4第四章同工酶

2.体内杂交
同种或异种动物或植物同一种同工酶的亚基体外虽然均 能杂交，但在体内并非如此。 例如:ALD-A4和ALD-B4可在大鼠肾脏中形成A3B，A2B2， AB3三种杂交体，但是鸡肾中有A、B、C三种亚基，其中 A-B、A-C可以杂交，却无B-C杂交体。
同工酶亚基杂交体的组织特异性原因:
(1)亚基基因在某些组织表达的不完全性 ALD鼠肾中不能表达C亚基，只能表达A和B亚基，因此 鼠肾中不会出现A-C杂交体；而在鼠脑中不表达B亚基， 鼠脑中也没有A-B杂交体。 (2)能在同一细胞中合成，但却在不同的亚基细胞中合成
氨基酸残 基 Lys His Arg Cys Asp(Asn) Thr Ser Glu(Gln) Pro Gly Ala Val Met Ile Leu Tyr Phe Trp 总计 兔醛缩酶(ALD) A型 B型 C型 27 28 19 11 9 7 14 15 14 8 8 6 30 35 34 20 21 17 19 17 20 41 41 37 19 17 18 31 29 29 44 38 39 21 25 25 3 6 3 19 20 17 35 36 31 11 10 9 7 11 9 3 14 3 366 357 337 大鼠丙酮酸激酶(PK) L型 R型 M型 K型 22 24 39 39 11 11 12 12 40 37 33 32 6 6 9 10 37 37 49 49 26 26 23 27 35 34 27 27 59 61 51 52 27 31 29 22 44 44 41 42 58 57 61 60 51 49 46 48 14 15 18 16 40 36 36 39 50 48 45 43 9 9 10 10 17 18 16 16 4 5 2 3 549 548 547 547
猪的LDH-B有331个氨基酸残基，LDH-A有329个氨基 酸残基。A与B两亚基居然75%的同一性，尤其活性中 心附近接近辅酶或底物的各氨基酸残基十分类似。
LDH酶蛋白与NAD+结合的主要相互作用关系示意图
Lys250
NH2
N
N N Val132 Val247
+
NH3+ O
Tyr85-ph-OH
第一节 同工酶的结构基础
一、同工酶一级ห้องสมุดไป่ตู้构差异 二、构象变化造成同工酶的差异 三、同工酶亚基的杂交
第二节 同工酶与基因
一、单基因决定的同工酶 二、多基因决定的同工酶 三、修饰同工酶
一、几种常用分离和测定同工酶的方法 二、同工酶类型的鉴别
第三节 同工酶的分离、纯化及鉴定
第四节 同工酶的应用
一、同工酶与临床诊断 二、遗传与进化中的同工酶 三、同工酶与代谢调节 四、癌瘤状态下同工酶改变的生物学意义
第五章 同工酶
同工酶(isozyme):1895年，Fischer(德)等提出， 指不同种类、不同器官和组织起源的酶可作用于 同一种底物，催化相同化学反应，但其性质可以 不尽相同的一类酶。 同工酶测定不但有助于临床诊断，也是研究代谢 调节、分子遗传、生物进化、个体发育、细胞分 化和癌变的有力工具，在分子生物学、分子酶学、 临床医学中均占有重要地位。
(L亚基和M亚基均约60,000) (A亚基:40,000,C亚基:37,000)
L、R、M、K PK-L4 PK-L3R PK-L2R2 PK-R4 PK-L3K PK-L2K2 PK-LK4 PK-M4(M1) PK-K4(M2) PK无RM和RK亚基杂交体
ALD和PK同工酶氨基酸组成(残基/亚基)
链接烟酰胺核糖
烟酰胺
链接于腺 嘌呤核苷
27 29 52 57
Gly Gly Asp Lys
Gly Gly Asp Lys
酶蛋白上残基接 近底物部位
二、构象变化造成同工酶的差异
一级结构相同的同工酶，可以存在不同的构象，形成的 异构体称为构象同分异构体(comformational isomer或 comformer)。这种同分异构体之间是可互变的，故称为 互变性同工酶(interconvertible isozyme)。 牛胰核糖核酸酶变性作用 8mol urea and -mercaptoehanol
同工酶与基因的关系可总结为下图：
基因位点的多样化 变异发生在无 关基因位点上 形成不同氨基 酸顺序的单体 酶生化特性不 同但有类似的 功能如多种蛋 白酶 进化过程中基 因发生变异 单体有别但氨 基酸序裂类似 酶在一些特性 上不同但保留 相同功能,如 LDH和PGM 通过杂交形成 更为复杂的同 工酶 等位基因的 多样化 在同一基因的某 一位点发生变异 形成的亚基往 往仅有个别氨 基酸差异 酶在大多数性 质上都一致如 腺苷脱氨酶等
另外，两种电泳速度不同的同工酶如果其中一个和带电的 小分子结合，其电泳速度可能恰巧和另一种同工酶相等， 则两种同工酶在电泳结后的显带中出现在同一区带中，表 现一种同工酶，故不能单凭电泳结果鉴定是否同工酶。
