清、免疫血清、抗血清。

疫苗生产的根本菌种--培养--灭活--配苗--分装--检验--临床应用

1.毒力鉴定凡用作制备灭活苗和效力检验攻毒用的强毒菌种，需要确定其对本动物及实验动物的致死剂量；弱毒菌种必须明确其致死和不致死实验动物的范围及对被接种动物的安全程度。

2.免疫原性鉴定将菌(毒）种制疫苗免疫实验动物，经1-3周后攻毒，观察其保护情况。

3.稳定性试验通过传代培养鉴定其毒力稳定与否。细菌20-30代，病毒10代以上。

一、细菌的规模化培养1、固体培养基表面培养法：属于手工操作。一般将种子液均匀地接种于固体培养基表面（平皿、大扁瓶），平放于室温内进行静置培养，培养完后弃去凝集水，收集菌落、菌苔制成混悬液。用于制备诊断抗原和疫苗，此法可根据需要调节细菌浓度，但产量受限制，且劳动强度大。2、液体静置培养法：此法适用于一般菌苗的生产。培养容器可用大玻璃瓶，也可用一般发酵罐。按容器的深度加入1/2-2/3的培养基，灭菌后接种种子液1%-2%，在一定温度下静止培养。厌氧培养时培养基加入约70%，并在灭菌后冷却至37℃，立即接种种子液，在厌氧条件下培养本法简便、但细菌浓度不高。

3、液体深层通气培养法：又称反应罐通气培养。本法能加速细菌的生长繁殖，提高菌苗的产量和浓度，缩短培养时间，适宜于大量的培养，是目前菌苗生产的主要方法。应注意：

?①补充营养物质：根据不同细菌的营养要求，在培养过程中，要适量补充营养物质，添加葡萄糖补充碳源；添加蛋白胨补充氮源，这样才能更好地发挥通气培养作用，增加菌数。?②通气供氧：通气量必需适当，对要培养的细菌特性，必须要预先进行测量，掌握一定的规律，再进行大量培养。空气中的氧是通过溶氧状态供细菌利用的，而氧容量与通气量、通气方式、搅拌装置和速度、温度等有关系，另外，不同细菌在不同的生长时期其需氧量也不相同，故必需预先测定，掌握最佳的通气量。通气量过大，不能增加氧容量，反而会增加消泡剂的用量。③控制最适生长的PH：④通入气体必须是无菌的：

?4、透析培养法：指培养液与培养基之间隔一层半透膜的培养方法。

这种透析膜只允许小分子量的营养成分透过，而不允许大分子的细菌或毒素通过，因此可使培养基中高浓度的营养物质通过透析膜扩散到接种有细菌的培养室内，使细菌在生长过程中，不断获得必需的营养物质。因此，该法可获得高浓度的细菌或毒素。

二、病毒的培养（一）动物培养法（二）禽胚培养法（三）细胞培养法

SPF 动物(specific pathogen-free animals, SPF),无特定病原体动物，指在一个动物群中，不存在某些特定的病原微生物和寄生虫的动物。接种途径：常用的途径有尿囊腔：9－11日龄

绒毛尿囊膜：11－13日龄卵黄囊：6－9日龄羊膜腔：10－12日龄

（三）细胞培养（２）细胞培养的方法

①静置培养将细胞悬液接入培养瓶或培养板中置温箱内静置培养，细胞贴壁生长繁殖成单层后即可接毒②转瓶培养将细胞悬液接入转瓶后置于细胞转瓶机上进行培养，使贴壁细胞不始终浸于培养液中，从而有利于细胞呼吸和物质交换而加速细胞的生长。③悬浮培养通过振荡或转动装置使细胞始终分散悬浮于培养液内的培养方法。④微载体以细小的微载体颗粒作为细胞载体，通过搅拌悬浮于培养液内，使细胞在微载体表面长成单层的一种细胞培养技术。该方法扩大了细胞的附着面，能充分利用生长空间和营养液，因此大大提高了细胞的生长效率和产量。培养时多在发酵罐中进行，兼有单层和悬浮培养的优点。

3、细胞的制备抗原液的培养→灭活→浓缩（稀释）→与佐剂配苗→分装→检验

一、抗原液的培养1、细菌的培养菌种=>> 种子培养（纯粹检查、活菌计数）=>>>种子液=>>> 菌液培养2、病毒的培养动物培养法→组织灭活细胞培养法→细胞灭活苗鸡胚培养法→鸡胚灭活苗