2.层析 分子筛层析: 分辨率低，一般主要在分离纯化的后阶段，用于分子量测定。
第一节 同工酶的结构基础
同工酶能催化相同的反应，是因为其活性中心的结构有类 同之处，而物理特性、催化性质以及免疫特性的区别，则 是由于分子组成和结构上有一定差异。 一、同工酶一级结构差异 同工酶一级结构上的差异大至分三种情况: 1.分子量不同，氨基酸组成相差悬殊 同工酶名称 存在部位 种类 分子量 半乳糖苷转 细胞膜上 Ⅰ 移酶同工酶 Ⅱ 54 000 76 000 组成及性质差异 氨基酸、含糖量 电泳行为、底物 特异性、动力学 参数
Val27Val52 Val54Ile96 Ala99Ile119 Ile123
N
O
Val132 Thr97 O Pro139
=
C-NH2
CH2
O
CH2-O－P－O－P-O-CH2
OO-
A环位于疏 水性口袋中
Asp53
OH OH
Lys58
= Asp30和Lys58
=
O
N
-OOC-
Glu140
Arg101 OH
第三节 同工酶的分离、纯化及鉴定
常用方法: 先从组织或细胞中抽提，然后根据同工酶表面电荷、分 子量、等电点、耐热性、动力学和免疫性质的差别逐步 予以分离。 一、几种常用分离和测定同工酶的方法 1.电泳 PAGE: 分辨率高，技术较易掌握，但具有毒副作用。 淀粉凝胶电泳: 分辨率较低，但无毒副作用，环保。 等电聚焦电泳: 分辨率很高，且能把一级结构相同而空间结构不同的同 工酶分离；但造价昂贵，费时，技术难度较大，重复性 较差。
下面的实验证明了同工酶构象同分异构体的存在：
鸡线粒体中的MDHm(苹果酸脱氢酶) 胍 +I(碘) MDHm (酶分子并无碘化) MDHm (变性失活)
透析去除胍
MDHm (复性)
电泳速度、旋光色散改变 说明构象改变(活性没有改变)
电泳速度没变但是热稳定性改变 说明构象改变(活性没有改变)
三、同工酶亚基的杂交
酶蛋白上残基 残基 接近辅酶的部位 顺序
NAD(H)的焦磷酸 39 57 98 100 244 31 96 99 138 31 137 139 166 245 249 108 170 194
A亚基 B亚基
Ala Lys Gly Arg Tyr Val Thr Ala Ser Val Val Asn Leu Thr Ile Arg Arg Arg Gln Lys Gly Arg Tyr Val Thr Ala Ser Val Val Asn Leu Thr Ile Arg Arg Arg
缺陷:
电泳法分离的不一定是同工酶，酶带的数目也不一定代 表同工酶的数目。 原因有二:
某些同工酶可与电泳介质中的带电物质结合，改变其分子 大小及电荷，从而改变泳速。例如LDH可与血清中的IgA 或IgG结合形成相对分子量从3×103～1 000×103,等电点 从pH6.3～7.2的各条带。这些条带都不是同工酶本身，实 际上可能只是一种同工酶而已。
3.分子量接近，氨基酸组成类似，水解后肽谱近似，但 免疫性质不同。 例如 乳酸脱氢酶(LDH) A(M)亚基B(H)亚基 分子量约为35,000 M与H亚基免疫性质不同 醛缩酶(ALD) A亚基和B亚基 分子量约为40,000 A与B亚基免疫性质不同
LDH是目前研究最清楚、最深入的一组同工酶，猪、鸡 和狗鱼的A亚基的一级结构均已阐明。
2.分子量接近，但氨基酸组成、水解肽谱、免疫性质不同
亚基及酶的亚基组成举例
兔醛缩酶(ALD) 亚基类型 A、B、C 同工酶种类 ALD-A4 ALD-A3B ALD-A2B2 ALD-AB3 ALD-B4 ALD-A3C ALD-A2C2 ALD-AC3 ALD-C4 ALD无BC亚基杂交体 大鼠丙酮酸激酶(PK)
同工酶数目I = (n+s-1)! n!(s-1)! n—同工酶的亚基数目 s—可杂交的亚基种类数目
同工酶数目I =
(n+s-1)! n!(s-1)!
n—同工酶的亚基数目 s—可杂交的亚基种类数目
例题:某种同工酶为四聚体，有三种不同的亚基均能杂交， 问杂交后形成的同工酶种类有多少？ 解: (4+3－1)!/4!(3－1)!=15 其中12种为杂交体，3种为纯聚体。
OH
Ala98和Glu140 CO－NH(肽链)
酶蛋白接近 残基 辅酶的部位 顺序 NAD(H)的 26 腺嘌呤 51
52 53 54 84 95 97 118 122
A亚基 B亚基
Val Val Asp Val Met Tyr Ile Ala Ile Ile Val Val Asp Ala Leu Tyr Val Ala Val Ile
Harris统计了100种同工酶，发现单亚基的占30%，多亚基 占70%。多亚基同工酶中双亚基占43%；三亚基占4%， 四亚基占24%。 高离子强度的介质中反复冻融 或调节溶液的pH值 解聚 同工酶(多亚基) 单体 重组聚合 1.体外杂交 异源同种同工酶单体之间可以杂交形成杂种同工酶