二、灭活1、定义指破坏或杀灭微生物使其成为无生命物质的过程，即破坏微生物的生物学活性、繁殖能力及致病性，但尽可能保留其免疫原性。

（1）甲醛：占95%。甲醛为无色气体，易溶于水和乙醇，36-40%的水溶液称福尔马林，为无色液体，有刺激性气味。

其作用机制——甲醛的醛基作用于蛋白质的氨基、酰氨基及核酸上的嘌呤或嘧啶上的非氢键结合的氨基而形成交联，使微生物结构发生轻微的改变，但不影响其抗原性。

甲醛的常用浓度：一般需氧细菌：0.1－0.2%，最大达0.8%厌氧细菌：0.4－0.5%类毒素：0.4% 病毒：0.05－0.1%作用温度、时间为：37－38℃１６－24h。：猪肺疫：0.1% 37－38℃7－12h;气肿疽：0.5% 37－38℃72－96h;破伤风类毒素：0.4% 37－38℃21－31天。（2）烷化剂：如乙酰基乙烯亚胺、二乙烯亚胺。主要是烷化ＤＮＡ分子中的鸟嘌呤或腺嘧啶，引起单链断裂或双螺旋链交联，从而改变ＤＮＡ的结构而破坏其功能。

（3）苯酚（石炭酸）：使微生物蛋白质变性，抑制如氧化酶、脱氨酶等特异酶系统而使其失去活性（4）结晶紫：结晶紫表面的阳离子与微生物蛋白质带阴电荷的羧基形成弱电离的化合物，妨碍了微生物的正常代谢，也可能干扰了微生物的氧化还原作用而使微生物灭活。

（５）β－丙烯内酯（BPL）：破坏病毒的核酸芯髓，但不损害衣壳蛋白，因此保护抗原成分得以保留。

几种灭活疫苗的灭活方法：

疫苗菌（毒）灭活方法

猪丹毒菌苗猪丹毒杆菌甲醛0.2~0.25% 37℃18~24 h

猪肺疫菌苗巴氏杆菌甲醛0.1 % 37℃7~12 h

羊链球菌苗羊链球菌甲醛0. 3% 37℃16~24 h

气肿疽菌苗气肿疽梭菌甲醛0. 5% 37~38℃72~96 h

、影响灭活剂作用的因素：

（1）温度：温度越高，灭活越快，但温度超过40℃或更高，对微生物的抗原性将有影响。故一般为３７℃。

（2）浓度：灭活剂浓度——越高，时间越短，但抗原的损失量也越大。

（3）PH：微酸性时，灭活速度慢，抗原性保持好。

微碱性时，灭活速度快，抗原性易损害。

（4）微生物种类及特性：

通常以用量小、处理时间短而又能达到彻底灭活的目的为原则。

*浓缩：最常应用的方法是Aｌ(OH)3胶沉降法：

5份细菌液+1份铝胶，室温2-4天，弃去上清液1/3

其次中空纤维超滤系统离心沉降法等。

1、佐剂（Adjuvant）：凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物质均称为佐剂,也称免疫佐剂（Immunologic adjuvant）。

佐剂本身一般不具有免疫原性，但与抗原物质合并使用时，能增强抗原物质的免疫原性，或者改变动物免疫应答类型。

2、佐剂必须具备的条件

（1）无致癌性或者是辅助致癌物质：不能促进肿瘤的形成。

（2）无毒性：通过肌肉、皮下、静脉、腹腔、滴鼻、口服对生命安全。

（3）化学纯：杂质是副作用的诱发剂。

（4）吸附力强：要有一定的吸附力。

（5）易于吸收：易被机体吸收，不宜长时期留存而诱发组织损伤。

（6）不含有与人体或动物体有交叉反应的抗原物质。

（7）不应与血清抗体结合而形成有害的免疫复合物。

（8）经1-2年保存应当稳定不变质等。

3、佐剂的种类：根据在体内的存留时间分类：

*（1）储存型佐剂：佐剂与抗原混合成混浊状态，使其尽可能存留于注射局部，以便使抗原能够缓慢地、持续地刺激机体免疫系统。

A、不溶性盐类佐剂：Al（OH）3、AlPO4、明矾等。

B、油性佐剂：弗氏完全和不完全佐剂，矿物油、植物油等。

*（2）非储存型佐剂：可不与抗原混合，在相互隔开的部位分别注射，即可与Ag一同对免疫系统细胞发挥增强免疫效应，提高免疫力的一类佐剂。

A、微生物及其组成成分：分支杆菌、百日咳杆菌、肠道杆菌的内毒素、胞壁酰二肽、脂多糖、酵母多糖、香菇多糖等。

B、非微生物类：表面活性剂，如Span80、Tween-80、硬脂酸铝；核酸及其衍生物，如DNA、PolyA:U、免疫刺激序列DNA(CpG DNA)等；细胞因子类；某些药物，如左旋咪唑等。

*4、作用机理

①在接种部位组织内形成Ag贮存库，使Ag缓慢降解和释放。

②增加Ag分子的表面积，提高Ag的免疫原性；同时，有助于抗原性物质在细胞内被加工，被MHC分子特异性地结合、保护、运输并递呈给效应细胞，从而提高抗原递呈效果。

③诱导各种CK因子的释放，提高免疫调节功能。

黏度检验：应用毛细管粘度计进行，为简便可用1mL吸管（内径1.2mm）在室温下吸取1mL 疫苗，垂直放0.4mL不超过10秒为适宜。

稳定性检验：于离心管内3000转/分离心15分，不分层、不破乳，可保存1年以上不破乳

２．冻干程序空箱降温产品分装→装箱→预冻3-4h（-40℃）→抽真空至13.33Pa以上→加温干燥①升华干燥阶段(30Pa以下)→②解吸干燥阶段（15-30Pa）→加塞压盖

（1）预冻冷冻干燥之前，先将溶液物质在低温（-40℃以下）下冻结，称为预冻。其目的是为了固定产品，以便在真空下进行升华。

（2）加温干燥：经预冻后即进入真空干燥阶段。该过程分两个阶段。

①升华干燥阶段：加温使制品温度达到共熔点温度，在共熔点温度下将冻结物质中的水分除去的过程称为升华，即升华干燥阶段。

*共熔点：溶液和混悬液随温度降低而发生凝固冻结，当达到全部冻结时的温度称凝固点。物质的凝固点也就是该物质的熔化点，故又称此温度为共熔点．

共熔点的意义：升华的产品若低于共熔点温度过多，则升华的速度降低，升华阶段的时间会延长；若高于共熔点温度，则产品会发生熔化，在真空下使制品鼓泡、甚至冒出瓶外，干燥后的产品将发生体积缩小，出现气泡，颜色加深，溶解困难等现象。

共熔点的测定：根据导电溶液的电阻与温度相关，当温度降低时电阻增大，当降到共熔点时电阻即出现突然增大现象，此时的温度即是该溶液的共熔点。

②解吸干燥阶段：使与物质结合的水分子通过加热方式除去的过程称为解吸干燥。

(三)冻干保护剂又称稳定剂（stabilizer）,是指一类能防止生物活性物质在冻干及保存过程中免受破坏的物质。

保护剂通常由营养液、赋形剂和抗氧化剂三类物质组成，并由此三类物质组合成适用于各种生物制品的的各种类型的冻干保护剂。

2．冻干保护剂的作用机制①防止活性物质失去结构水及阻止结构水形成结晶而导致生物活性物质的损伤；②降低细胞内外的渗透压差，防止细胞内结构水结晶，以保持细胞的活力；

1、高免血清

①制备抗菌、抗毒素血清多用异种动物——异源抗病血清。通常用马、牛等大动物制备，如破抗多用青年马、猪丹毒抗血清多用牛。②制备抗病毒血清多用同种动物——同源抗病血清。免疫程序①基础免疫：一般先用弱毒苗/灭活苗按预防剂量进行首次免疫，经7天／2周左右再用倍量同种疫苗进行二免，即完成基础免疫。有时还需进行3次以上的免疫。

*抗原勿需过强过多，以为高度免疫产生有效的回忆应答反应打下良好的基础．

*②强化免疫：基础免疫后2-３周左右开始进行高度免疫，注射Ag多为强毒，免疫原性良好，免疫剂量逐渐增加，免疫次数视血清抗体效价而定，一般1-2次。但有时需经过多次注射。每次注射强毒、Ag间隔时间为5-7天。

健康动物===(弱毒苗/灭活苗)→首免（常规剂量）→二免（倍量同种疫苗）→高度免疫（强毒或灭活疫苗）

2、高免卵黄液的制备

首免（IBD油苗1ml/只10天后）→二免（IBD油苗２ml/只１０天后）→三免囊（毒液2ml/只或油苗3-4ml/只10天后）→检验，AGP效价达1:64-128时→收蛋→ND －IBD二价高免卵黄液的制备

*程序２：

首免（10-15个免疫剂量的IBD、ND弱毒苗，注射７－1０天后

）→二免（同样剂量的弱毒疫苗接种，同时注射IBD、ND油苗，2ml/只注射７－1０天后）→三免（IBD、ND二联油苗４ml/只1０天后）→检验，IBD AGP效价达1:64-128；ND HI效价达11㏒2以上时→收蛋

→当IBD AGP效价低于1:６４、ND HI效价低于10㏒2时，再强化免疫

*３、高免蛋的处理

高免蛋清洗、消毒→打开鸡蛋、弃去蛋清，分离蛋黄→根据AGP效价加入适量生理盐水进行稀释（成品效价不低于1：32）→加入SP各1000ul/ug/ml→充分搅拌混合→分装冻存或0-4℃贮存。

免疫球蛋白（IgG)的制备

* 1.盐析法硫酸铵分段沉淀法

蛋白质在不同盐浓度的溶液中其溶解度不一样。蛋白质分子量越大沉淀所需盐浓度越低。在pH7.0时:

50％硫酸铵: 所有的免疫球蛋白都可沉淀；

33％硫酸铵: 大部分IgG可沉淀出来；

40％硫酸铵: 沉淀物的得率最高，但含IgM、IgA等β球蛋白部分增多。

因此常用33％饱和度的硫酸铵提取血清中的IgG。

* 2.离子交换层析技术

蛋白质的电荷状态可以随着缓冲液pH的改变而改变，当pH7以上时，大多蛋白质带负电荷，而DEAE-纤维素带正电荷，当血清通过DEAE-纤维素柱时，蛋白质即借静电吸附在纤维素柱上。

但不同蛋白质的等电点不同、荷电不同、分子大小不同，与交换剂结合强度不同，因此可利用不同的洗脱条件将蛋白质分开。

IgG ，IgM，IgA的等电点分别为pH 8.0、7.0、7.4。

在pH8.0时，IgG不带电荷，不能被DEAE-纤维素（带正电）吸附而被洗脱下来。故应用pH8.0的Tris-HCl作为洗脱液。

被DEAE-纤维素吸附的其它球蛋白，可用逐渐增加洗脱液中盐离子的浓度或降低pH的方法将其逐一洗脱

诊断用生物制品定义：利用微生物及其代谢产物以及动物的血清和组织材料制成的，专门用于血清学诊断和变态反应的生物制品，称为诊断用生物制品或诊断液。

*目前常有：诊断抗原、诊断抗体、标记抗体等。

*基本要求：特异性和敏感性。

一、诊断抗原

（一）血清学反应抗原应用已知微生物或其浸出物、代谢产物制成的用于检测血清中相应抗体的生物制剂。常用的有凝集反应抗原、沉淀反应抗原、补体结合反应抗原。

１．凝集反应抗原颗粒性抗原，如细菌、红细胞等，在有电解质存在的情况下，与特异性抗体结合形成肉眼可见的凝集现象。

（２）间接凝集反应抗原２、沉淀反应抗原沉淀反应抗原为胶体状态的可溶性抗原，如细菌和寄生虫的浸出液、培养滤液、组织浸出液、动物血清等，与抗体结合，在适量电解质存在下，经一定时间聚合成可见沉淀物。3、补体结合反应抗原（1）补体结合反应抗原原理：

*补体结合反应是可溶性抗原与相应抗体结合后，可以再结合补体，但这一反应不能被肉眼观察到，可加入红细胞及其抗体（溶血素），根据是否溶血来判定反应系统是否存在相应抗原抗体，如红细胞不溶解说明存在相应的抗原抗体，为阳性反应；如溶血则说明不存在相应的抗原抗体，为阴性反应。

单克隆抗体由一个B细胞克隆分化增殖的子代细胞所产生的针对单一抗原决定簇的抗体；或者说是由一个只识别某种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体，称为单克隆抗体（moncolonal